ESTUDIO DE LOS CARBOHIDRATOS

Transcripción

1 ESTUDI DE LS CARBHIDRATS bjetivos Al finalizar este trabajo práctico el estudiante estará en capacidad de: - Detectar la presencia de carbohidratos en una muestra problema. - Aplicar reacciones específicas que permitan la identificación de carbohidratos en una muestra problema. - Determinar la concentración de glucosa en una muestra de plasma bovino. - Destacar la importancia del mantenimiento de la norglicemia y discutir los factores que pueden modificar su concentración. Introducción Los carbohidratos representan un conjunto numeroso de moléculas distribuidas ampliamente en la naturaleza. Químicamente se definen como aldehídos o cetonas polihidroxiladas, diferenciándose entre ellos básicamente en el número de carbonos y en la ubicación espacial de los grupos hidroxilo de cada monómero, así como en el número de monosacáridos que los conforman. Basándose en las diferencias estructurales que éstos presentan, es posible la identificación de los mismos utilizando reacciones químicas que demuestren alguna propiedad química específica del carbohidrato cuya presencia se quiere determinar. Las pruebas para la determinación de los carbohidratos pueden ser generales como la reacción de Molisch, la cual no discrimina el tipo de carbohidrato analizado, o específicas si el resultado final logra la identificación de un carbohidrato en particular. Independientemente de la prueba a que se haga referencia, existen dos propiedades que sirven de fundamento a la mayoría de éstas: la formación de derivados furfúricos y el poder reductor, cuyos fundamentos se explican más adelante. La reacción de carbohidratos con Antrona es otra prueba basada en la formación de derivados furfúricos que permite además, cuantificar carbohidratos como la glucosa en una muestra biológica, ejemplo en el plasma sanguíneo. La determinación de la concentración de glucosa sanguínea es una práctica de rutina en los laboratorios de diagnóstico clínico y representa un parámetro importante que refleja las 1

2 condiciones nutricionales, emocionales, endocrinas y metabólicas del organismo ya que constituye un índice entre la adecuada suplementación de carbohidratos en la dieta del animal y la utilización de los mismos. En condiciones fisiológicas, la concentración de glicemia en plasma de bovino oscila entre mg%. Bajo estas condiciones, la glucosa es utilizada como fuente de energía para las células, como sustrato para la síntesis de galactosa y subsecuentemente síntesis de lactosa, o como fuente de glicerol necesario para la síntesis de triacilglicéridos. La determinación cuantitativa de glucosa en el plasma sanguíneo sanguíneo permite evaluar el metabolismo de los carbohidratos, en particular la eficiencia de la utilización y síntesis de la glucosa a través de la glicólisis, el metabolismo del glucógeno y la gluconeogésis, según la condición fisiológica (alimentación, ayuno, lactancia) o patológica (enfermedad pancreática, cetosis u otra) del animal. MATERIALES Y EQUIPS - Tubos de ensayo. - Gradillas. - Pipetas graduadas. - Baño de María a 100 C. - Goteros. - Pinzas para tubos de ensayo. - -naftol al 0,5% en etanol. - Ácido sulfúrico concentrado. - Soluciones de glucosa, fructosa, almidón, sacarosa, maltosa al 3%. - Muestra problema - Plasma de bovino - Reactivo de Benedict: preparar combinando las siguientes soluciones: Solución A: 173 g de citrato de sodio y 100 g de carbonato de sodio se disuelven en 800 ml de agua destilada Solución B: disolver 17,3 g de CuS 4 : 5 H 2 en 100 ml de agua destilada. Mezclar ambas soluciones y aforar a 1 L con agua. - Reactivo de Seliwanoff: disolver 0,05 g de resorcinol en 33 ml de HCl concentrado. Aforar a 100 ml con agua destilada. - Solución diluida de yodo-yoduro de potasio en agua. - Reactivo de Antrona: 0,2 g de antrona en 100 ml de H 2 S 4 al 95%. No es estable y debe ser preparado diariamente. 2

