HBc IgG. Principio de la Prueba. Introducción

Transcripción

1 HBc IgG S Principio de la Prueba La prueba ImmunoComb II HBc IgG es un ensayo inmunoenzimático indirecto de fase sólida (EIA), basado en el principio de la inmunocaptura. La fase sólida es un Peine con 12 proyecciones ("dientes"). Cada diente está sensibilizado en dos áreas reactivas: punto superior inmunoglobulina humana ( Interno) punto inferior HBcAg recombinante La Bandeja de Desarrollo tiene 6 filas (A-F) de 12 pocillos. Cada fila contiene una solución reactiva lista para ser usada en cada etapa del ensayo. La prueba es realizada en etapas, pasando el Peine de una fila a otra, con un período de incubación en cada etapa. Para comenzar la prueba, las muestras de suero o plasma son prediluídas en relación 1:10 y agregadas al diluyente en los pocillos de la fila A de la Bandeja de Desarrollo. Luego se inserta el Peine en los pocillos de la fila A. Los anticuerpos anti-hbc, en caso de estar presentes en las muestras, se unirán específicamente por el HBcAg en el punto inferior del diente del Peine (Figura 1). Los componentes no unidos son lavados en la fila B. En la fila C, el anti-hbcag capturado en los puntos inferiores del diente, y la inmunoglobulina humana en los puntos superiores ( Interno) reaccionarán con el anticuerpo anti-igg humano marcado con fosfatasa alcalina (FA). En las próximas dos filas, los componentes no ligados son eliminados mediante un lavado. En la fila F, la fosfatasa alcalina unida reaccionará con componentes cromogénicos. Los resultados pueden verse como puntos azul grisáceos en la superficie del diente del Código: Formato: 3 x 12 pruebas Para uso In vitro únicamente Propósito de Uso El kit ImmunoComb II HBc IgG es una prueba rápida para la detección cualitativa de anticuerpos IgG anti antígeno core (núcleo) de la hepatitis B (HBc) en suero o plasma humano. Treinta y seis pruebas pueden ser realizadas con un kit. Introducción El vírus de la hepatitis B (HBV) pertenece a una nueva familia de vírus de ADN llamados Hepadnaviridae. Se caracteriza por un marcado hepatotropismo y un singular medio de replicación a través de un mecanismo de transcripción inversa. El virión completo, o partícula Dane, consiste de una molécula de ADN circular protegida por un antígeno nucleocáspide/nuclear (HBcAg) y rodeada por un envoltorio de lipoproteína conocido como antígeno de superficie (HBsAg). El HBsAg también se encuentra en la sangre en forma de partículas incompletas esféricas o filamentosas no infecciosas. Un componente menor del nucleocáspide HBV, el antígeno HBe (HBeAg), también puede detectarse en la sangre durante la fase replicativa del virus. El vírus de la hepatitis B es un vírus ubicuo de distribución global. Las principales rutas de trasmisión viral son horizontales, a través de la contaminación sexual y parenteral, y vertical, a través de la trasmisión prenatal de la madre infectada al feto. Las consecuencias clínicas de la infección de HBV varían entre las totalmente inaparentes (70% de los casos) a la hepatitis ictérica aguda. La mayoría de los pacientes se recuperan completamente seis meses después del comienzo de la enfermedad. Una pequeña proporción de la población infectada (< 1.5%) puede desarrollar hepatitis fulminante, a menudo con consecuencias fatales. En una proporción sustancial (hasta 10%) de los pacientes adultos, el HBV puede persistir, progresando eventualmente hasta la hepatitis crónica con desarrollo final de cirrosis y hépatocarcinoma. Los portadores crónicos de hepatitis B (200 millones en todo el mundo) constituyen la principal reserva del virus y contribuyen a la diseminación de la enfermedad. Tanto los anticuerpos IgM como los IgG contra el antígeno nuclear viral aparecen durante la fase aguda de la infección de HBV. Mientras que el anti-hbc IgM declina rápidamente, el IgG anti-hbc persiste durante muchos años. Por lo tanto, el IgG anti-hbc es un indicador útil para determinar el contacto previo con HBV. Además, el IgG anti-hbc es el único marcador detectable