EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL GLUCÓGENO TISULAR

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1 EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL GLUCÓGENO TISULAR Objetivos Al terminar el trabajo práctico los estudiantes estarán en capacidad de: - Describir el proceso de extracción del glucógeno tisular y el fundamento de la reacción de color con antrona. - Calcular el contenido de glucógeno tisular (hepático y/o muscular). - Destacar la importancia del glucógeno hepático en el mantenimiento de la norglicemia y discutir los factores que pueden modificar la concentración del glucógeno hepático y/o muscular. Introducción Los seres vivos almacenan carbohidratos en forma de polisacáridos, siendo el glucógeno el carbohidrato de reserva de la célula animal. El glucógeno está formado por unidades monoméricas de glucosa unidas por enlaces glucosídicos α-(1,4), cuando se unen aproximadamente entre 8-12 residuos, ocurren puntos de ramificación donde se establecen enlaces α-(1,6). α-(1,6) α-(1,4) Figura 1. Estructura de una porción de la molécula de glucógeno. 1

2 Posterior a la ingesta de alimentos ricos en carbohidratos, la concentración de glucosa sanguínea aumenta, favoreciendo la liberación de insulina en el páncreas y con ello la síntesis del glucógeno (glucogénesis o glucogenogénesis), el cual es almacenado en el citosol de las células del tejido hepático y muscular. La glucogénesis requiere la activación de glucosa, siendo ésta transformada en glucosa-6-fosfato por la enzima hexocinasa (tejido muscular) o glucocinasa (tejido hepático), posteriormente la fosfoglucomutasa cataliza la conversión reversible de la glucosa-6-fosfato a glucosa-1-fosfato. La glucosa-1-fosfato en presencia de UTP genera UDP-glucosa en una reacción catalizada por la enzima UDP-glucosa pirofosforilasa. Seguidamente la enzima glucógeno sintetasa cataliza la transferencia del grupo glucosilo de la UDP-glucosa a los extremos no reductores del glucógeno y finalmente la enzima ramificante (amilo-α-1,4 1,6 glucosil transferasa) origina los enlaces α-(1,6) creando las ramificaciones de la molécula. Figura 2. Reacción catalizada por la glucógeno sintetasa en la glucogénesis. La degradación del glucógeno o glucogenólisis se presenta cuando la concentración de glucosa sanguínea disminuye como consecuencia de la restricción de 2

3 alimentos y se ve acentuada si adicionalmente el organismo se somete a una actividad física prolongada. A continuación se presenta de forma esquemática, las reacciones bioquímicas que se suceden durante la glucogenólisis. Figura 3. Esquema de las reacciones enzimáticas que ocurren en la glucogenólisis. El glucógeno hepático constituye una reserva importante en la reposición de unidades de glucosa para mantener la concentración sanguínea dentro del rango fisiológico para cada especie (norglicemia) en períodos de restricción de alimentos. De esta manera, el hígado puede contener un gran porcentaje de glucógeno después de una ingesta rica en glucosa, representando hasta un 10 % de su peso húmedo. Sin embargo, después de horas de ayuno, el hígado sufre una depleción significativa de glucógeno. 3

4 El glucógeno muscular disminuye de manera significativa sólo después de un ejercicio vigoroso prolongado y rara vez se encuentra por encima del 2% de su peso húmedo. La regulación del metabolismo del glucógeno está influenciada por un equilibrio entre las enzimas que participan en la glucogénesis o glucogenogénesis y en la glucogenólisis, las cuales a su vez están bajo el control hormonal de la insulina y glucagón o adrenalina, respectivamente. Extracción del glucógeno tisular El glucógeno es extraído del tejido (hepático o muscular) mediante tratamiento con KOH (30%) hirviente. Con este tratamiento, las proteínas y lípidos complejos son hidrolizados, pero no el glucógeno. Posteriormente, cuando se adiciona etanol, el glucógeno se hace insoluble y los otros compuestos permanecen en solución. El glucógeno insoluble es luego separado por centrifugación y determinado como glucosa, sin previa hidrólisis. Se ha demostrado que en tejidos con alto contenido de glucógeno, como hígado y músculo (2-10 g% y 1-2 g% respectivamente), este polisacárido puede ser determinado en presencia de proteínas y sin hidrólisis. Esto representa una ventaja sobre otros métodos en los cuales hay que precipitar el glucógeno y someterlo a un proceso de hidrólisis larga. Determinación cuantitativa del glucógeno tisular Una vez que el tejido ha sido sometido a digestión con KOH y precipitación con etanol, el glucógeno es determinado espectrofotometricamente mediante la reacción con antrona. La antrona es un derivado fenólico que forma complejo coloreado con todos los carbohidratos, excepto alditoles y aminoazúcares. La reacción de los glúcidos con antrona es muy sensible y tiene como fundamento la conversión en medio ácido de los 4

5 carbohidratos en derivados furfúricos, los cuales reaccionan con la antrona produciendo un color azul verdoso. CH 2 OH O H + H 2 COH O CHO Glucosa 5-hidroximetilfurfural H 2 COH O CHO + OH H + Compuestos de color verde-azul 5-hidroximetilfurfural Antrona Figura 4. Formación de 5-hidroximetilfurfural a partir de glucosa en medio ácido y su reacción con la antrona. MATERIALES Y REACTIVOS: Materiales - Tejido hepático y muscular de rata o bovino. - Tubos de centrífuga de 15 ml - Cilindro graduado de 10 ml - Gradilla - Tubos de ensayo - 2 Balones aforados de 100 ml - Espectrofotómetro Reactivos - KOH al 30% - Etanol al 95% - Estándar de glucosa de concentración 2 mg% 5

