HBsAg 90. Introducción

Transcripción

1 HsAg 90 S identificación de los pacientes infectados con HV y ayuda en el diagnóstico y el pronóstico de la enfermedad. Principio de la Prueba La prueba ImmunoComb II HsAg 90 es un ensayo immuno-enzimático de fase sólida (EIA), basado en el principio de la inmunocaptura. La fase sólida es un Peine con 12 proyecciones ("dientes"). Cada diente está sensibilizado en dos áreas reactivas: punto superior albúmina de suero bovino biotinilada (Control Interno) punto inferior anticuerpos monoclonales anti-hsag La andeja de Desarrollo tiene 6 filas (A-F) de 12 pocillos cada una. Cada fila contiene una solución reactiva lista para ser usada en cada etapa del ensayo. La prueba es realizada en etapas, pasando el Peine de una fila a otra, con un período de incubación en cada etapa. Para comenzar la prueba, las muestras de suero o plasma son agregadas a los pocillos de la fila A de la andeja de Desarrollo. A continuación de éste paso, 20 µl de diluyente para muestras son agregados a cada uno de los pocillos en la Fila A. Luego se inserta el Peine en los pocillos de la fila A. El HsAg, en caso de estar presente en las muestras, es capturado por los anticuerpos anti-hs en el punto inferior del diente del Peine (Figura 1). Los componentes no unidos son lavados en la fila. En la fila C, el HsAg capturado en el diente reacciona con los anticuerpos anti-hs biotinilados. En la fila D, el complejo anticuerpo/antigeno biotinilado en el punto inferior del diente, y la albúmina de suero bovino biotinilada en el punto superior (Control Interno), reaccionan con avidina marcada con fosfatasa alcalina (). En la fila E, los componentes no unidos son eliminados mediante un lavado. En la fila F, la fosfatasa alcalina unida reacciona con componentes cromogénicos. Los resultados son visibles como puntos de color azul grisáceo en la superficie de los dientes del Peine. Código: Para uso diagnóstico in vitro solamente Uso Previsto Formato: 3 x 12 pruebas El kit ImmunoComb II HsAg 90 constituye una prueba para la detección cualitativa del antígeno de superficie del virus de la hepatitis (HsAg) en el suero o plasma humano. Treinta y seis pruebas pueden ser realizadas con un kit. Introducción El vírus de la hepatitis (HV) pertenece a una nueva familia de vírus de ADN llamados Hepadnaviridae. Se caracteriza por un marcado hepatotropismo y un singular medio de replicación a través de un mecanismo de transcripción inversa. El virión completo, o partícula Dane, consiste de una molécula de ADN circular protegida por un antígeno nucleocáspide/nuclear (HcAg) y rodeada por un envoltorio de lipoproteína conocido como antígeno de superficie (HsAg). El HsAg también se encuentra en la sangre en forma de partículas incompletas esféricas o filamentosas no infecciosas. Un componente menor del nucleocáspide HV, el antígeno He (HeAg), también puede detectarse en la sangre durante la fase replicativa del virus. El vírus de la hepatitis es un vírus ubicuo de distribución global. Las principales rutas de trasmisión viral son horizontales, a través de la contaminación sexual y parenteral, y vertical, a través de la trasmisión prenatal de la madre infectada al feto. Las consecuencias clínicas de la infección de HV varían entre las totalmente inaparentes (70% de los casos) a la hepatitis ictérica aguda. La mayoría de los pacientes se recuperan completamente seis meses después del comienzo de la enfermedad. Una pequeña proporción de la población infectada (<1.5%) puede desarrollar hepatitis fulminante, a menudo con consecuencias fatales. En una proporción sustancial (hasta 10%) de los pacientes adultos, el HV puede persistir, progresando eventualmente hasta la hepatitis crónica con desarrollo final de cirrosis y hépatocarcinoma. Los portadores crónicos de hepatitis (200 millones en todo el mundo) constituyen la principal reserva del virus y contribuyen a la diseminación de la enfermedad. En los casos típicos de infección aguda de HV, el HsAg, a menudo acompañado de HeAg, aparece en la sangre de 2 a 6 semanas antes del inicio de los síntomas o la evidencia bioquímica de la hepatitis, y llega al máximo durante la fase