HBsAg. Principio de la Prueba. Para uso diagnóstico in vitro solamente Uso Previsto. Figura 1. Principio de la Prueba.
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- Valentín Saavedra Álvarez
- hace 7 años
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1 HsAg S Principio de la Prueba La prueba ImmunoComb II HsAg es un ensayo immuno-enzimático de fase sólida (EIA), basado en el principio de la inmunocaptura. La fase sólida es un Peine con 12 proyecciones ("dientes"). Cada diente está sensibilizado en dos áreas reactivas: punto superior albúmina de suero bovino biotinilada ( Interno) punto inferior anticuerpos monoclonales anti-hsag La andeja de Desarrollo tiene 6 filas (A-F) de 12 pocillos cada una. Cada fila contiene una solución reactiva lista para ser usada en cada etapa del ensayo. La prueba es realizada en etapas, pasando el Peine de una fila a otra, con un período de incubación en cada etapa. Para comenzar la prueba, las muestras de suero o plasma son agregadas al diluyente en los pocillos de la fila A de la andeja de Desarrollo. Luego se inserta el Peine en los pocillos de la fila A. El HsAg, en caso de estar presente en las muestras, es capturado por los anticuerpos anti-hs en el punto inferior del diente del Peine (Figura 1). Los componentes no unidos son lavados en la fila. En la fila C, el HsAg capturado en el diente reacciona con los anticuerpos anti-hs biotinilados. En la fila D, el complejo anticuerpo/antigeno biotinilado en el punto inferior del diente, y la albúmina de suero bovino biotinilada en el punto superior ( Interno), reaccionan con estreptavidina marcada con fosfatasa alcalina (FA). En la fila E, los componentes no unidos son eliminados mediante un lavado. En la fila F, la fosfatasa alcalina unida reacciona con componentes cromogénicos. Los resultados son visibles como puntos de color azul grisáceo en la superficie de los dientes del Peine. HsAg Captura del HsAg; 120 min/37 C a-hs biotinilado Unión del anti-hs biotinilado; 30 min/37 C Código: Formato: 3 x 12 pruebas Para uso diagnóstico in vitro solamente Uso Previsto El kit ImmunoComb II HsAg constituye una prueba rápida para la detección cualitativa del antígeno de superficie del virus de la hepatitis (HsAg) en el suero o plasma humano. Treinta y seis pruebas pueden ser realizadas con un kit. Introducción El vírus de la hepatitis (HV) pertenece a una nueva familia de vírus de ADN llamados Hepadnaviridae. Se caracteriza por un marcado hepatotropismo y un singular medio de replicación a través de un mecanismo de transcripción inversa. El virión completo, o partícula Dane, consiste de una molécula de ADN circular protegida por un antígeno nucleocáspide/nuclear (HcAg) y rodeada por un envoltorio de lipoproteína conocido como antígeno de superficie (HsAg). El HsAg también se encuentra en la sangre en forma de partículas incompletas esféricas o filamentosas no infecciosas. Un componente menor del nucleocáspide HV, el antígeno He (HeAg), también puede detectarse en la sangre durante la fase replicativa del virus. El vírus de la hepatitis es un vírus ubicuo de distribución global. Las principales rutas de trasmisión viral son horizontales, a través de la contaminación sexual y parenteral, y vertical, a través de la trasmisión prenatal de la madre infectada al feto. Las consecuencias clínicas de la infección de HV varían entre las totalmente inaparentes (70% de los casos) a la hepatitis ictérica aguda. La mayoría de los pacientes se recuperan completamente seis meses después del comienzo de la enfermedad. Una pequeña proporción de la población infectada (< 1.5%) puede desarrollar hepatitis fulminante, a menudo con consecuencias fatales. En una proporción sustancial (hasta 10%) de los pacientes adultos, el HV puede persistir, progresando