3 Reacciones basadas en la formación de derivados furfúricos Estas reacciones se fundamentan en la formación en medio ácido de compuestos conocidos como derivados furfúricos. Estos se producen al deshidratar los azúcares mediante la aplicación de calor y la exposición a un medio fuertemente ácido. Pentosas (C 5 H 10 5 ) CH furfural Hexosas (C 6 H 12 6 ) H 2 CH CH 5-hidroximetilfurfural 6-Desoxihexosas (C 6 H 12 5 ) H 3 C CH 5-metilfurfural Estos derivados furfúricos reaccionan con compuestos fenólicos como el α-naftol, el orcinol, el resorcinol o la antrona, para formar cromógenos que evidencian la positividad de las reacciones. El tipo de compuesto fenólico utilizado dependerá del tipo de carbohidrato a determinar y por lo tanto, de la reacción que se esté realizando. A continuación se presentan tres ejemplos de reacciones donde hay formación de furfurales. Reacción de Molisch La reacción de Molisch detecta la presencia de carbohidratos en general. En ella, el carbohidrato reacciona en medio fuertemente ácido y en caliente, produciendo el 5- hidroximetilfurfural, cuya función aldehído se condensa con dos moléculas de α-naftol generando como productos compuestos de color violeta, como se muestra a continuación. 3

4 H alfa-naftol H 2 HC R C R + RCH H intermediario H Cromógeno violeta Experimento Nº 1. Prueba de Molisch: - Rotule dos tubos de ensayo (1 y 2) - Coloque 2 ml del carbohidrato (tubo 1) y 2 ml de compuesto desconocido (tubo 2). - Agregar a cada tubo 4 gotas de solución alcohólica de - naftol al 0,5%. - Agregar con cuidado 1 ml de ácido sulfúrico concentrado por las paredes de ambos tubos de ensayo. - La formación de un anillo violeta indica la presencia de carbohidratos Reacción de Seliwanoff La reacción de Seliwanoff detecta la presencia de cetohexosas. Con el mismo principio de la reacción anterior, esta se basa en la formación de derivados furfúricos. En este caso el 5- hidroximetilfurfural, producto de la deshidratación de las cetohexosas, reacciona con el resorcinol (derivado fenólico) produciendo un compuesto de color rojo. El resultado es positivo tanto para las cetohexosas en forma monomérica, como para oligosacáridos que contengan cetohexosas en su estructura. HH 2 C CH + 5-hidroximetilfurfural 2 H H resorcinol H CH 2 H Cromógeno rojo 4

5 Experimento Nº 2. Prueba de Seliwanoff: - Rotule dos tubos de ensayo (1 y 2) - Con la ayuda de una pipeta, agregue 4 gotas del carbohidrato (tubo 1) y 4 gotas del desconocido (tubo 2). - Añada 5 ml de reactivo de Seliwanoff en ambos tubos de ensayo. - Caliente en agua hirviente durante 5-10 minutos. La reacción es positiva al aparecer un color rojo intenso, indicando la presencia de cetohexosas. Reacciones basadas en la propiedad reductora de los carbohidratos (azúcares reductores): Existe otra propiedad que permite la diferenciación de algunos carbohidratos: el poder reductor. Existen carbohidratos que al oxidarse permiten la reducción de otros compuestos. Durante dicha oxidación se libera la energía necesaria para la reducción de otra molécula, por lo que se conoce este proceso como oxido-reducción y ocurre como una reacción acoplada. La mayoría de los reactivos que permiten evidenciar esta propiedad contienen cobre. Este metal se reduce (gana electrones) y se hace insoluble originando un precipitado rojo, lo que demuestra que el carbohidrato analizado es reductor. El principal grupo de pruebas de azúcares reductores incluyen: Benedict, Barfoed, Fehling, Trommens, entre otras. Conocer la propiedad reductora o no del carbohidrato, junto a los resultados de todas las pruebas aplicadas en conjunto, permitirán la identificación del carbohidrato presente en la muestra problema. Reacción de Benedict Esta reacción nos indica si un azúcar es o no reductor. Para tal fin el carbohidrato se hace reaccionar con el ión cúprico (Cu ++ ) en medio alcalino a una temperatura de 100 C. El carbohidrato, a través de su hemiacetal libre en el carbono 1, se oxida favoreciendo la reducción del cobre a oxido cuproso (Cu 2 ) el cual se presenta como un precipitado rojo ladrillo en el fondo del tubo. 5