6 - Reactivo de antrona: contiene 0,2 g de antrona en 100 ml de H 2 SO 4 al 95%. No es estable y debe ser preparado diariamente. PARTE EXPERIMENTAL Extracción: (digestión alcalina y precipitación etanólica). - En un tubo de centrífuga de 15 ml coloque 5 ml de KOH al 30%. - Agregar entre 0,1 y 0,5 g de hígado o músculo. - Colocar el tubo en baño de agua hirviente por 15 minutos agitando ocasionalmente. - Dejar enfriar. - Agregar 6 ml de etanol al 95% y mezclar durante 5 minutos. Centrifugar por 10 minutos. - Descartar el sobrenadante y dejar drenar los tubos sobre el papel de filtro por unos minutos. Cuantificación: (reacción de color con el reactivo de antrona). - Agregar 5 ml de agua destilada al precipitado obtenido en la parte anterior (contiene glucógeno) y disolver lentamente con cuidado. - Preparar una dilución 1:100 de glucógeno, agregando 1 ml de la solución de glucógeno en un balón de 100 ml y aforando con agua destilada. Repetir dicha dilución para muestras de hígado (dilución 1/10.000), de ser necesario. - Preparar los siguientes tubos: REACTIVOS TUBO 1 BLANCO TUBO 2 ESTANDAR TUBO 3 MUESTRA Glucógeno diluido ml Estándar de glucosa 2 mg% ml ---- Agua destilada 1 ml Reactivo de antrona 2 ml 2 ml 2 ml - Mezclar y esperar 10 minutos. - Ajuste a cero (0,00) el espectrofotómretro con el tubo blanco. 6

7 - Leer la absorbancia de todos los tubos a una longitud de onda de 620 nm utilizando el espectrofotómetro. TUBO ABSORBANCIA Estándar Muestra Cálculos: calcule el contenido de glucógeno (g %) siguiendo los pasos: 1. Cálculo la alícuota de tejido utilizado. 5 ml g total de tejido utilizado (hígado o músculo) 1 ml X X = g de tejido utilizado contenidos en 1 ml La alícuota de tejido se calcula considerando que en los 5 ml de la solución original está el glucógeno correspondiente a la cantidad de tejido adicionada inicialmente. De esta solución se tomará 1 ml, el cual será diluido cien veces (1:100). A partir de ello se determinan los gramos del tejido utilizado contenidos en esta alícuota. 100 ml (dilución total) g de tejido utilizado contenidos en 1 ml 1 ml X X = g de tejido contenido en 1 ml de la dilución 1:100 Esto se deduce de: 1.1. En 1 ml de la solución original está el glucógeno contenido en los gramos de tejido calculados en el paso anterior Si preparó una dilución 1:100, quiere decir que en 100 ml se encuentra el glucógeno correspondiente a 1 ml de la solución original En 1 ml de la solución anterior, que es el volumen usado para la reacción de color, hay el glucógeno correspondiente a los gramos de tejido calculados en el último paso. 7

8 2. Cálculo de la cantidad de glucosa presente en el tubo. Cm = Am x CSt ASt x alicuota de tejido utilizado Donde: Cm: concentración de la muestra Am: absorbancia de la muestra CSt: concentración del estándar ASt: absorbancia del estándar 3. Cálculo del contenido de glucógeno (g%) en la muestra La cantidad de glucógeno detectada como glucosa debe corregirse multiplicando la misma por el factor 0,9. Este factor proviene de la división del peso molecular de la glucosa en forma de glucógeno (162 g/mol) entre el peso molecular de la glucosa (180 g/mol). El peso molecular de la glucosa en forma de glucógeno se obtiene restándole al peso molecular de la glucosa, el peso molecular del agua (18 g/mol) que se desprende durante la formación del enlace glucosídico. AUTOEVALUACIÓN: 1. Qué factores pueden influenciar el contenido de glucógeno en hígado de rata? 2. Una muestra de 25 mg de glucógeno hepático fue hidrolizado con 2 ml de ácido sulfúrico 2 M. El hidrolizado fue neutralizado y diluido hasta 10 ml. Si el contenido final de glucosa en la solución fue de 2,5 mg/ml Cuál es la pureza del glucógeno aislado? 3. Describa de que manera los siguientes factores afectaran la velocidad a la cual es metabolizado el glucógeno de una rata. 8

9 a) Aumento en la concentración de glucagón. b) Aumento en la concentración de calcio. c) Incremento en la concentración de glucosa. 4. Cómo puede demostrarse que el glucógeno además de presentar enlaces glucosídicos α-(1,4) también contiene uniones α-(1,6)? 5. Para una molécula de glucógeno compuesta por moléculas de glucosa e hidrolizada totalmente mediante procedimientos enzimáticos, diga: - Qué pesa más, la molécula de glucógeno o las moléculas de glucosa? - Cuál es la diferencia de peso en porcentaje? Bibliografía Alemany, M; Font, S. Práctica de Bioquímica. Editorial Alhambra. España, pp Hernández, Marta y col. Manual de Prácticas de Laboratorio. Cuba, Robyt, John; White Bernard. Bioquemical Techniques. Waveland Press Scott, T.; Melvin, E. Determination of dextran with anthrone. Analytical Chemistry. 25: McKee, T.; McKee, J. Bioquímica. 3era Ed. Editorial McGraw Hill-Interamericana. España,