aguda de la enfermedad. La persistencia del HsAg en el suero por más de 6 meses refleja el estadio de portador crónico de HV. Por lo tanto, un muestreo de HsAg permite la HsAg a - Hs biotinilado AV AV avidina - sustrato cromogénico AV Figura 1. Principio de la Prueba Captura del HsAg; 60 min/37 C Unión del anti-hs biotinilado; 10 min/37 C Unión de la avidina-; 5 min/37 C Reacción enzimática de color; 10 min/37 C El kit incluye un Control Positivo (HsAg) y un Control Negativo, que deben incluirse cada vez que se realiza la prueba. Al término de ésta, el diente utilizado con el Control Positivo debe mostrar dos puntos de color azul grisáceo. El diente usado con el Control Negativo debe mostrar el punto superior y un punto inferior muy ténue o la ausencia del mismo. El punto superior debe aparecer en todos los demás dientes para confirmar que el kit funciona apropiadamente y que la prueba fue realizada correctamente. Contenido del Kit Peines El kit contiene 3 Peines de plástico. Cada Peine tiene 12 dientes, uno para cada prueba (Figura 2). Cada diente esta sensibilizado en dos areas reactivas: punto superior albúmina de suero bovino biotinilada (Control Interno) punto inferior anticuerpos monoclonales anti-hsag Figura 2: Peine ImmunoComb II Control Interno Anti-Hs Los Peines son suministrados en empaques de aluminio que contienen una bolsa desecante. andejas de Desarrollo El kit contiene 3 andejas de Desarrollo, cubiertas con papel de aluminio. Cada andeja de Desarrollo (Figura 3) contiene todos los reactivos necesarios para la prueba, con excepción de la Fila A. El kit /S8/OR 1

2 contiene una botella con diluyente para muestras, el cual es agregado a los pocillos de la fila A, inmediatamente antes de ser usada. La andeja de Desarrollo consta de 6 filas (A-F) de 12 pocillos cada una. Los contenidos de cada fila son los siguientes: Fila A Vacía Fila Solución de lavado Fila C Anticuerpos biotinilados de cabra anti-hsag Fila D Avidina modificada conjugada con fosfatasa alcalina Fila E Solución de lavado Fila F Solución de sustrato cromogenico que contiene 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (CIP) y nitro azul tetrazolio (NT) Figura 3. andeja Desarrollo Control Positivo 1 frasco (tapa roja) de 1.5 ml de plasma humano diluído, inactivado con calor, negativo para HsAg, suplementado con 50 ng/ml de HsAg recombinante. Control Negativo 1 frasco (tapa verde) de 1.5 ml de plasma humano diluído, inactivado con calor y negativo para HsAg. Perforador para perforar el papel de aluminio que cubre los pocillos de la andeja de Desarrollo. Diluyente para Muestras - 1 frasco de 2 ml de diluyente para muestras. Seguridad y Precauciones Maneje el control positivo como si fuera potencialmente infeccioso, aunque haya sido inactivado. Todos los materiales de origen humano usados en la preparación de los controles pasaron pruebas que demostraron que no son reactivos a HsAg, anticuerpos del virus de la hepatitis C y anticuerpos anti-hiv. Ya que ningún método de prueba puede garantizar por completo la ausencia de contaminación viral, todas las soluciones de referencia y todas las muestras humanas deben ser manejadas como si fueran potencialmente infecciosas. Use guantes quirúrgicos y ropa de laboratorio. Siga los procedimientos de laboratorio aceptados para el trabajo con suero o plasma humano. No use la pipeta aspirando con la boca. Deseche todas las muestras, Peines ** * usados, andejas de Desarrollo y otros materiales usados con el kit como materiales biocontaminantes. No mezcle reactivos de lotes diferentes. No use este kit después de la fecha de caducidad. Conservación y estabilidad del kit El kit es enviado a 2-8ºC. Durante el transporte el kit puede ser conservado a menos de 30ºC durante cortos períodos de tiempo que no excedan de 48 horas. Los controles internos indican que el kit no ha sido dañado durante el transporte. Conservar el kit en su caja original a 2-8ºC. No congelar el kit. Después de abrir el kit inicialmente, los componentes deben ser conservados a 2-8ºC. El funcionamiento del kit después de su apertura inicial, es estable hasta la fecha de caducidad del mismo si se conserva a 