Rubella IgG. Principio de la Prueba
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- Carolina Domínguez Farías
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1 Código: Rubella IgG 0459 S Formato: 3 x 12 pruebas Para diagnóstico únicamente Propósito de Uso El kit ImmunoComb II Rubella IgG es una prueba rápida para la determinación semi-cuantitativa de anticuerpos IgG contra el virus de la rubéola en suero o plasma humano. Treinta y seis pruebas pueden ser realizadas con un kit. Introducción El virus de la rubéola es miembro de la familia Togaviridae, que se encuentra principalmente en poblaciones humanas. La trasmisión ocurre principalmente por aerosol o contagio directo, con una incidencia máxima en el grupo de 5 a 14 años de edad. En general, la infección se manifiesta como una enfermedad benigna y auto-limitada, caracterizada por un eritema máculo-papular (sarampión alemán), fiebre leve y linfadenopatía. Ocasionalmente pueden presentarse artralgia y artritis moderadas y pasajeras. En contraste, la infección primaria de rubéola contraída durante el embarazo temprano puede dar como resultado daño fetal severo, óbito o aborto. Los síntomas de niños infectados congénitamente incluyen serias anormalidades anatómicas y neurosensitivas, tales como sordera, defectos cardíacos, cataratas, glaucoma y retraso mental. El retraso en el crecimiento y la diabetes mellitus también han sido asociados con complicaciones tardías de la rubéola congénita. La vacunación generalizada ha reducido significativamente la incidencia en todos los grupos de diferentes edades. Sin embargo, 10 a 20% de los adolescentes aún parecen ser suceptibles al virus. La lectura cualitativa de los anticuerpos IgG contra el virus de rubéola es una herramienta útil para el diagnóstico de la enfermedad y para determinar el status inmunológico. Los anticuerpos del virus aparecen cuando los salpullidos comienzan a desaparecer. En los adultos, los anticuerpos IgG usualmente persisten durante toda la vida. Como consecuencia, un título estable de IgG anti-rubéola es prueba de exposición previa al virus, mientras que un aumento cuádruple o mayor constituye un diagnóstico de infección reciente. Sin embargo, un título incrementado de IgG en la ausencia de síntomas clínicos también podría implicar una reinfección. Puesto que los anticuerpos IgM no son producidos luego de la reinfección, esta posibilidad debería ser excluida por un resultado negativo en una prueba de IgM anti-rubéola. La producción de anticuerpos IgG circulantes contra el virus de rubéola por niños infectados congénitamente usualmente persiste de 3 a 4 años después del parto. Por lo tanto, la determinación serial del nivel de IgG anti-rubéola en el niño ayudará en la diferenciación entre la rubéola congénita (nivel constante) o la rubéola neonatal (incremento en el título). Principio de la Prueba La prueba ImmunoComb II Rubella IgG consiste en un ensayo inmuno-enzimático indirecto de fase sólida (EIA). La fase sólida es un Peine con 12 proyecciones ("dientes"). Cada diente está sensibilizado en dos áreas reactivas: punto superior inmunoglobulina humana ( Interno) punto inferior antígenos de rubéola inactivados La Bandeja de Desarrollo tiene 6 filas (A-F) de 12 pocillos. Cada fila contiene una solución reactiva lista para ser usada en cada etapa del ensayo. La prueba es realizada en etapas, pasando el Peine de una fila a otra, con un período de incubación en cada etapa. Al comienzo de la prueba, las muestras de suero o plasma son prediluídas en relación 1:11 y agregadas al diluyente en los pocillos de la fila A de la Bandeja de Desarrollo. Luego se inserta el Peine en los pocillos de la fila A. Los anticuerpos anti-rubéola, en caso de estar presentes en las muestras, se unirán específicamente a los antígenos de rubéola en el punto inferior del diente del Peine (Figura 1). Los componentes no unidos son lavados en la fila B. En la fila C, el IgG anti-rubéola capturado en los puntos inferiores del diente, y la inmunoglobulina humana en los puntos superiores ( Interno) reaccionarán con el anticuerpo IgG anti-humano marcado con fosfatasa alcalina (FA). En las próximas dos filas, los componentes no ligados son eliminados mediante un lavado. En la fila F, la fosfatasa alcalina unida reaccionará con componentes cromogénicos. Los resultados pueden verse como puntos