eventualmente hasta la hepatitis crónica con desarrollo final de cirrosis y hépatocarcinoma. Los portadores crónicos de hepatitis (200 millones en todo el mundo) constituyen la principal reserva del virus y contribuyen a la diseminación de la enfermedad. En los casos típicos de infección aguda de HV, el HsAg, a menudo acompañado de HeAg, aparece en la sangre de 2 a 6 semanas antes del inicio de los síntomas o la evidencia bioquímica de la hepatitis, y llega al máximo durante la fase aguda de la enfermedad. La persistencia del HsAg en el suero por más de 6 meses refleja el estadio de portador crónico de HV. Por lo tanto, un muestreo de HsAg permite la identificación de los pacientes infectados con HV y ayuda en el diagnóstico y el pronóstico de la enfermedad. FA S FA S estreptavidina (S)- FA sustrato cromogénico S FA Unión de la estreptavidina- FA; 20 min/37 C Reacción enzimática de color; 10 min/37 C Figura 1. Principio de la Prueba El kit incluye un Positivo (HsAg) y un, que deben incluirse cada vez que se realiza la prueba. Al término de ésta, el diente utilizado con el Positivo debe mostrar dos puntos de color azul grisáceo. El diente usado con el debe mostrar el punto superior y un punto inferior muy ténue o la ausencia del mismo. El punto superior debe aparecer en todos los demás dientes para confirmar que el kit funciona apropiadamente y que la prueba fue realizada correctamente. Contenido del Kit Peines El kit contiene 3 Peines de plástico. Cada Peine tiene 12 dientes, uno para cada prueba (Figura 2). Cada diente esta sensibilizado en dos areas reactivas: punto superior albúmina de suero bovino biotinilada ( Interno) punto inferior anticuerpos monoclonales anti-hsag Figura 2: Peine ImmunoComb II Interno Anti-Hs Los Peines son suministrados en empaques de aluminio que contienen una bolsa desecante. andejas de Desarrollo El kit contiene 3 andejas de Desarrollo, cubiertas con papel de aluminio. Cada andeja de Desarrollo (Figura 3) contiene todos los reactivos necesarios para la prueba. La andeja de Desarrollo consta de 6 filas (A-F) de 12 pocillos cada una /S11/OR 1
2 Los contenidos de cada fila son los siguientes: Fila A diluyente de la muestra Fila solución de lavado Fila C anticuerpos biotinilados de cabra anti-hsag Fila D estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina Fila E solución de lavado Fila F solución de sustrato cromogenico que contiene 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (CIP) y nitro azul tetrazolio (NT) Figura 3. andeja Desarrollo Positivo 1 frasco (tapa roja) de 1.5 ml de plasma humano diluído, inactivado con calor, negativo para HsAg, suplementado con 50 ng/ml de HsAg recombinante. 1 frasco (tapa verde) de 1.5 ml de plasma humano diluído, inactivado con calor y negativo para HsAg. Perforador para perforar el papel de aluminio que cubre los pocillos de la andeja de Desarrollo. Seguridad y Precauciones Maneje el control positivo como si fuera potencialmente infeccioso, aunque haya sido inactivado. Todos los materiales de origen humano usados en la preparación de los controles pasaron pruebas que demostraron que no son reactivos a HsAg, anticuerpos del virus de la hepatitis C y anticuerpos anti-hiv. Ya que ningún método de prueba puede garantizar por completo la ausencia de contaminación viral, todas las soluciones de referencia y todas las muestras humanas deben ser manejadas como si fueran potencialmente infecciosas. Use guantes quirúrgicos y ropa de laboratorio. Siga los procedimientos de laboratorio aceptados para el trabajo con suero o plasma humano. No use la pipeta aspirando con la boca. Deseche todas las muestras, Peines* usados, andejas de Desarrollo y otros materiales usados con el kit como materiales biocontaminantes. No mezcle reactivos de lotes diferentes. No