2-8ºC. Después del uso inicial, el peine y la bandeja de reactivos no pueden ser utilizados más de tres veces. Manejo de las Muestras Es posible usar suero o plasma en la prueba. Las muestras pueden ser almacenadas por 7 días a temperaturas de 2 a 8 C antes de la prueba. Para almacenar las muestras por más de 7 días, congélelas a -20 C o a temperaturas más bajas. Después de descongelar las muestras de suero, centrifúguelas. Use el sobrenadante para la prueba. Evite congelar y descongelar repetidamente. Los anticoagulantes como heparina, EDTA y citrato sódico no han mostrado tener efecto sobre los resultados del test. ** * A menos que sea archivado para documentación Procedimiento de la Prueba Equipo Necesario (no proporcionado) Pipetas de precisión ajustables con puntas desechables con capacidad de 100 µl y 20 µl Tijeras Cronómetro de laboratorio o reloj Preparación para la Prueba Preparación de la andeja de Desarrollo 1. Incube la andeja de Desarrollo en una incubadora a 37 C durante 45 minutos. Lleve todos los otros componentes (Peines, controles y muestras) a temperatura ambiente. 2. Cubra la mesa de trabajo con papel absorbente, a ser desechado como material biocontaminante al concluir la prueba. 3. Mezcle los reactivos sacudiendo la andeja de Desarrollo. Nota: No retire la cubierta de aluminio de la andeja de Desarrollo; rómpala usando la punta desechable de la pipeta o el perforador, sólo cuando las instrucciones de la prueba así lo indiquen. Preparación del Peine Precaución: para asegurar el funcionamiento apropiado de la prueba, no toque los dientes del Peine. 1. Abra el empaque de aluminio por el borde perforado. Retire el Peine. 2. Es posible utilizar todo el Peine y la andeja de Desarrollo o solamente una parte. Para utilizar parte del Peine: a. Determine cuantos dientes va a necesitar para analizar las muestras y los controles. Se necesita un diente para cada prueba. Cada diente tiene impreso el número de código del kit, "54", para permitir la identificación de los dientes sueltos. b. Doble y rompa verticalmente el Peine, o córtelo con tijeras (ver Figura 4) para separar el número requerido para las pruebas (Nro. de pruebas mas 2 controles). c. Vuelva a meter la porción no utilizada del Peine en el empaque de aluminio (con la bolsa desecante). Cierre bien el empaque (con un clip o con cinta adhesiva, por ejemplo) a fin de mantenerlo seco. Almacene el Peine en la caja original del kit a temperaturas de 2 8 C para su uso posterior. ImmunoComb II Figura 4. Fraccionamiento del Peine Preparación del diluyente Incube el diluyente para muestras, la solución del Control Positivo, la solución del Control Negativo y las muestras de suero analizadas a 37 C durante 15 minutos. Todas las soluciones deben estar a temperatura ambiente antes de ser usadas. Instrucciones de la Prueba Nota: Realice las incubaciones a 37 C! [los lavados deben ser realizados a temperatura ambiente (22 26 C)]. Las instrucciones descritas a continuación proporcionan una sensibilidad de la prueba de ng/ml. Captura del Antígeno (Fila A de la andeja de Desarrollo) 1. Tome 100 µl de la muestra con la pipeta. Perfore la cubierta de papel aluminio en un pocillo de la fila A de la andeja de Desarrollo con la punta de la pipeta o el perforador y vierta la muestra en el fondo del pocillo. Agregue a éste pocillo 20 µl de diluyente para muestras y mezcle vaciando y rellenando repetidamente la solución con la pipeta. Deseche la punta de la pipeta. 2. Repita el paso 1 para las demás muestras, incluyendo un Control Positivo y uno Negativo provistos en el kit. Use un nuevo pocillo en la fila A y cambie la punta de la pipeta para cada muestra o control. Para mejores resultados: Incuba la placa con el especímen y el diluyente por 15 minutos adicionales a 37º. 3. a. Inserte el Peine (con el lado impreso hacia Ud.) en los pocillos de la fila A que contienen las muestras y los controles. Mezcle: Retire e inserte el Peine en los pocillos varias veces. b. Deje el Peine en la fila A e incube por 60 minutos a 37 C. Active el cronómetro. Después de 30 minutos de incubación mezcle como en el paso 3a. Mezcle una vez mas durante la incubacion. Hacia el final de los 60 minutos, perfore el papel /S8/OR 2