azul grisáceos en la superficie del diente del Peine. anticuerpo anti-rubéola FA Unión del conjugado FA FA anti-igg humano; 20 min conjugado anti-igg humano sustrato cromogénico Formación del complejo antígeno de rubéola anticuerpo; 30 min Reacción enzimática de color; 10 min Figura 1. Principio de la Prueba El kit incluye un Positivo (IgG anti-rubéola) y un Negativo, que deben incluirse cada vez que se realiza la prueba. Al término de ésta, el diente utilizado con el Positivo debe mostrar dos puntos de color azul grisáceo. El diente usado con el Negativo debe mostrar el punto superior y un punto inferior muy ténue o la ausencia del mismo. El punto superior también deberá aparecer en todos los demás dientes para confirmar que el kit funciona apropiadamente y que la prueba fue realizada correctamente. Contenido del Kit Peines El kit contiene 3 Peines de plástico. Cada Peine tiene 12 dientes, uno para cada prueba (Figura 2). Cada diente es sensibilizado en dos áreas reactivas: punto superior inmunoglobulina humana ( Interno) punto inferior antígenos de rubéola inactivados Figura 2. Peine ImmunoComb II Interno Antígenos de rubéola Los Peines son suministrados en empaques de aluminio que contienen una bolsa desecante. Bandejas de Desarrollo El kit contiene 3 Bandejas de Desarrollo, cubiertas con papel de aluminio. Cada Bandeja de Desarrollo (Figura 3) contiene todos los reactivos necesarios para la prueba. La Bandeja de Desarrollo consiste de 6 filas (A-F) de 12 pocillos cada una. Los contenidos de cada fila son los siguientes: /S12/OR/CE 1
2 Fila A Fila B Fila C Fila D Fila E Fila F diluyente de la muestra anticuerpos de cabra anti-igg humano marcados con fostatasa alcalina solución de sustrato cromogénico que contiene 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) y nitro azul tetrazolio (NBT) Figura 3. Bandeja de Desarrollo Positivo 1 frasco (tapa roja) de 0.2 ml de plasma humano diluído, inactivado con calor, diluído a un nivel crítico de 15 IU/ml para anticuerpos IgG contra el virus de rubéola. Negativo 1 frasco (tapa verde) de 0.2 ml de plasma humano diluído reconstituído, inactivado con calor, negativo para anticuerpos anti-rubéola. Diluyente de la Muestra 1 botella de 5 ml. Perforador para perforar el papel de aluminio que cubre los pocillos de la Bandeja de Desarrollo. CombScale para leer los resultados de la prueba. Seguridad y Precauciones Todos los materiales de origen humano usados en la preparación de los controles pasaron pruebas que demostraron que no son reactivos al antígeno de superficie de la hepatitis B, así como a anticuerpos de HIV o el virus de la hepatitis C. Ya que ningún método de prueba puede garantizar por completo la ausencia de contaminación viral, todas las soluciones de referencia y todas las muestras humanas deben ser manejadas como si fueran potencialmente infecciosas. Use guantes quirúrgicos y ropas de laboratorio. Siga los procedimientos de laboratorio aceptados para el trabajo con suero o plasma humano. No use la pipeta aspirando con la boca. Deseche todas las muestras, Peines* usados, Bandejas de Desarrollo y otros materiales usados con el kit como desechos biocontaminantes. No mezcle reactivos de lotes diferentes. No use el kit después de la fecha de caducidad. Conservación y estabilidad del kit El kit es transportado entre 2-8 o C. Durante el transporte el kit debe mantenerse entre 30 o C por cortos períodos de tiempo, no excediendo un total de 48 horas. Los controles internos indican que el kit no se ha dañado durante el transporte." Almacene el kit en su caja original de 2-8 o C. No congele el kit. Después de abrir el kit por primera vez, los componentes deben ser almacenados de 2-8 o C. El desempeño del kit después de abrirlo por primera vez es estable hasta la fecha de expiración del Kit, cuando se almacena de 2-8 o C. Después del primer uso, el peine y la bandeja no deben ser usados por más de tres veces. Manipulación de las Muestras Es posible usar suero o plasma en la prueba. Las muestras pueden ser almacenadas por 7 días a temperaturas de 2 a 8 C antes de la prueba. Para almacenar las pruebas por más de 7 días, congélelas a 20 C o a temperaturas más bajas. Después de descongelar las muestras de suero, centrifúguelas. Use el sobrenadante para la prueba. Evite congelar y descongelar repetidamente. Los anticoagulantes como heparina, EDTA