de HBV durante la llamada ventana serológica de la hepatitis B aguda, el período que sigue a la desaparición del HBsAg, cuando el anticuerpo anti-hbs que indica la ausencia de virus aún no es detectable. FA anticuerpo Unión del conjugado FA FA anti-igg humano; 20 min conjugado anti-igg humano sustrato cromogénico Figura 1. Principio de la Prueba Formación del complejo HBcAg anticuerpo; 60 min Reacción enzimática de color; 10 min El kit incluye un (IgG anti-hbc) y un Negativo, que deben incluirse cada vez que se realiza la prueba. Al término de ésta, el diente utilizado con el debe mostrar dos puntos de color azul grisáceo. El diente usado con el Negativo debe mostrar el punto superior y un punto inferior muy ténue o la ausencia del mismo. El punto superior también deberá aparecer en todos los demás dientes para confirmar que el kit funciona apropiadamente y que la prueba fue realizada correctamente. Contenido del Kit Peines El kit contiene 3 Peines de plástico. Cada Peine tiene 12 dientes, uno para cada prueba (Figura 2). Cada diente es sensibilizado en dos áreas reactivas: punto superior inmunoglobulina humana ( Interno) punto inferior HBcAg recombinante Figura 2. Peine ImmunoComb II Interno HBcAg recombinante Los Peines son suministrados en empaques de aluminio que contienen una bolsa desecante. Bandejas de Desarrollo El kit contiene 3 Bandejas de Desarrollo, cubiertas con papel de aluminio. Cada Bandeja de Desarrollo (Figura 3) contiene todos los reactivos necesarios para la prueba. La Bandeja de Desarrollo consiste de 6 filas (A-F) de 12 pocillos cada una /S15/OR/CE 1

2 Los contenidos de cada fila son los siguientes: Fila A Diluyente de la muestra Fila B Solución de lavado Fila C Anticuerpo monoclonal anti-igg humano marcado con fosfatasa alcalina Fila D Solución de lavado Fila E Solución de lavado Fila F Solución de sustrato cromogénico que contiene 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) y nitro azul tetrazolio (NBT) Figura 3. Bandeja de Desarrollo 1 frasco (tapa roja) de 0,2 ml de plasma humano diluído, inactivado con calor, positivo para anticuerpos de IgG anti-hbc. Negativo 1 frasco (tapa verde) de 0,2 ml de plasma humano diluído, inactivado con calor y negativo para anti-hbc. Diluyente de la Muestra 1 botella (tapa transparente) de 5 ml. Perforador para perforar el papel de aluminio que cubre los pocillos de la Bandeja de Desarrollo. Seguridad y Precauciones Todos los materiales de origen humano usados en la preparación de los controles pasaron pruebas que demostraron que no son reactivos a HBsAg, así como a anticuerpos de HIV o el virus de la hepatitis C.Ya que ningún método de prueba puede garantizar por completo la ausencia de contaminación viral, todas las soluciones de referencia y todas las muestras humanas deben ser manejadas como si fueran potencialmente infecciosas. Use guantes quirúrgicos y ropas de laboratorio. Siga los procedimientos de laboratorio aceptados para el trabajo con suero o plasma humano. No use la pipeta aspirando con la boca. Deseche todas las muestras, Peines* usados, Bandejas de Desarrollo y otros materiales usados con el kit como desechos biocontaminantes. No mezcle reactivos de lotes diferentes. No use el kit después de la fecha de caducidad. Almacenamiento y Estabilidad del kit El kit es transportado de 2-8 o C. Durante el transporte el kit puede mantenerse a 30 o C por cortos períodos de tiempo, pero no exceder un total de 48 horas. Los controles internos indican que el kit no se ha deteriorado durante el transporte. Almacenar el kit en su caja original 2-8 o C. No congelar el kit. Después de abierto los componentes del kit deben ser almacenados de 2-8ºC. El desempeño del kit después de abrilo por primera vez es estable hasta la fecha de expiración del kit, cuando se almacena de 2-8ºC. Después del primer uso, el peine y la bendeja no deben ser usados por más de tres veces. Manipulación de las muestras Es posible usar suero o plasma. Las muestras pueden ser almacenadas por 7 días de 2 8 C antes de la prueba. Para