HAV IgM. Introducción

Transcripción

1 HAV IgM S punto inferior anticuerpos de conejo anti-igm humano. La Bandeja de Desarrollo tiene 6 filas (A-F) de 12 pocillos. Cada fila contiene una solución reactiva lista para ser usada en cada etapa del ensayo. La prueba es realizada en etapas, pasando el Peine de una fila a otra, con un período de incubación en cada etapa. Al comienzo de la prueba, las muestras de suero o plasma se prediluyen a 1:50 y se agregan al diluyente en los pocillos de la fila A de la Bandeja de Desarrollo. El Peine luego es insertado en los pocillos de la fila A. El IgM humano es capturado por los anticuerpos anti-igm en los puntos inferiores de los dientes del Peine (Figura 1). Los componentes no unidos son lavados en la fila B. En la fila C, anticuerpos IgM anti-hav capturados en los dientes reaccionan con el antígeno de HAV. Simultáneamente, el antígeno HAV también se une al anticuerpo anti-hav en el punto superior ( Interno). En la fila D, el antígeno HAV unido reacciona con el anticuerpo anti- HAV monoclonal marcado con fosfatasa alcalina (). En la fila E los componentes no unidos son eliminados mediante un lavado. En la fila F, la fosfatasa alcalina unida reacciona con componentes cromogénicos. Los resultados pueden observarse como puntos azul grisáceo en la superficie del diente del Peine. α IgM humano anticuerpos humanos IgM HAV Captura de anticuerpos; 2 horas/37ºc Reacción HAV anti-hav; 30 min/37ºc conjugado α-hav Unión del conjugado anti-hav; 20 min/37ºc Código: Para uso diagnóstico in vitro solamente Uso Previsto Formato: 3 x 12 pruebas El kit ImmunoComb II HAV IgM es una prueba rápida para la detección cualitativa de anticuerpos IgM contra el virus de hepatitis A (HAV, según sus siglas en inglés) en el suero o plasma humano. Treinta y seis pruebas pueden ser realizadas con un kit. Introducción La Hepatitis A es una enfermedad frecuente en la población humana, causada por el virus de la hepatitis A (HAV). Luego de un período de incubación de 14 a 40 días, la infección de HAV se manifiesta más comunmente por ictericia debido a una inflamación aguda del hígado y el subsecuente incremento de la concentración de bilirrubina en la sangre. No se han registrado casos de infección crónica. La hepatitis A es endémica en todas partes del mundo. Su epidemiología está marcadamente influenciada por el nivel local de sanidad e higiene. La trasmisión se produce por vía fecal-oral. Una alta cantidad de virus (hasta 108 unidades infecciosas por gramo) son excretadas en las heces unos cuantos días antes de que aparezcan los síntomas clínicos o la ictericia. La diseminación del virus se realiza a través del contacto directo o el consumo de alimentos o aguas contaminados. La profilaxis de la hepatitis A se logra actualmente por medio de la inmunización pasiva con inmunoglobulinas anti-hav humanas. Además, recientemente han sido desarrolladas vacunas de HAV. Varias causas de origen viral (por ejemplo, virus de hepatitis B y hepatitis C) o no-viral pueden inducir hepatitis. Por consiguiente, es muy difícil diagnosticar la infección de HAV en base a los síntomas clínicos y la evaluación bioquímica de las funciones hepáticas únicamente. El inmunodiagnóstico, sin embargo, permite la identificación del agente etiológico. Los anticuerpos de IgM al HAV son producidos en la etapa temprana de infección de HAV y persisten durante la fase aguda de la enfermedad. La detección de IgM anti-hav usando el kit ImmunoComb II HAV IgM permite el diagnóstico seguro de la infección aguda de HAV. Principio de la Prueba La prueba ImmunoComb II HAV IgM es un ensayo inmuno-enzimático de fase sólida (EIA) basado en el principio de la inmunocaptura. La fase sólida es un Peine con 12 proyecciones ("dientes"). Cada diente está sensibilizado en dos áreas activas: punto superior anticuerpo monoclonal contra virus de hepatitis A ( Interno) sustrato cromogénico Reacción enzimática de color; 10 min/37ºc /S12/OR/CE 1 Figura 1. Principio de la Prueba El kit incluye un Positivo (IgM anti-hav) y un Negativo, que deben incluirse cada vez que se realiza la prueba. Al término de ésta, el