y citrato sódico no han mostrado tener efecto sobre los resultados del test. Procedimiento de la Prueba Equipo Necesario (no proporcionado) Pipetas de precisión ajustables con puntas desechables y capacidad de 10 µl, 25 µl y 100 µl Tijeras Cronómetro de laboratorio o reloj Microtubos o pocillos de microtitulación Preparación de la Prueba Equilibre todos los reactivos y las muestras a temperatura ambiente y realice la prueba a temperatura ambiente (22-26 C). Preparación de la Bandeja de Desarrollo 1. Incube la Bandeja de Desarrollo en una incubadora a 37 C durante 20 minutos; o deje a temperatura ambiente (22-26 C) durante 3 horas. Lleve todos los otros componentes (Peines, diluyente de la muestra, controles y muestras) a temperatura ambiente. 2. Cubra la mesa de trabajo con papel absorbente, a ser desechado como desecho biocontaminante al concluir la prueba. 3. Mezcle los reactivos sacudiendo la Bandeja de Desarrollo. Nota: No retire la cubierta de aluminio de la Bandeja de Desarrollo; rómpala usando la punta desechable de la pipeta o el perforador, sólo cuando las instrucciones de la prueba así lo indiquen. Preparación del Peine Precaución: para asegurar el funcionamiento apropiado de la prueba, no toque los dientes del Peine. 1. Abra el empaque de aluminio por el borde perforado. Retire el Peine. 2. Es posible utilizar todo el Peine y la Bandeja de Desarrollo o solamente una parte. Para utilizar parte del Peine: a. Determine cuantos dientes va a necesitar para analizar las muestras y los controles. Se necesita un diente para cada prueba. Cada diente tiene impreso el número de código del kit, "00", para permitir la identificación de los dientes sueltos. b. Doble y rompa verticalmente el Peine, o córtelo con tijeras (ver Figura 4) para separar el número requerido para las pruebas (Nro. de pruebas más 2 controles). c. Vuelva a meter la porción no utilizada del Peine en el empaque de aluminio (con la bolsa desecante). Cierre bien el envoltorio (con un clip, por ejemplo) a fin de mantenerlo seco. Almacene el Peine en la caja original del kit a temperaturas de 2 a 8 C para su uso posterior. ImmunoComb II Figura 4. Fraccionamiento del Peine Instrucciones de la Prueba Predilución de Muestras y es 1. Para cada muestra y control, dispense 100 µl de diluyente de la muestra en un microtubo o pocillo de microtitulación. 2. A cada microtubo o pocillo, añadir 10 µl de una muestra, o del Positivo o Negativo suministrado con el kit. Mezcle vaciando y rellenando repetidamente la solución con la pipeta. Reacción Antígeno-Anticuerpo (Fila A de la Bandeja de Desarrollo) 3. Pipetee 25 µl de una muestra prediluída. Perfore la cubierta de papel aluminio en un pocillo de la fila A de la Bandeja de Desarrollo con la punta de la pipeta o el perforador y vierta la muestra en el fondo del pocillo. Mezcle vaciando y rellenando repetidamente la solución con la pipeta. Deseche la punta de la pipeta. 4. Repita el paso 3 para las demás muestras prediluídas y los dos controles prediluídos. Use un nuevo pocillo en la fila A y cambie la punta de la pipeta para cada muestra o control. 5. a. Inserte el Peine (con el lado impreso hacia Ud.) en los pocillos de la fila A que contienen las muestras y los controles. Mezcle: Retire e inserte el Peine en los pocillos varias veces. b. Deje el Peine en la fila A e incube por 30 minutos. Active el cronómetro. Hacia el final de los 30 minutos, perfore el papel de aluminio de la fila B usando el perforador. No abra más pocillos de los necesarios. c. Al cumplirse los 30 minutos, saque el Peine de la fila A. Absorba el líquido adherido a las puntas de los dientes apoyándolos sobre un papel absorbente limpio. No toque la superficie frontal del diente. Primer Lavado (Fila B) 6. Inserte el Peine en los pocillos de la fila B. Agite: inserte y retire vigorosamente el Peine en los pocillos por al menos 10 segundos para que quede bien lavado. Repita el lavado varias veces agitando en el trascurso de 2 minutos; mientras tanto, perfore el papel aluminio de la fila C. Después de 2 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido como en el paso 5c. * A menos que sea archivado para consulta posterior /S12/OR/CE 2