3 de aluminio de la fila usando el perforador. No abra más pocillos de los necesarios. c. Al cumplirse los 60 minutos, saque el Peine de la fila A. Absorba el líquido adherido a las puntas de los dientes apoyándolos sobre un papel absorbente limpio. No toque la superficie frontal del diente. Primer Lavado (Fila ) 4. Inserte el Peine en los pocillos de la fila. Agite: inserte y retire vigorosamente el Peine en los pocillos durante al menos 10 segundos para que quede bien lavado. Repita el lavado varias veces agitando en el trascurso de 2 minutos; mientras tanto, perfore el papel aluminio de la fila C. Después de 2 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido como en el paso 3c. Unión del anti-hs iotinilado (Fila C) 5. Inserte el Peine en los pocillos de la fila C. Mezcle como en el paso 3a. Incube la andeja de Desarrollo con el Peine durante 10 minutos (use el cronómetro) a 37 C. Perfore el papel aluminio de la fila D. Mezcle una vez mas durante la incubacion. Después de 10 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido. Unión de la avidina modificada/fosfatasa alcalina (Fila D) 6. Inserte el Peine en los pocillos de la fila D. Mezcle. Incube la andeja de Desarrollo con el Peine durante 5 minutos (use el cronómetro) a 37 C. Perfore el papel aluminio de la fila E. Mezcle una vez mas durante la incubacion. Después de 5 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido. Segundo Lavado (Fila E) 7. Inserte el Peine en los pocillos de la fila E. Agite repetidamente durante 2 minutos, como en el paso 4. Mientras tanto, perfore el papel aluminio de la fila F. Después de 2 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido. Reacción de Color (Fila F) 8. Inserte el Peine en los pocillos de la fila F. Mezcle. Incube la andeja de Desarrollo con el Peine durante exactamente 10 minutos (use el cronómetro) a 37 C. Mezcle una vez mas durante la incubacion. Después de 10 minutos, retire el Peine. Detención de la Reacción (Fila E) 9. Inserte de nuevo el Peine en la fila E. Después de un minuto, retire el Peine y déjelo secar al aire. Eliminación de los Desechos Deseche las andejas de Desarrollo usadas, las puntas de la pipeta, el papel absorbente y los guantes como materiales biocontaminantes. Almacenamiento de Partes No Usadas del Kit andeja de Desarrollo Si no usó todos los pocillos de la andeja de Desarrollo, puede almacenarla para ser usada posteriormente: Selle los pocillos usados con cinta adhesiva ancha a fin de que nada se derrame fuera de los pocillos, incluso en caso de que la andeja de Desarrollo sea volcada. Otros Materiales del Kit Vuelva a colocar la(s) andejas(s) de Desarrollo, Peine (s), perforador, controles e instrucciones en la caja original del kit y almacene a temperaturas de 2 C a 8 C. Resultados de la Prueba Validación A fin de confirmar el funcionamiento correcto de la prueba y demostrar que los resultados son válidos, deben cumplirse las siguientes tres condiciones (ver Figura 5): 1. El Control Positivo debe producir dos puntos en el diente del Peine. 2. El Control Negativo debe producir un punto superior (Control Interno). El punto inferior no aparecerá. 3. Cada muestra analizada debe producir un punto superior (Control Interno). Si cualquiera de las tres condiciones no se cumple, los resultados de la prueba no son válidos y las muestras y controles deben ser reexaminados. Documentación de los Resultados Debido a que el color que aparece en el Peine es estable, es posible archivar los Peines para consulta posterior. Limitaciones Los resultados positivos de la prueba del ImmunoComb II HsAg 90 indican la presencia del antígeno de superficie de la hepatitis. Sin embargo, no debe ser considerado como una prueba definitiva de la infección viral de la hepatitis activa. Como otras pruebas usadas para el diagnóstico in vitro, los resultados de esta prueba deben ser evaluados en relación con todos los síntomas, el historial clínico y otros resultados de pruebas de laboratorio del paciente Características del Ensayo* La sensibilidad y especificidad del kit ImmunoComb II HsAg 90 fueron evaluadas en un panel de