diente usado con el Positivo debe mostrar 2 puntos de color azul grisáceo. El diente usado con el Negativo debe mostrar el punto superior y un punto inferior muy ténue o la ausencia del mismo. El punto superior debe también aparecer en todos los demás dientes, a fin de confirmar que el kit funciona apropiadamente y que la prueba fue realizada de manera correcta. Contenido del Kit Peines El kit contiene 3 Peines de plástico. Cada Peine tiene 12 dientes, un diente para cada prueba (Figura 2). Cada diente está sensibilizado en dos áreas reactivas: punto superior anticuerpo monoclonal contra el virus hepatitis A ( Interno) punto inferior anticuerpos de conejo anti-igm humano ImmunoComb II Figura 2. Peine Interno Anti-IgM humano Los Peines son suministrados en empaques de aluminio que contienen una bolsa desecante. Bandejas de Desarrollo El kit contiene 3 bandejas de desarrollo cubiertas con papel de aluminio. Cada Bandeja de Desarrollo (Figura 3) contiene todos los reactivos necesarios para la prueba. La Bandeja de Desarrollo consiste de 6 filas (A-F) de 12 pocillos cada una. Los contenidos de cada fila son los siguientes: Fila A diluyente de la muestra Fila B solución de lavado Fila C antígeno HAV

2 Fila D Fila E Fila F anticuerpo anti-hav monoclonal marcado con fostatasa alcalina solución de lavado solución de sustrato cromogénico conteniendo 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) y nitro azul tetrazolio (NBT) Figura 3. Bandeja de Desarrollo Positivo 1 frasco (tapa roja) de 0,2 ml de plasma humano inactivado con calor, conteniendo anticuerpos IgM anti-hav. Negativo 1 frasco (tapa verde) de 0,2 ml de plasma humano inactivado con calor, negativo para anticuerpos anti-hav. Diluyente de la muestra 1 frasco de 20 ml de diluyente. Perforador para perforar el papel de aluminio que cubre los pocillos de la Bandeja de Desarrollo. Seguridad y Precauciones Todos los materiales de origen humano usados en la preparación del kit pasaron pruebas que demostraron que no son reactivos al antígeno de superficie de la hepatitis B, así como a anticuerpos de HIV o el virus de la hepatitis C. Ya que ningún método puede garantizar por completo la ausencia de contaminación viral, todas las soluciones de referencia y todas las muestras humanas deben ser manejadas como si fueran potencialmente infecciosas. Use guantes quirúrgicos y ropas de laboratorio. Siga los procedimientos de laboratorio aceptados para el trabajo con suero o plasma humano. No use la pipeta aspirando con la boca. Deseche todas las muestras, Peines usados *, Bandejas de Desarrollo y otros materiales usados con el kit como desechos biocontaminantes. No mezcle reactivos de lotes diferentes. No use el kit después de la fecha de caducidad. Conservación y estabilidad del kit El kit es enviado a 2-8º C. Durante el transporte el kit puede ser conservado a menos de 30º C durante cortos períodos de tiempo que no excedan de 48 horas. Los controles internos indican que el kit no ha sido dañado durante el transporte. Conservar el kit en su caja original a 2-8º C. No congelar el kit. Después de abrir el kit inicialmente, los componentes deben ser conservados a 2-8º C. El funcionamiento del kit después de su apertura inicial, es estable hasta la fecha de caducidad del mismo si se conserva a 2-8º C. Después del uso inicial, el peine y la bandeja de reactivos no pueden ser utilizados más de tres veces. Manejo de las Muestras Es posible usar suero o plasma en la prueba. Las muestras pueden ser almacenadas por 7 días a temperaturas de 2 a 8 C antes de la prueba. Para almacenar las muestras por más de 7 días, congélelas a -20 C o a temperaturas más bajas. Después de descongelar las muestras de suero, centrifúguelas. Use el sobrenadante para la prueba. Evite congelar y descongelar repetidamente. Los anticoagulantes como heparina, EDTA y citrato sódico no han mostrado tener efecto sobre los resultados del test. Procedimiento de la Prueba Equipo Necesario Pipetas de precisión ajustables con puntas desechables con capacidad de 10 µl, 25 µl y 490 µl Tijeras Cronómetro de laboratorio o reloj Microtubos Preparación de la Prueba Ponga todos los reactivos y las muestras a temperatura ambiente y realice la prueba a temperatura ambiente(22-26 C). * A menos que sea archivado para consulta posterior Preparación de la Bandeja de Desarrollo 1. Incube la Bandeja de Desarrollo en una incubadora a 37 C por 45 minutos. 