3 Unión del Conjugado (Fila C) 7. Inserte el Peine en los pocillos de la fila C. Mezcle como en el paso 5a. Programe el cronómetro para 20 minutos. Perfore el papel aluminio de la fila D. Después de 20 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido. Segundo Lavado (Fila D) 8. Inserte el Peine en los pocillos de la fila D. Agite repetidamente durante 2 minutos, como en el paso 6. Mientras tanto, perfore el papel aluminio en la fila E. Después de 2 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido. Tercer Lavado (Fila E) 9. Inserte el Peine en los pocillos de la fila E. Agite repetidamente durante 2 minutos. Mientras tanto, perfore el papel aluminio de la fila F. Después de 2 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido. Reacción de Color (Fila F) 10. Inserte el Peine en los pocillos de la fila F. Mezcle. Programe el cronómetro para 10 minutos. Después de 10 minutos, retire el Peine. Detención de la Reacción (Fila E) 11. Inserte de nuevo el Peine en la fila E. Después de un minuto, retire el Peine y déjelo secar al aire. Almacenamiento de Partes No Usadas del Kit Bandeja de Desarrollo Si no usó todos los pocillos de la Bandeja de Desarrollo, puede almacenarla para ser usada posteriormente: Selle los pocillos usados con cinta adhesiva ancha a fin de que nada se derrame fuera de los pocillos, incluso en caso de que la Bandeja de Desarrollo sea volcada. Otros Materiales del Kit Vuelva a colocar la(s) Bandejas(s) de Desarrollo, Peine (s), perforador, diluyente de la muestra, controles e instrucciones en la caja original del kit y almacene a temperaturas de 2 a 8 C. Resultados de la Prueba Validación A fin de confirmar el funcionamiento correcto de la prueba y demostrar que los resultados son válidos, deben cumplirse las siguientes tres condiciones (ver Figura 5): 1. El Positivo debe producir dos puntos en el diente del Peine. 2. El Negativo debe producir un punto superior ( Interno). El punto inferior no aparece o aparece muy ténuemente, sin afectar la interpretación de los resultados. 3. Cada muestra analizada debe producir un punto superior ( Interno). Si cualquiera de las tres condiciones no se cumple, los resultados de la prueba no son válidos y las muestras y controles deben ser reexaminados. Positivo Negativo Resultados Inválidos Figura 5. Validación de la Prueba Interpretación Cualitativa de los Resultados Lectura Cualitativa Compare la intensidad del punto inferior de cada diente de muestra con la del punto inferior del diente del Positivo (Figura 6). Un punto con intensidad mayor que o igual a la del Positivo indica la presencia de anticuerpos IgG contra el virus de rubéola. Un punto con intensidad menor que la del Positivo es considerado como un resultado negativo. Resultado Positivo Negativo Figura 6. Resultados de la Prueba Presencia de anticuerpos IgG contra el virus de rubéola Interpretación Semicuantitativa por Lectura Visual El nivel de IgG anti-rubéola en cada muestra puede ser evaluado comparando la intensidad del color del punto inferior en cada diente, con la escala de color del CombScale suministrado con el kit. Esto se hace como sigue (Figura 7): Calibrar el CombScale Orgenics CombScale For/Pour/Para/Für RUBELLA IgG IU/mL 15 C WINDOW/NUANCLER/VENTANA/FENSTER Figura 7. CombScale 1. Calibre el CombScale. Coloque el punto inferior en el diente del Positivo bajo la intensidad de color más similar en la escala de colores. Ajuste la regla hasta que aparezca la lectura "15; C+" en la ventanilla sobre la intensidad de color seleccionada. 2. Lea los resultados sin cambiar la posición calibrada de la regla. Compare la intensidad de color de cada punto inferior con la intensidad más similar en la escala de colores. Registre el valor indicado en la ventanilla (en IU/ml) sobre esa intensidad como el título aproximado de IgG anti- rubéola para la muestra correspondiente. * Basado en el 1er Estándar Internacional de la OMS para Inmunoglobulina humana anti-rubèola código RUBI Documentación de los Resultados Debido a que el color que aparece en los Peines es estable, es posible archivar los Peines para consulta posterior. Limitaciones Como ocurre con otras pruebas ideadas para ser usadas en diagnósticos in vitro, los resultados de esta prueba deben ser evaluados en relación con todos los síntomas, historial clínico y otras pruebas de laboratorio del paciente. Características del Ensayo* La sensibilidad y especificidad del kit ImmunoComb II Rubella IgG fueron evaluadas en un panel de 223 muestras de suero y comparado