use este kit después de la fecha de caducidad. Conservación y estabilidad del kit El kit es enviado a 2-8º C. Durante el transporte el kit puede ser conservado a menos de 30º C durante cortos períodos de tiempo que no excedan de 48 horas. Los controles internos indican que el kit no ha sido dañado durante el transporte. Conservar el kit en su caja original a 2-8ºC. No congelar el kit. Después de abrir el kit inicialmente, los componentes deben ser conservados a 2-8ºC. El funcionamiento del kit después de su apertura inicial, es estable hasta la fecha de caducidad del mismo si se conserva a 2-8ºC. Después del uso inicial, el peine y la bandeja de reactivos no pueden ser utilizados más de tres veces. Manipulación de las Muestras Es posible usar suero o plasma en la prueba. Las muestras pueden ser almacenadas por 7 días a temperaturas de 2 a 8 C antes de la prueba. Para almacenar las muestras por más de 7 días, congélelas a -20 C o a temperaturas más bajas. Después de descongelar las muestras de suero, centrifúguelas. Use el sobrenadante para la prueba. Evite congelar y descongelar repetidamente. Los anticoagulantes como heparina, EDTA y citrato sódico no han mostrado tener efecto sobre los resultados del test. Procedimiento de la Prueba Equipo Necesario (no proporcionado) Pipetas de precisión ajustables con puntas desechables con capacidad de 75 µl Tijeras Cronómetro de laboratorio o reloj Preparación para la Prueba Lleve todos los reactivos y las muestras a temperatura ambiente. Preparación de la andeja de Desarrollo 1. Incube la andeja de Desarrollo en una incubadora a 37 C durante 45 minutos. Lleve todos los otros componentes (Peines, controles y muestras) a temperatura ambiente. 2. Cubra la mesa de trabajo con papel absorbente, a ser desechado como material biocontaminante al concluir la prueba. 3. Mezcle los reactivos sacudiendo la andeja de Desarrollo. Nota: No retire la cubierta de aluminio de la andeja de Desarrollo; rómpala usando la punta desechable de la pipeta o el perforador, sólo cuando las instrucciones de la prueba así lo indiquen. Preparación del Peine Precaución: para asegurar el funcionamiento apropiado de la prueba, no toque los dientes del Peine. 1. Abra el empaque de aluminio por el borde perforado. Retire el Peine. 2. Es posible utilizar todo el Peine y la andeja de Desarrollo o solamente una parte. Para utilizar parte del Peine: a. Determine cuantos dientes va a necesitar para analizar las muestras y los controles. Se necesita un diente para cada prueba. Cada diente tiene impreso el número de código del kit, "51", para permitir la identificación de los dientes sueltos. b. Doble y rompa verticalmente el Peine, o córtelo con tijeras (ver Figura 4) para separar el número requerido para las pruebas (Nro. de pruebas mas 2 controles). c. Vuelva a meter la porción no utilizada del Peine en el empaque de aluminio (con la bolsa desecante). Cierre bien el empaque (con un clip o con cinta adhesiva, por ejemplo) a fin de mantenerlo seco. Almacene el Peine en la caja original del kit a temperaturas de 2 8 C para su uso posterior. ImmunoComb II Figura 4. Fraccionamiento del Peine Instrucciones de la Prueba Nota: Realice las incubaciones a 37 C! [los lavados pueden ser llevados a cabo a temperatura ambiente (22 26 C)]. Las instrucciones descritas a continuación proporcionan una sensibilidad de la prueba de 0.5 ng/ml. Captura del Antígeno (Fila A de la andeja de Desarrollo) 3. Tome 75 µl de la muestra con la pipeta. Perfore la cubierta de papel aluminio en un pocillo de la fila A de la andeja de Desarrollo con la punta de la pipeta o el perforador y vierta la muestra en el fondo del pocillo. Mezcle vaciando y rellenando repetidamente la solución con la pipeta. Deseche la punta de la pipeta. 