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- Mario Martínez Alvarado
- hace 6 años
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1 BIO-FLASH Rubella IgG tests BIO-FLASH Rubella IgG es un inmunoensayo quimioluminiscente de dos pasos totalmente automatizado para la determinación cuantitativa de anticuerpos IgG frente al virus de la rubéola en suero o plasma humano con el instrumento BIO-FLASH. Sumario La rubéola, también denominada Sarampión alemán es una enfermedad contagiosa provocada por un togavirus del género Rubivirus. Suele ser leve y benigna cuando afecta a adultos. La rubéola se caracteriza por un exantema maculopapular, fiebre, malestar general y linfadenopatía. Sin embargo, durante el embarazo el virus puede tener efectos potencialmente devastadores sobre el feto en desarrollo, sobre todo durante los tres primeros meses del embarazo. 1 El virus de la rubéola puede ocasionar una infección intrauterina y provocar la muerte del feto, el aborto espontáneo, o diversas anomalías congénitas. Se estima que en todo el mundo nacen cada año más de 100 niños con el síndrome de la rubéola congénita. 2 La identificación e inmunización de las mujeres susceptibles resulta vital para la prevención de dicho síndrome. La persistencia de anticuerpos IgG frente al virus de la rubéola, ya sea por infección natural o por vacunación, ha demostrado ser eficaz en la protección contra la infección. 3-6 El cribado de anticuerpos contra la rubéola mediante métodos serológicos establecerá el estado inmunológico de los sujetos en relación a su resistencia o susceptibilidad a la infección primaria por rubéola. El diagnóstico preciso de la infección primaria aguda por rubéola durante el embarazo es fundamental y requiere ensayos serológicos, ya que un número significativo de casos son subclínicos. 1 Principio Cuando las micropartículas paramagnéticas de BIO-FLASH Rubella IgG se mezclan e incuban con la muestra, si ésta presenta anticuerpos específicos anti-rubéola, éstos se combinan con los antígenos de la rubéola que recubren las micropartículas. Después de una separación magnética y lavado para eliminar la muestra residual, se añade un trazador consistente en un anticuerpo monoclonal anti-igg humana marcado con isoluminol que se une a las IgG anti-rubéola capturadas por las micropartículas. Tras una segunda incubación, separación magnética y otro lavado, se añaden los reactivos que activan la reacción quimioluminiscente. El luminómetro del BIO-FLASH mide la luz emitida como unidades relativas de luz (URL) que son directamente proporcionales a la concentración de IgG anti-rubéola de la muestra. El BIO-FLASH utiliza un método de reducción de datos con ajuste a una curva logística de 4 parámetros (4PLC) para generar una Curva de Calibración Maestra (CCM). Esta curva viene predefinida, depende del lote y se almacena en el instrumento a través del código de barras del cartucho. Con la medición de los calibradores (que se suministran en un kit aparte), la CCM predefinida se transforma en una Curva de Calibración de Trabajo (CCT) nueva y específica para el instrumento. Las concentraciones de los calibradores están incluidas en los códigos de barras de los tubos de calibradores. Esquema de la reacción: LEER CAMBIOS SOMBREADOS Activadores (Triggers) Activadores (Triggers) URL Partícula magnética Muestra Trazador Emisión de luz
2 Componentes Cartucho de reactivos El kit BIO-FLASH Rubella IgG contiene un cartucho de reactivos para 50 determinaciones (REF ). Nota: El diseño del cartucho está protegido por patente (US D565,741 / Diseño CE ) Composición del cartucho de reactivos: El cartucho se compone de 4 viales que contienen: A. 1 vial cilíndrico de suspensión de micropartículas recubiertas con antígeno de rubéola en tampón fosfato. Contiene < 0,1% de azida sódica. B. 1 vial de tampón de ensayo. Contiene < 0,1% de azida sódica. C. 1 vial opaco de trazador que consiste en anticuerpo monoclonal murino anti-igg humana marcado con isoluminol. Contiene < 0,1% de azida sódica. D. 1 vial vacío. Preparación Véase la figura siguiente. Cartucho: las micropartículas sedimentan durante su transporte y almacenamiento, por lo que se tienen que mezclar para volverlas a resuspender. La primera vez que vaya a utilizar el cartucho, inviértalo suavemente 30 veces sin que se forme espuma (las burbujas pueden hacer que los