con una prueba ELISA diferente con un umbral de detección de 15 IU/ml. Los resultados son resumidos en la Tabla 1. Tabla 1. Resultados de la Prueba Prueba de ImmunoComb II Rubella IgG Referencia Positivo Negativo Positivo Negativo 0 97 Se calcularon las características del ensayo, encontrándose los siguientes reultados: Sensibilidad 100 % Especificidad 100 % Repetibilidad Diez peines fueron escogidos al azar de varias partes de un lote de producción. Un suero positivo fue analizado 12 vecesen estos 10 peines. En todos los peines se observó el mismo título de Rubella IgG. Reproducibilidad Tres muestras fueron analizadas en peines tomados de tres lotes de producción diferentes. Las muestras fueron analizadas por duplicado. En todos los peines se observó el mismo título de Rubella IgG. Reacción cruzada No se encontró significativa reacción cruzada con muestras positivas para Toxoplasma y CMV. Interferencia Interferencia con muestras hemolisadas (hemoglobina hasta 10 mg/ml), lipémicas (colesterol hasta mg/dl; triglicéridos 381 mg/dl) bilirrubina alta (hasta 20 mg/dl) no fue significativo. Bibliografía Chernesky MA, Mahony JB Rubella Virus. In: Balows A, Hausler WJ, Herrmann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ, eds. Manual of * Datos detallados disponibles /S12/OR/CE 3
4 Clinical Microbiology, Fifth edition. American Society for Microbiology, Washington, DC. pp Enders G Problems of Rubella diagnosis by various IgM techniques and the need for test combinations. In: Habermehl K-O, ed. Rapid Methods and Automation in Microbiology and Immunology. Springer Verlag, Berlin, pp Evans AS, Brachman JS, eds. Viral Infections of Humans. Epidemiology and. 3 rd edition. New York, NY: Plenum Medical Book Company, Frenkel LM, Nielsen K, Garakian A, et al. A search for persistent rubella virus infection in persons with chronic symptoms after rubella and rubella immunization and in patients with juvenile rheumatoid arthritis. Clin Infect Dis 1996; 22: Mellinger AK, Cragan JD, Atkinson WL, et al. High incidence of conjenital rubella syndrome after a rubella outbreak. Pediatr Infect Dis J 1995; 14: Leyenda de los símbolos CARD PLATE CONTROL + CONTROL - PERFORATOR ImmunoComb tarjeta Bandejas de Desarrollo positivo negativo Perforador Consulte las instrucciones de uso Atención,ver instrucciones de uso IVD Producto sanitario para diagnóstico in vitro Limite de temperatura Σ n Contenido suficiente para n ensayos Fabricante Representante autorizado en la Comunidad Europea REF DIL COMBSCALE LOT Número de catálogo Diluyente de la muestra CombScale Código de lote Fecha de caducidad Número de serie Version: /S12/OR/CE (04/2008) /S12/OR/CE 4
5 Resumen de los Principales Procedimientos de la Prueba Preincubación de la Bandeja de Desarrollo: 3 hrs a temperatura ambiente, o 20áminutos a 37 C Tomar y prediluir muestras y controles Agregar muestras y controles prediluídos a la fila A. Mezclar Sacar el Peine del empaque 5 6 Insertar el Peine y mezclar en Perforación de la fila B fila A. Incubar. Absorber líquido adherido a los dientes 7 8 Insertar Peine y agitar en fila B. Incubar Luego de mezclar/agitar e incubar en filas C,D y E Reacción de color en fila F Resultados Resumen del Procedimiento de la Prueba Las instrucciones abreviadas a continuación son para las personas experimentadas en el uso del kit ImmunoComb II Rubella IgG. (Para instrucciones detalladas, favor referirse al texto completo) 1. Lleve todas las muestras y reactivos a temperatura ambiente y realice la prueba a temperatura ambiente. 2 Prediluya 10 µl de cada muestra y control con 100 µl de diluyente de la muestra. 3. Vierta 25 µl de cada muestra y control prediluídos en los pocillos de la fila A de la Bandeja de Desarrollo, y mezcle. 4. Inserte el Peine en la fila A y continúe como se describe en la Tabla 1: Tabla 1. Resumen del procedimiento de la prueba Etapa Fila Proceda como se indica 1 Reacción antígeno-anticuerpo A Mezcle; incube 30 minutos; absorba. Lavado B Agite; incube 2 minutos; absorba. Unión del conjugado C Mezcle; incube 20 minutos; absorba. Lavado D Agite; incube 2 minutos; absorba. Lavado E Agite; incube 2 minutos; absorba. Reacción de color F Mezcle; incube 10 minutos. Detención de la Reacción E Incube 1 minuto; seque al aire. Manera de romper el peine /S12/OR/CE 5
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