almacenar las pruebas por más de 7 días, congélelas a 20 C o a temperaturas más bajas. Después de descongelar las muestras de suero, centrifúguelas. Use el sobrenadante para la prueba. Evite congelar y descongelar repetidamente. Anticoagulantes tales como Heparin, EDTA y Citrato de Sodio no afectan los resultados de la prueba. Procedimiento de la Prueba Equipo Necesario (no proporcionado) Pipetas de precisión ajustables con puntas desechables y capacidad de 10 µl, 25 µl y 90 µl * A menos que sea archivado para consulta posterior Tijeras Cronómetro de laboratorio o reloj Microtubos o pocillos de microtitulación Preparación para la Prueba Equilibre todos los reactivos y las muestras a temperatura ambiente y realice la prueba a temperatura ambiente (22-26 C). Preparación de la Bandeja de Desarrollo 1. Incube la Bandeja de Desarrollo en una incubadora a 37 C por 20 minutos, o deje a temperatura ambiente (22-26 C) por 3 horas. 2. Cubra la mesa de trabajo con papel absorbente, a ser desechado como desecho biocontaminante al concluir la prueba. 3. Mezcle los reactivos sacudiendo la Bandeja de Desarrollo. Nota: No retire la cubierta de aluminio de la Bandeja de Desarrollo; rómpala usando la punta desechable de la pipeta o el perforador, sólo cuando las instrucciones de la prueba así lo indiquen. Preparación del Peine Precaución: para asegurar el funcionamiento apropiado de la prueba, no toque los dientes del 1. Abra el empaque de aluminio por el borde perforado. Retire el 2. Es posible utilizar todo el Peine y la Bandeja de Desarrollo o solamente una parte. Para utilizar parte del Peine: a. Determine cuantos dientes va a necesitar para analizar las muestras y los controles. Se necesita un diente para cada prueba. Cada diente tiene impreso el número de código del kit, "50", para permitir la identificación de los dientes sueltos. b. Doble y rompa verticalmente el Peine, o córtelo con tijeras (ver Figura 4) para separar el número requerido para las pruebas (Nro. de pruebas más 2 controles). c. Vuelva a meter la porción no utilizada del Peine en el empaque de aluminio (con la bolsa desecante). Cierre bien el envoltorio (con un clip, por ejemplo) a fin de mantenerlo seco. Almacene el Peine en la caja original del kit a temperaturas de 2 a 8 C para su uso posterior. ImmunoComb II Figura 4. Fraccionamiento del Peine Instrucciones de la Prueba Predilución de Muestras y es 1. Para cada muestra y control, dispense 90 µl de diluyente de la muestra en un microtubo o pocillo de microtitulación. 2. A cada microtubo o pocillo, añadir 10 µl de una muestra, o del o Negativo suministrado con el kit. Mezcle vaciando y rellenando repetidamente la solución con la pipeta. Reacción Antígeno-Anticuerpo (Fila A de la Bandeja de Desarrollo) 3. Pipetee 25 µl de una muestra prediluída. Perfore la cubierta de papel aluminio en un pocillo de la fila A de la Bandeja de Desarrollo con la punta de la pipeta o el perforador y vierta la muestra en el fondo del pocillo. Mezcle vaciando y rellenando repetidamente la solución con la pipeta. Deseche la punta de la pipeta. 4. Repita el paso 3 para las otras muestras prediluídas y los dos controles prediluídos. Use un nuevo pocillo en la fila A y cambie la punta de la pipeta para cada muestra o control. 5. a. Inserte el Peine (con el lado impreso hacia Ud.) en los pocillos de la fila A que contienen las muestras y los controles. Mezcle: Retire e inserte el Peine en los pocillos varias veces. b. Deje el Peine en la fila A e incube por 60 minutos. Active el cronómetro. Hacia el final de los 60 minutos, perfore el papel de aluminio de la fila B usando el perforador. No abra más pocillos de los necesarios. c. Al cumplirse los 60 minutos, saque el Peine de la fila A. Absorba el líquido adherido a las puntas de los dientes apoyándolos sobre un papel absorbente limpio. No toque la superficie frontal del diente. Primer Lavado (Fila B) 6. Inserte el Peine en los pocillos de la fila B. Agite: inserte y retire vigorosamente el Peine en los pocillos por al menos 10 segundos /S15/OR/CE 2