6 RC 2Cu H - RC Cu 2 + 2H 2 precipitado rojo Experimento Nº 3: Prueba de Benedict: - Rotule dos tubos de ensayo (1 y 2) - Añada 8 gotas del carbohidrato (tubo 1) y 8 gotas del compuesto desconocido (tubo 2). - Agregue 5 ml de reactivo de Benedict en ambos tubos. - Caliente en agua hirviente durante 5 minutos. La reacción es positiva al aparecer un precipitado rojo ladrillo, indicando esto la presencia de sustancias reductoras. Detección de polisacáridos mediante la Reacción de Lugol La reacción de Lugol se emplea para comprobar la presencia de polisacáridos y nos permite tener una idea de cuál de ellos está presente. Se basa en poner en contacto el carbohidrato con yodo; si se obtiene un color azul intenso, se trata de almidón, debido a que se establece una relación de adhesión del yodo en la estructura helicoidal del almidón. Dicha coloración desaparece al calentar a ebullición y reaparece nuevamente al enfriar, esto debido a que la estructura helicoide del polisacárido se desordena por efecto del calor y se reordena al enfriarse. De esto se deduce que no hay formación de enlaces químicos permanentes entre el yodo y el almidón. Si la coloración obtenida es rojiza el polisacárido presente es el glucógeno. Experimento Nº 4. Prueba de Lugol: - Rotule dos tubos de ensayo (1 y 2) - Coloque 5 ml del carbohidrato (tubo 1) y 5 ml del desconocido (tubo 2). - Añada 2 gotas de una solución diluida de yodo-yoduro de potasio a ambos tubos. Mezclar. - bserve la coloración. Si ésta es azul, caliente el tubo en agua hirviente por 2 min. y observe. Deje enfriar y observe nuevamente. Determinación cuantitativa de la glucosa mediante reacción de Antrona La glucosa del plasma bovino es determinada de manera cuantitativa y espectrofotométricamente mediante la reacción con Antrona, un derivado fenólico. La reacción de los glúcidos con Antrona es muy sensible y tiene como fundamento la conversión en medio ácido 6

7 de los carbohidratos (excepto alditoles y aminoazúcares). en derivados furfúricos, los cuales reaccionan con la Antrona produciendo un color azul verdoso. La intensidad de dicha coloración es cuantificada en el espectrofotómetro. CH 2 H H 2 CH CH Glucosa 5-hidroximetilfurfural H 2 CH CH + H Compuestos de color verde-azul 5-hidroximetilfurfural Antrona Figura 4. Formación de 5-hidroximetilfurfural a partir de glucosa en medio ácido y su reacción con la Antrona. Experimento 5. Reacción de Antrona - En un balón aforado, prepare una dilución del plasma bovino 1/ Preparare los siguientes tubos: REACTIVS TUB 1 BLANC TUB 2 ESTANDAR TUB 3 MUESTRA Plasma bovino ml Estándar de glucosa 0,25 mg/dl ml ---- Agua destilada 1 ml Reactivo de Antrona 2 ml 2 ml 2 ml - Mezclar y esperar 10 minutos. - Ajuste a cero (0,00) el espectrofotómretro con el tubo blanco. - Leer la absorbancia de todos los tubos a una longitud de onda de 620 nm utilizando el espectrofotómetro. Anote los resultados: 7

8 TUB Estándar Muestra ABSRBANCIA Cálculo de la concentración de glucosa presente en la muestra. Cm = CSt ASt x Am Donde: Cm: concentración de la muestra expresada en mg/dl Am: absorbancia de la muestra CSt: concentración del estándar ASt: absorbancia del estándar AUTEVALUACIÓN 1. Qué utilidad tiene la reacción de Molisch en la identificación inicial de una muestra desconocida? 2. Existen reacciones que permiten identificar polisacáridos. Mencione una de ellas e indique su fundamento bioquímico. 3. Al calentar el tubo donde se realizó la prueba del yodo y se obtuvo un resultado positivo desaparece el color azul que se forma durante la misma. Por qué ocurre dicho fenómeno? 5. La formación de furfurales es determinante en algunas reacciones de identificación de carbohidratos, qué condiciones son necesarias para que se formen dichos compuestos? Pueden formarse furfurales a partir de otro tipo de biomoléculas distintas a los carbohidratos? Razone su respuesta. 6. Investiga bajo qué condiciones está disminuida la concentración de glucosa sanguínea en monogástricos y rumiantes. 8

9 7. Revisa las rutas metabólicas de carbohidratos activas durante el ayuno y post alimentación. Relaciona las mismas con la liberación de las hormonas insulina y glucagón. BIBLIGRAFÍA Alemany, M; Font, S. Práctica de Bioquímica. Edit Alhambra. España, J.M. Clark. Bioquímica experimental Pavia, Donald; Lampman, Gary; Kriz George. Introduction to organic laboratory techniques. Saunders editores Robyt, John; White Bernard. Bioquemical Techniques. Waveland Press