sensores de líquido del instrumento den lecturas erróneas). Compruebe que las micropartículas se hayan resuspendido totalmente. Si no es así, siga invirtiendo el cartucho hasta que se resuspendan en su totalidad. Si las micropartículas no se resuspenden o detecta que el precinto de los reactivos está roto, NO UTILICE EL CARTUCHO. Una vez resuspendidas las micropartículas, sitúe el cartucho sobre una superficie sólida y retire con cuidado la lengüeta roja de seguridad para el transporte. Manteniendo el cartucho en la superficie sólida, apriete las dos pestañas situadas a los lados del tapón perforador (parte gris) y presione la parte superior del cartucho hasta que quede en posición de bloqueo. Una vez en posición de bloqueo, las pestañas tienen que quedar ocultas. No invierta el cartucho abierto. Deje reposar el cartucho durante 5 minutos antes de cargarlo en el instrumento. Una vez cargado el cartucho, el instrumento mezcla su contenido de forma automática a intervalos periódicos.
3 Precauciones Los reactivos BIO-FLASH son para diagnóstico IN VITRO. Uso exclusivo para profesionales. La azida sódica puede reaccionar con tuberías y desagües de plomo o cobre dando lugar a azidas metálicas altamente explosivas. Al desechar los restos de reactivos, deje correr agua abundante. ATENCIÓN: MATERIAL DE RIESGO BIOLÓGICO. Deseche todos los materiales usados en recipientes adecuados para material biocontaminante. Por favor, no reutilice ni reintroduzca reactivos en los cartuchos o viales. Clase de peligro No clasificado. Indicaciones de peligro Ninguna. Consejos de prudencia P280: Llevar guantes/prendas/gafas/máscara de protección. P : EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando. Recolección y conservación de las muestras Usar suero fresco (también se pueden utilizar tubos con gel separador de suero) o plasma (EDTA, Li-heparina, Li-heparina en tubo con gel separador, Na-heparina y Na-citrato). Otros anticoagulantes deben ser comprobados antes de utilizarse. Los anticoagulantes líquidos como el Na-citrato ejercen un efecto de dilución y pueden reducir la concentración de muestras de pacientes. Las muestras no deben ser inactivadas por calor. Las partículas en suspensión deben eliminarse por centrifugación. En las directrices CLSI H18-A3 y H21-A5 encontrará más información sobre la manipulación, el transporte, el procesamiento y la conservación de las muestras. Suero Las muestras de suero pueden ser conservadas entre 2-8 C durante 8 días. Si es por un período de tiempo más largo, deben ser congeladas a una temperatura igual o inferior a -20 C. Las muestras se pueden congelar/descongelar hasta 3 veces. Mezclar bien después de descongelarlas. Compruebe que no haya burbujas en las muestras y, en caso contrario, elimínelas en su totalidad antes del análisis. Plasma Las muestras de plasma pueden ser conservadas entre 2-8 C durante 8 días. Si es por un período de tiempo más largo, deben ser congeladas a una temperatura igual o inferior a -20 C. Descongelar el plasma a 37 C. Descongelar las muestras sólo una vez. Mezclar bien después de descongelarlas. Compruebe que no haya burbujas en las muestras y, en caso contrario, elimínelas en su totalidad antes del análisis. Volumen de muestra El volumen de muestra necesario para realizar una única prueba con BIO-FLASH Rubella IgG varía en función del tipo de recipiente que se utilice. Una prueba requiere al menos 24 µl más el volumen muerto, que es de 200 µl si se utiliza la copa de muestra recomendada (REF ). Otros materiales Los siguientes materiales no se suministran con el cartucho de reactivos y deben adquirirse por separado. REF REF BIO-FLASH Rubella IgG Calibrators (Calibradores) BIO-FLASH Rubella IgG Controls (Controles) Lea detenidamente las instrucciones correspondientes si desea más información. No utilice otros calibradores. La información que necesita el instrumento BIO-FLASH para calibrar el ensayo BIO-FLASH Rubella IgG está incluida en los códigos de barras de los viales. Utilizar controles de otros fabricantes puede dar lugar a resultados imprevistos. Asegúrese de que en el instrumento BIO-FLASH haya una cantidad suficiente de los siguientes consumibles antes de procesar muestras, calibradores o controles: REF BIO-FLASH Cuvettes (Cubetas) Nota: El diseño de las cubetas está protegido por patente (US D560,816 / Diseño CE ) REF BIO-FLASH Triggers (Activadores) REF REF BIO-FLASH System Rinse (Solución del sistema) BIO-FLASH Sample Diluent (Diluyente de las muestras)