2. Cubra la mesa de trabajo con papel absorbente, para ser desechado como desecho biocontaminante al concluir la prueba. 3. Mezcle los reactivos sacudiendo la Bandeja de Desarrollo. Nota: No retire la cubierta de aluminio de la Bandeja de Desarrollo; rómpala usando la punta desechable de la pipeta o el perforador, cuando las instrucciones de la prueba así lo indiquen. Preparación del Peine Precaución: Para asegurar el funcionamiento apropiado de la prueba, no toque los dientes del Peine. 1. Abra el empaque de aluminio por el borde perforado. Retire el Peine. 2. Es posible utilizar todo el Peine y la Bandeja de Desarrollo o una parte. Para utilizar parte del Peine: a. Determine cuantos dientes va a necesitar para analizar las muestras y los controles. Se necesita un diente para cada prueba. Cada diente tiene impreso el número del código del kit, "57", para permitir la identificación de los dientes sueltos. b. Doble y rompa verticalmente el Peinte, o córtelo con tijeras (ver Figura 4) para separar el número requerido para las pruebas (Nro. de pruebas mas dos controles). c. Vuelva a meter la porción no utilizada del Peine en el empaque de aluminio (con la bolsa desecante). Cierre bien el empaque (con un clip, por ejemplo) para mantenerlo seco. Almacene el Peine en la caja original del kit a temperaturas de 2 a 8 C para su uso posterior. ImmunoComb II Figura 4. Fraccionamiento del Peine Instrucciones de la Prueba Predilución de Muestras y es 1. Para cada muestra y control, vierta 490 µl de diluyente de la muestra en un microtubo. 2. A cada microtubo agregue 10 µl de una muestra o del Positivo o del Negativo suministrados con el kit. Mezcle vaciando y rellenando repetidamente la solución. Captura de anticuerpo (FIla A de la Bandeja de Desarrollo) Nota: Incube a 37 C. Las etapas de lavado deben llevarse a cabo a temperatura ambiente (22 26 C) 3. Pipetee 25 µl de una muestra prediluída. Perfore la cubierta de aluminio de un pocillo de la fila A con la punta de la pipeta o el perforador y vacíe la muestra en el fondo del pocillo. Mezcle la solución rellenando y vaciando el pocillo. Deseche la punta de la pipeta. 4. Repita el paso 3 para las otras muestras prediluídas y los dos controles prediluídos. Use un nuevo pocillo en la fila A y cambie la punta de la pipeta para cada muestra o control. 5. a. Inserte el Peine (con el lado impreso hacia Ud.) en los pocillos de la fila A que contienen las muestras y los controles. Mezcle: Retire e inserte el Peine en los pocillos varias veces. b. Deje el Peine en la fila A e incube por 2 horas a 37 C. Programe el reloj. Antes de dos horas, perfore la cubierta de la fila B, utilizando el perforador. No abra más pozos de los necesarios. c. Al cumplirse las 2 horas, saque el Peine de la fila A. Absorba el líquido adherido a las puntas de los dientes apoyándolos sobre un papel absorbente limpio. No toque la superficie frontal del diente. Primer Lavado (FIla B) 6. Inserte el Peine en los pocillos en la fila B. Agite: retire e inserte vigorosamente el Peine en los pocillos por al menos 10 segundos para que quede bien lavado. Repita el lavado varias veces agitando en el transcurso de 2 minutos; mientras tanto, perfore el papel aluminio de la fila C. Después de dos minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido como en el paso 5c. Reacción Antígeno-Anticuerpo (Fila C) 7. Inserte el Peine en los pocillos de la fila C. Mezcle como en el paso 5a. Incube la Bandeja de Desarrollo por 30 minutos (programe el /S12/OR/CE 2