muestras de suero, en comparación con el sistema Abbot Axsym como ensayo de referencia. El panel incluyó 112 muestras positivas a HsAg y 90 muestras negativas a HsAg. Los resultados son resumidos en la Tabla 1. Tabla 1. Resultados de las Pruebas ImmunoComb II Hs Ag 90 Ensayo de Referencia Positivo Negativo Positivo Negativo 0 90 Se calcularon las características del ensayo, encontrándose los siguientes reultados: Sensibilidad = 99% Especificidad = 100% ibliografía Follet EAC Diagnosis of hepatitis infection. In: Hugh Y, McMillan A, eds. Immunological diagnosis of sexually transmitted diseases. Marcel Dekker, New York. pp Herrera JL Serological diagnosis of viral hepatitis. S Med J 87: Hollinger F Hepatitis virus. In: Viral Hepatitis. (Hollinger F, Purcel RH, Robinson WS, Gerin JL, Ticehurst J, eds.) Raven Press, New York. pp Kiyasu PK, Caldwell SH Diagnosis and treatment of the major hepatotropic viruses. Am J Med Sci 306: Krugman S, Overby LR, Mushawar IK, Ling C-M, Frösner GG, Deinhart F Viral hepatitis, type : studies on natural history and prevention re-examined. N Engl J Med 300: Ogra PL, eutner KR Hepatitis viruses. In: Milgrom F, Abeyounis CJ, Kano K, eds. Principles of immunological diagnosis in medicine. Lea & Febiger, Philadelphia. pp Robinson WS Hepadnaviridae and their replication. In: Viral Hepatitis. (Hollinger F, Purcell, RH, Robinson WS, Gerin JL, Ticehurst J, eds. Raven Press, New York. pp Swenson PD Hepatitis viruses. In: alows A, Hausler WJ, Herrmann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ, eds. Manual of Clinical Microbiology, Fifth edition. American Society for Microbiology, Washington, DC. pp Control Positivo Control Negativo Figura 5. Validación de la Prueba Resultado Inválido Interpretación de los Resultados Un punto inferior, de cualquier intensidad, en el diente de la muestra analizada, debe ser considerado como un resultado positivo, sin relación a la intensidad del mismo. ** * Datos detallados disponibles /S8/OR 3

4 Leyenda de los símbolos CARD PLATE CONTROL + CONTROL - PERFORATOR DIL IVD ImmunoComb tarjeta andejas de Desarrollo Control positivo Control negativo Perforador Diluyente para Muestras Consulte las instrucciones de uso Atención,ver instrucciones de uso Producto sanitario para diagnóstico in vitro Limite de temperatura Σ n Contenido suficiente para n ensayos Fabricante REF LOT Representante autorizado en la Comunidad Europea Número de catálogo Código de lote Fecha de caducidad Número de serie Version: /S8/OR (03/2008) /S8/OR 4

5 Resumen de los Principales Procedimientos de la Prueba Preincubación de la andeja de Desarrollo: 45 minutos a 37 C Tomar las muestras y controles Agregar muestras y controles a la fila A. Agregar diluyente para muestras. Mezclar Sacar el Peine del empaque Insertar el Peine y mezclar en la fila A. Incubar a 37 C Perforar la fila Absorber el líquido adherido a los dientes Insertar el Peine y agitar en la fila. Incubar Después de mezclar/agitar e incubar en filas C,D y E Reacción de color en fila F Resultados Resumen del Procedimiento de la Prueba Las instrucciones abreviadas a continuación son para personas experimentadas en el uso del kit ImmunoComb II HsAg 90. (Para instrucciones detalladas favor de referirse al texto completo) 1. Incubar la andeja de Desarrollo a 37 C durante 45 minutos. 2. Depositar 100 µl de cada muestra y control en pocillos de la fila A de la andeja de Desarrollo. 3. Agregar 20 µl de diluyente para muestras en los pocillos de la Fila A y mezclar bien. 4. Insertar el Peine en la fila A y continuar según se describe en la Tabla 1. Tabla 1. Resumen del Procedimiento de la Prueba Etapa Fila Proceda como se indica Captura del antígeno A Mezcle;incube 60 minutos a 37 C (mezcle después de 30 minutos); absorba. Lavado Agite; incube 2 minutos; absorba. Unión del anti-hs biotinilado C Mezcle; incube 10 minutos a 37 C; absorba. Unión de avidina modificada/ fosfatasa alcalina D Mezcle; incube 5 minutos a 37 C; absorba. Lavado E Agite; incube 2 minutos; absorba. Reacción de color F Mezcle; incube 10 minutos a 37 C. Detención de reacción E Incube 1 minuto; seque al aire. 1 2 Manera de romper el Peine /S8/OR 5