4 Instrumento / realización del ensayo En el Manual del Usuario del BIO-FLASH encontrará las instrucciones completas para realizar el ensayo. Calibración El código de barras del cartucho contiene una Curva de Calibración Maestra (CCM) que es válida para el lote de reactivos. Sin embargo, para todos los reactivos se necesita una Curva de Calibración de Trabajo (CCT), que es específica para cada lote y válida hasta la fecha de caducidad de éste. Se debe obtener una nueva CCT cuando los resultados de los controles salgan fuera del rango de aceptación o cuando se hayan realizado ajustes en el instrumento. Lea detenidamente el Manual del Usuario del BIO-FLASH para configurar una CCT. Control de calidad Para realizar un programa completo de control de calidad se recomiendan tres niveles de control. Los controles BIO-FLASH Rubella IgG negativo, positivo y positivo alto se han diseñado para dicho programa. Se recomienda que cada laboratorio establezca su propia media y desviación estándar y un programa de control de calidad para monitorizar sus resultados. Los controles se deben analizar al menos cada 24 horas por día de utilización. Si los controles están fuera de rango, puede resultar necesario recalibrar el instrumento. En el Manual del Usuario del instrumento encontrará más información. Para la identificación y resolución de situaciones anormales de control de calidad, consulte Westgard et al. 7 Conservación y estabilidad Los reactivos que no se hayan abierto se mantienen estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del cartucho si se conservan entre 2-8 C en posición vertical. Una vez abierto, la estabilidad del cartucho cargado en el instrumento BIO-FLASH o guardado a 2-8 C, es de 5 semanas. Trazabilidad de calibradores y controles Los valores se expresan en UI/mL y se asignaron mediante múltiples ensayos con el instrumento BIO-FLASH utilizando lotes específicos de reactivos, frente a estándares internos referenciados al estándar internacional de la OMS para inmunoglobulina humana anti-rubéola (código NIBSC: RUBI-1-94). Interpretación de resultados La cantidad de analito en cada muestra se determina a partir de la luz emitida (URL) mediante interpolación en la Curva de Calibración de Trabajo almacenada. La determinación cuantitativa de las IgG anti-rubéola con el ensayo BIO-FLASH Rubella IgG ayuda a determinar el estado inmunitario del paciente: Las muestras con una concentración < 10,0 UI/mL se consideran no reactivas (negativas). Las muestras con una concentración 10,0 y < 15,0 UI/mL se consideran indeterminadas (zona gris). Las muestras que se interpreten como indeterminadas deben reanalizarse. Si al reanalizarse se obtiene un resultado indeterminado, se debe reportar como tal y debe realizarse otro ensayo con un método alternativo o debe obtenerse y analizarse una segunda muestra. Las muestras con una concentración 15,0 UI/mL se consideran reactivas (positivas). En aquellos pacientes en que se sospecha de seroconversión, debe recogerse una segunda muestra de suero entre 2 y 4 semanas después de la primera y evaluar ambas de forma conjunta para anticuerpos IgG anti-rubéola. Un aumento significativo en la concentración de anticuerpos IgG frente al virus de la rubéola entre la primera y la segunda muestra de suero puede considerarse como indicativo de seroconversión a causa de infección o vacunación recientes. 8 Si se sospecha de una infección reciente, es altamente recomendable analizar la muestra para anticuerpos IgM frente a rubéola. Un resultado negativo de IgG anti-rubéola no descarta una infección reciente. Dado que los anticuerpos IgG anti-rubéola pueden manifestarse ligeramente más tarde que los anticuerpos IgM, se recomienda analizar igualmente los anticuerpos IgM anti-rubéola durante el seguimiento serológico de las mujeres embarazadas. El ensayo BIO-FLASH Rubella IgM REF resulta adecuado para esta finalidad. Limitaciones El resultado de una única muestra no es suficiente para diagnosticar una infección primaria por rubéola. Por tanto, además de los resultados del BIO-FLASH Rubella IgG deben tenerse en cuenta otros datos como, por ejemplo, la sintomatología, la historia clínica, los resultados de otras pruebas, y demás información relevante.