3 reloj) a 37 C. Perfore el papel aluminio de la fila D. Después de 30 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido. Unión del Conjugado (Fila D) 8. Inserte el Peine en los pocillos de la fila D. Mezcle. Incube la Bandeja de Desarrollo con el Peine por 20 minutos (programe el reloj) a 37 C. Perfore el papel aluminio de la fila E. Después de 20 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido. Segundo Lavado (Fila E) 9. Inserte el Peine en los pocillos de la Fila E. Agite repetidamente durante dos minutos, como en el paso 6. Perfore el papel aluminio de la fila F. Después de 2 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido. Reacción de Color (Fila F) 10. Inserte el Peine en los pocillos de la fila F. Mezcle. Incube la Bandeja de Desarrollo con el Peine por exáctamente 10 minutos (programe el reloj) a 37 C. Después de 10 minutos, retire el Peine. Detención de la Reacción (Fila E) 11. Inserte el Peine de nuevo en la fila E. Después de un minuto, retire el Peine y déjelo secar al aire. Almacenamiento de las Partes No Usadas del Kit Bandeja de Desarrollo Si no usó todos los pocillos de la Bandeja de Desarrollo, puede almacenarla para ser utilizada posteriormente: Selle los pocillos usados con una cinta adhesiva ancha a fin de que nada se derrame fuera de los pocillos, incluso en caso de que la Bandeja de Desarrollo sea volcada. Otros Materiales del Kit Vuelva a colocar la(s) Bandeja(s) de Desarrollo, Peine(s), perforador, controles e instrucciones en la caja original del kit y almacene a temperatura de 2 a 8 C. Resultados de la Prueba Validación A fin de confirmar el funcionamiento correcto de la prueba y demostrar que los resultados son válidos, deben cumplirse las siguientes cuatro condiciones (ver Figura 5): 1. El Positivo debe producir dos puntos en el diente del Peine. 2. El Negativo debe producir un punto superior ( Interno). El punto inferior puede no aparecer o aparecer ténuemente, sin afectar la interpretación de los resultados. 3. Cada muestra analizada debe producir un punto superior ( Interno). Si cualquiera de las cuatro condiciones no se cumplen, los resultados no son válidos y las muestras y controles deben ser reexaminados. Positivo Negativo Figura 5. Validación de la Prueba Resultados Inválidos Interpretación Cualitativa de los Resultados Interpretación Visual Compare la intensidad del punto inferior de cada diente de la muestra con la del punto inferior del diente del Positivo (Figura 6). Un punto con una intensidad major que o igual a la del Positivo indica la presencia de anticuerpos IgM anti-hav. La ausencia del punto o su presencia con menor intensidad que la del Positivo debe ser considerada como un resultado negativo. Muestra Positivo Resultado Negativo Presencia de anticuerpos IgM anti-hav Figura 6. Resultados de las Pruebas Documentación de los Resultados Debido a que el color que aparece en el Peine es estable, los Peines pueden ser archivados para consulta posterior. Limitaciones El kit ImmunoComb II HAV IgM es una prueba de tamizaje. Los resultados indican que una muestra es reactiva a los anticuerpos IgM contra el HAV, mas no debe considerarse como diagnóstico de infección de hepatitis A. Evalúe los resultados de la prueba en relación a la sintomatología, historia clínica y otros parámetros de laboratorio del paciente. Características del Ensayo* A. Panel de Desempeño La sensibilidad y la especificidad del Kit ImmunoComb II HAV IgM fueron evaluados en 627 muestras de suero. Los resultados son resumidos en la Tabla 1. Tabla 1. Resultados de la Prueba ImmunoComb II HAV IgM Ensayo de Referencia Positivo Negativo Positivo Negativo Se calcularon las características del ensayo, encontrándose los siguientes reultados: Sensibilidad 98.5 % Especificidad 99.3 % B. Seroconversión La capacidad del kit de ImmunoComb II HAV IgM para detectar tempranamente HAV IgM fue evaluada en un panel de seroconversión de 5 miembros obtenido de Boston Biomedica, Inc. (Bridgewater, MA USA) de un solo individuo con un anti-hav IgM RIA como prueba de referencia. Ambas pruebas detectaron anti-hav IgM en los sueros números 3 y 4, pero no en el suero número 5. Anti-HAV IgG fueron detectados en las muestras 3 a 5. Los resultados muestran 100% de correlación con RIA. Repetibilidad Diez peines fueron escogidos al azar de varias partes de un lote de producción. Un suero positivo fue analizado 12 veces en estos 10 peines. Todas las veces el suero resultó positivo para