3 para que quede bien lavado. Repita el lavado varias veces agitando en el trascurso de 2 minutos; mientras tanto, perfore el papel aluminio de la fila C. Después de 2 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido como en el paso 5c. Unión del Conjugado (Fila C) 7. Inserte el Peine en los pocillos de la fila C. Mezcle como en el paso 5a. Programe el cronómetro para 20 minutos. Perfore el papel aluminio de la fila D. Después de 20 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido. Segundo Lavado (Fila D) 8. Inserte el Peine en los pocillos de la fila D. Agite repetidamente durante 2 minutos, como en el paso 6. Mientras tanto, perfore el papel aluminio en la fila E. Después de 2 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido. Tercer Lavado (Fila E) 9. Inserte el Peine en los pocillos de la fila E. Agite repetidamente durante 2 minutos. Mientras tanto, perfore el papel aluminio de la fila F. Después de 2 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido. Reacción de Color (Fila F) 10. Inserte el Peine en los pocillos de la fila F. Mezcle. Programe el cronómetro para 10 minutos. Después de 10 minutos, retire el Detención de la Reacción (Fila E) 11. Inserte de nuevo el Peine en la fila E. Después de un minuto, retire el Peine y déjelo secar al aire. Almacenamiento de Partes No Usadas del Kit Bandeja de Desarrollo Si no usó todos los pocillos de la Bandeja de Desarrollo, puede almacenarla para ser usada posteriormente: Selle los pocillos usados con cinta adhesiva ancha a fin de que nada se derrame fuera de los pocillos, incluso en caso de que la Bandeja de Desarrollo sea volcada. Otros Materiales del Kit Vuelva a colocar la(s) Bandejas(s) de Desarrollo, Peine(s), perforador, diluyente de la muestra, controles e instrucciones en la caja original del kit y almacene a temperaturas de 2 a 8 C. Resultados de la Prueba Validación A fin de confirmar el funcionamiento correcto de la prueba y demostrar que los resultados son válidos, deben cumplirse las siguientes tres condiciones (ver Figura 5): 1. El debe producir dos puntos en el diente del 2. El Negativo debe producir un punto superior ( Interno). El punto inferior no aparece o aparece muy ténuemente, sin afectar la interpretación de los resultados. 3. Cada muestra analizada debe producir un punto superior ( Interno). Si cualquiera de las tres condiciones no se cumple, los resultados de la prueba no son válidos y las muestras y controles deben ser reexaminados. Negativo Figura 5. Validación de la Prueba Resultados Inválidos Interpretación Cualitativa de los Resultados Interpretación Visual Compare la intensidad del punto inferior de cada diente de muestra con la del punto inferior del diente del (Figura 6). Un punto con intensidad mayor que o igual a la del indica la presencia de anticuerpos IgG anti-hbc. Un punto con intensidad menor que la del es considerado como un resultado negativo. Resultado Negativo Figura 6. Resultados de la Prueba Muestra Presencia de anticuerpos IgG anti-hbcag Documentación de los Resultados Debido a que el color que aparece en los Peines es estable, es posible archivar los Peines para consulta posterior. Limitaciones Como ocurre con otras pruebas ideadas para ser usadas en diagnósticos in vitro, los resultados de esta prueba deben ser evaluados en relación con todos los síntomas, historial clínico y otras pruebas de laboratorio del paciente. En caso de que el punto de prueba esté débilmente menos coloreado que el control positivo, se recomienda repetir la prueba. Se puede observar una interferencia insignificante con sueros positivos para HAV IgM. Características del Ensayo* La sensibilidad y la especificidad del kit ImmunoComb II HBc IgG fueron evaluados en un panel de 879 muestras de suero. Los resultados son resumidos en la Tabla 1. Tabla 1. Resultados de la prueba Prueba de Referencia ImmunoComb II HBc IgG Negativo 93 0 Negativo Se calcularon las características del ensayo, encontrándose los siguientes reultados: Sensibilidad 100 % Especificidad 99.1 % Repetibilidad Diez peines fueron escogidos al azar de diferentes partes de un lote de producción. Un suero positivo para HBc IgG fue analizado 12 veces en cada peine. Todas las veces el suero fue positivo para HBc IgG. Reproducibidad Tres muestras positivas para HBc IgG fueron analizadas en peines tomados de tres diferentes lotes de producción. En todos los casos, Todas las muestras positivas se detectaron. Reacción cruzada No se encontró reacción cruzada con muestras positivas para antígeno de superficie de Hepatitis B ó anticuerpos anti Hepatitis B. Tampoco se encontró reacción cruzada con muestras positivas para otras enfermedades tales como Rubéola, HIV, Virus de Hepatitis C, Citomegalovirus and Toxoplasma. Interferencia No se encontró interferencia con muestras hemolisadas (hemoglobina hasta 10 mg/ml), lipémicas (Coolesterol hasta mg/dl; Triglicéridos hasta mg/dl) y bilirrubina alta (hasta 20 mg/dl). Bibliografía Follett EAC Diagnosis of hepatitis B infection. In: Hugh Y, McMillan A, eds. Immunological diagnosis of sexually transmitted diseases. Marcel Dekker, New York. pp Hollinger FB Hepatitis B virus. In: Viral Hepatitis. (Hollinger FB, Purcell RH, Robinson WS, Gerin JL, Ticehurst J, eds.) Raven Press, New York. pp Krugman S, Overby LR, Mushawar IK, Ling C-M, Frösner GG, Deinhart F Viral hepatitis, type B: studies on natural history and prevention re-examined. N Engl J Med 300: * Datos detallados disponibles /S15/OR/CE 3

4 Lander JJ, Gitnick GL, Gled LH, Aach RD Anti-core screening of transfused blood. Vox Sang 34: Robinson WS Hepadnaviridae and their replication. In: Viral Hepatitis. (Hollinger FB, Purcell, RH, Robinson WS, Gerin JL, Ticehurst J, eds.) Raven Press, New York. pp Swenson PD Hepatitis viruses. In: Balows A, Hausler WJ, Herrmann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ, eds. Manual of Clinical Microbiology, Fifth edition. American Society for Microbiology, Washington, DC. pp Leyenda de los símbolos ImmunoComb tarjeta Bandejas de Desarrollo positivo negativo Perforador Diluente de la muestra Consulte las instrucciones de uso IVD Σ n Atención,ver instrucciones de uso Producto sanitario para diagnóstico in vitro Limite de temperatura Contenido suficiente para n ensayos Fabricante REF LOT Representante autorizado en la Comunidad Europea Número de catálogo Código de lote Fecha de caducidad Número de serie Version: /S15/OR/CE (04/2008) /S15/OR/CE 4

5 Resumen de los Principales Procedimientos de la Prueba Preincubación de la Bandeja de Desarrollo: 3 hrs a temperatura ambiente, o 20 minutos a 37 C Tomar y prediluir muestras y controles Agregar muestras y controles prediluídos a la fila A. Mezclar Sacar el Peine del empaque Insertar el Peine y mezclar en fila A. Incubar Perforación de la fila B Absorber líquido adherido a los dientes Insertar Peine y agitar en fila B. Incubar Luego de mezclar/agitar e incubar en filas C,D y E Reacción de color en fila F Resultados Resumen del Procedimiento de la Prueba Las instrucciones abreviadas a continuación son para las personas experimentadas en el uso del kit ImmunoComb II HBc IgG. (Para instrucciones detalladas, favor referirse al texto completo) 1. Lleve todas las muestras y reactivos a temperatura ambiente y realice la prueba a temperatura ambiente. 2 Prediluya 10 µl de cada muestra y control con 90 µl de diluyente de la muestra. 3. Vierta 25 µl de cada muestra y control prediluídos en los pocillos de la fila A de la Bandeja de Desarrollo, y mezcle. 4. Inserte el Peine en la fila A y continúe como se describe en la Tabla 1: Tabla 1. Resumen del procedimiento de la prueba Etapa Fila Proceda como se indica 1 Reacción antígeno-anticuerpo A Mezcle; incube 60 minutos; absorba. Lavado B Agite; incube 2 minutos; absorba. Unión del conjugado C Mezcle; incube 20 minutos; absorba. Lavado D Agite; incube 2 minutos; absorba. Lavado E Agite; incube 2 minutos; absorba. Reacción de color F Mezcle; incube 10 minutos. Detención de la Reacción E Incube 1 minuto; seque al aire.. 2 Manera de romper el diente /S15/OR/CE 5