5 Resultados esperados En países con programas de vacunación más del 90% de los adultos jóvenes ya son inmunes a la rubéola, ya sea por infección natural o vacunación. 9 Los anticuerpos IgG específicos son detectados en la infección primaria o tras la vacunación, cuando normalmente el resultado es claramente positivo (más de dos veces el valor umbral) o en una infección anterior, cuando los resultados suelen ser positivos débiles. Características funcionales NOTA: los datos siguientes son representativos; los resultados en experimentos aislados pueden variar respecto a estos datos. Comparación de métodos BIO-FLASH Rubella IgG se evaluó en estudios comparativos con otros ensayos comerciales. Evaluación interna Se analizó con BIO-FLASH Rubella IgG un panel de muestras de distinta procedencia que incluía sueros positivos y negativos de anticuerpos IgG anti-rubéola y los resultados se compararon con los obtenidos con un método de EIA Rubella IgG comercial. En los cálculos no se tuvieron en cuenta los resultados indeterminados. Método de referencia BIO-FLASH Rubella IgG IND NEG POS Total IND NEG POS Total Se obtuvieron los siguientes resultados iniciales de sensibilidad y especificidad relativas y concordancia global: Sensibilidad relativa Especificidad relativa Concordancia global ,0% 98,5% a 100,0% 96,8% 88,8% a 99,6% 99,3% 97,7% a 99,9% El mismo panel fue probado con otros métodos comerciales de rubéola IgG y se resolvieron las muestras discrepantes. El resumen de los resultados de consenso, excluidas las 10 muestras indeterminadas con BIO-FLASH Rubella IgG y las 3 muestras para las que no se llegó a un consenso, se muestra en la siguiente tabla: Consenso BIO-FLASH Rubella IgG NEG POS Total NEG POS Total Frente al consenso se obtuvieron los siguientes resultados de sensibilidad, especificidad y concordancia global: Sensibilidad vs. consenso Especificidad vs. consenso Concordancia vs. consenso ,0% 98,5% a 100,0% 98,4% 91,2% a 100,0% 99,7% 98,2% a 100,0% Evaluación externa Se realizó una evaluación externa en el Servei de Microbiologia del Hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona (España). Las muestras fueron caracterizadas mediante otro método comercial, MEIA Rubella IgG, y analizadas con BIO-FLASH Rubella IgG. En los cálculos no se tuvieron en cuenta los resultados indeterminados. Método de referencia BIO-FLASH Rubella IgG IND NEG POS Total IND NEG POS Total
6 Se obtuvieron los siguientes resultados iniciales de sensibilidad y especificidad relativas y concordancia global: Sensibilidad relativa Especificidad relativa Concordancia global ,8% 96,6% a 99,8% 97,2% 90,3% a 99,7% 98,5% 96,5% a 99,5% Las muestras discrepantes fueron analizadas con un método CLIA Rubella IgG comercial y los dos falsos positivos se resolvieron como negativo o indeterminado a favor de BIO-FLASH Rubella IgG. Tras el ensayo adicional se obtuvieron los siguientes resultados finales de sensibilidad, especificidad y concordancia global: Sensibilidad final Especificidad final Concordancia global final ,8% 96,6% a 99,8% 100,0% 94,9% a 100,0% 99,1% 97,3% a 99,8% Panel SeraCare-BBI Se analizó el panel comercial de BBI panel de título mixto anti-rubéola PTR201, que se compone de 25 muestras