HAV IgM. Reproducibilidad Tres muestras positivas para HAV fueron analizadas en peines tomados de tres diferentes lotes de producción. En todos los casos, todas las muestras positivas fueron detectadas. Reacción Cruzada Reacción Cruzada con muestras positivas de hepatitis causada por agentes tales como Antígeno de Superficie del virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, VIH-1, VIH-2, HAV Ab y HTLV no fue importante. Interferencia No se observó interferencia con muestras hemolisadas (hemoglobina hasta 10 mg/ml), lipémicas (Colesterol hasta mg/dl; Triglicéridos hasta mg/dl) y bilirrubina alta (hasta 20 mg/dl). Bibliografίa Blaine H Hepatitis A virus. In: Viral Hepatitis. (Hollinger FB, Purcell, RH, Robinson WS, Gerin JL, Ticehurst J, eds. Raven Press, New York. pp Decker R, Ling CM, Overby L, Frösner GG, Boggs J Serology of transmission of hepatitis A in humans. J Infect Dis 139:74-82 Dienstag JL, Krugman S, Wong DC, Purcell RH Comparison of serological tests for antibody to hepatitis A antigen using coded specimens from individuals infected with MS-1 strain of hepatitis A virus. Infect Immun 14: Duermeyer W, Van der Veen J, Koster B ELISA in hepatitis A. Lancet 1: Frösner GG, Papaevangelou G, Butler R, Iwarson S, Lindholm A, Courource-Pauty AM Antibody against hepatitis A in seven european countries. I. Comparison of prevalence data in different age groups. Am J Epidemiol 110: Herrera JL Serological diagnosis of viral hepatitis. S Med J 87: Kiyasu PK, Caldwell SH Diagnosis and treatment of the major hepatotropic viruses. Am J Med Sci 306: * Datos detallados disponibles /S12/OR/CE 3

4 Szmuness W, Dienstag JL, Purcell RH, Harley EJ, Stevens CE, Wong DC Distribution of antibody to hepatitis A antigen in urban adult populations. N Engl J Med 295: Zaaijer HL, Leentvaart-Kuijpers A, Rotman H and Lelie PN Hepatitis A antibody titres after infection and immunization: Implications for passive and active immunization. J Med Virol 40: Leyenda de los símbolos CARD PLATE ImmunoComb tarjeta Bandejas de Desarrollo CONTROL + CONTROL - positivo negativo PERFORATOR Perforador Consulte las instrucciones de uso Atención,ver instrucciones de uso IVD Producto sanitario para diagnóstico in vitro Limite de temperatura Σ n Contenido suficiente para n ensayos Fabricante REF DIL LOT Representante autorizado en la Comunidad Europea Número de catálogo Diluyente de la muestra Codigo de lote Fecha de caducidad Número de serie Version: /S12/OR/CE (03/2008) /S12/OR/CE 4

5 Resumen de los Principales Procedimientos de la Prueba Preincubación de la Bandeja de Desarrollo: 45 minutos a 37 C Tomar y prediluir las muestras y controles Agregar las muestras y controles prediluídos a la fila A. Mezclar Sacar el Peine del empaque Insertar el Peine y mezclar en la fila A. Incubar a 37 C Perforación de la fila B Absorber el líquido adherido a los dientes Insertar el Peine y agitar en la fila B. Incubar Luego de mezclar/agitar e incubar en filas C, D y E 9 10 Reacción de color en la Resultados fila F Resumen del Procedimiento de la Prueba Las instrucciones abreviadas abajo son para los usuarios experimentados en el uso del kit ImmunoComb II HAV IgM. (Para instrucciones detalladas, favor referirse al texto completo) 1. Incube la Bandeja de Desarrollo en una incubadora a 37ºC por 45 minutos. 2 Prediluya 10 µl de cada muestra y control mezclando con 490 µl de diluyente de la muestra. 3. Vierta 25 µl de cada muestra y control prediluídos en los pocillos de la fila A de la Bandeja de Desarrollo y mezcle. 4. Inserte el Peine en la fila A, mezcle y continúe como se describe en la Tabla 1. Tabla 1. Resumen del Procedimiento de la Prueba Paso Fila Proceda como sigue 1 Captura de anticuerpos A Mezcle; incube 2 horas a 37ºC; absorba. Lavado B Agite; incube 2 minutos; absorba. Reacción Antígeno-anticuerpo C Mezcle; incube 30 minutos a 37ºC; absorba. Unión del conjugado D Mezcle; incube 20 minutos a 37ºC; absorba. Lavado E Agite; incube 2 minutos; absorba. Cromógeno F Mezcle; incube 10 minutos a 37ºC. Detención de la reacción E Incube 1 minuto; seque al aire. Manera de romper el Peine /S12/OR/CE 5