caracterizadas. Los resultados del ensayo BIO-FLASH Rubella IgG concordaron en todos los casos con el consenso de resultados de la mayoría de fabricantes. Panel CDC El panel de sueros de rubéola IgG de la CDC, compuesto por 82 muestras de suero positivas y 18 muestras de suero negativas fue analizado con el ensayo BIO-FLASH Rubella IgG con un resultado de sensibilidad y especificidad del 100,0%. En los cálculos no se tuvieron en cuenta cuatro resultados indeterminados con BIO-FLASH. Precisión Se evaluó, conforme a las directrices CLSI EP05-A, la precisión intra-ensayo y total (ensayo a ensayo y día a día) en múltiples ensayos. Los resultados se resumen en la tabla siguiente: Media (UI/mL) CV% (Intra-ensayo) CV% (Total) Control negativo 2,8 5,4 7,5 Control positivo 25,1 3,6 7,6 Control positivo alto 81,0 5,3 9,5 Alrededor del valor de corte 8,6 3,6 6,3 Reproducibilidad Se evaluó la reproducibilidad entre réplicas, entre lotes y entre instrumentos. Los resultados se muestran en la tabla siguiente: Pendiente Intersección R Réplica 2 vs. Réplica ,98 0,96 a 1,01 0,11 0,00 a 1,18 1,00 1,00 a 1,00 Lote 2 vs. Lote ,98 0,95 a 1,03 0,00-2,48 a 0,16 0,99 0,99 a 1,00 Instrumento 2 vs. Instrumento ,96 0,93 a 0,97 0,19 0,00 a 0,58 1,00 0,99 a 1,00 Interferencias Estudios conforme a las directrices CLSI EP7-A han demostrado que las siguientes sustancias potencialmente interferentes no alteran los resultados de BIO-FLASH Rubella IgG: Sustancia potencialmente interferente Concentración % Interferencia Hemoglobina 500 mg/dl 10 Bilirrubina indirecta 18 mg/dl 10 Bilirrubina directa 18 mg/dl 10 Triglicéridos 1300 mg/dl 10 Reactividad cruzada Cuando se analizaron 109 muestras con potencial de producir reacción cruzada con el ensayo BIO-FLASH Rubella IgG y se compararon los resultados con ensayos comerciales de Rubella IgG se evidenció la siguiente concordancia:
7 Reacción cruzada potencial Concordancia anti-toxo IgG (anticuerpos frente a Toxoplasma gondii) 3/3 anti-cmv IgG (anticuerpos frente a citomegalovirus) 16/16 anti-hiv (anticuerpos frente al virus de la inmunodeficiencia humana) 6/6 HAMA (anticuerpo humano antimurino) 4/4 SLE (lupus eritematoso sistémico) 1/1 ANA (anticuerpos antinucleares) 10/10 anti-ebv (anticuerpos frente al virus Epstein-Barr) 6/6 anti-pv B19 (anticuerpos frente a Parvovirus B19) 6/6 anti-hsv 1 (anticuerpos frente al virus Herpes Simplex 1) 5/5 anti-vzv (anticuerpos frente al virus de la Varicela Zoster) 5/5 Paraproteínas IgG e IgM 6/6 IgG e IgM elevadas 4/5 Anticuerpos heterófilos 5/5 RF (Factor Reumatoide) 10/10 Mujeres embarazadas (multíparas incluidas) 21/21 Límite de detección Conforme a las directrices CLSI EP17-A, el límite de detección (LD) se sitúa en 0,3 UI/mL. Límite de cuantificación Conforme a las directrices CLSI EP17-A, el límite de cuantificación (LC) se sitúa en 0,4 UI/mL. Linealidad El ensayo BIO-FLASH Rubella IgG es lineal entre 0,4 y 500 UI/mL conforme a las directrices CLSI EP6-A. Sin embargo, la linealidad puede ampliarse hasta 7500 UI/mL mediante dilución si se habilita la opción de re-run automático. Consulte el Manual del Usuario del BIO-FLASH para habilitar la opción de re-run automático.
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