4. Repita el paso 1 para las demás muestras, incluyendo un control positivo y uno negativo provistos en el kit. Use un nuevo pocillo en la fila A y cambie la punta de la pipeta para cada muestra o control. 5. a. Inserte el Peine (con el lado impreso hacia Ud.) en los pocillos de la fila A que contienen las muestras y los controles. Mezcle: Retire e inserte el Peine en los pocillos varias veces. b. Deje el Peine en la fila A e incube por 120 minutos a 37 C. Active el cronómetro. Hacia el final de los 120 minutos, perfore el papel de aluminio de la fila usando el perforador. No abra más pocillos de los necesarios. c. Al cumplirse los 120 minutos, saque el Peine de la fila A. Absorba el líquido adherido a las puntas de los dientes apoyándolos sobre un papel absorbente limpio. No toque la superficie frontal del diente. Primer Lavado (Fila ) 6. Inserte el Peine en los pocillos de la fila. Agite: inserte y retire vigorosamente el Peine en los pocillos durante al menos 10 segundos para que quede bien lavado. Repita el lavado varias veces agitando en el trascurso de 2 minutos; mientras tanto, perfore el papel aluminio de la fila C. Después de 2 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido como en el paso 5c. Unión del anti-hs iotinilado (Fila C) 7. Inserte el Peine en los pocillos de la fila C. Mezcle como en el paso 5a. Incube la andeja de Desarrollo con el Peine durante 30 minutos (use el cronómetro) a 37 C. Perfore el papel aluminio de la fila D. Después de 30 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido. * A menos que sea archivado para documentación /S11/OR 2
3 Unión de la Estreptavidina/fosfatasa alcalina (Fila D) 8. Inserte el Peine en los pocillos de la fila D. Mezcle. Incube la andeja de Desarrollo con el Peine durante 20 minutos (use el cronómetro) a 37 C. Perfore el papel aluminio de la fila E. Después de 20 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido. Segundo Lavado (Fila E) 9. Inserte el Peine en los pocillos de la fila E. Agite repetidamente durante 2 minutos, como en el paso 4. Mientras tanto, perfore el papel aluminio de la fila F. Después de 2 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido. Reacción de Color (Fila F) 10. Inserte el Peine en los pocillos de la fila F. Mezcle. Incube la andeja de Desarrollo con el Peine durante exactamente 10 minutos (use el cronómetro) a 37 C. Después de 10 minutos, retire el Peine. Detención de la Reacción (Fila E) 11. Inserte de nuevo el Peine en la fila E. Después de un minuto, retire el Peine y déjelo secar al aire. Almacenamiento de Partes No Usadas del Kit andeja de Desarrollo Si no usó todos los pocillos de la andeja de Desarrollo, puede almacenarla para ser usada posteriormente: Selle los pocillos usados con cinta adhesiva ancha a fin de que nada se derrame fuera de los pocillos, incluso en caso de que la andeja de Desarrollo sea volcada. Otros Materiales del Kit Vuelva a colocar la(s) andejas(s) de Desarrollo, Peine(s), perforador, controles e instrucciones en la caja original del kit y almacene a temperaturas de 2 C a 8 C. Resultados de la Prueba Validación A fin de confirmar el funcionamiento correcto de la prueba y demostrar que los resultados son válidos, deben cumplirse las siguientes tres condiciones (ver Figura 5): 1. El Positivo debe producir dos puntos en el diente del Peine. 2. El debe producir un punto superior ( Interno). El punto inferior no aparece o aparece muy ténuemente. 3. Cada muestra analizada debe producir un punto superior ( Interno). Si cualquiera de las tres condiciones no se cumple, los resultados de la prueba no son válidos y las muestras y controles deben ser reexaminados. Positivo Figura 5. Validación de la Prueba Interpretación de los Resultados Resultado Inválido Interpretación Visual Compare la intensidad del punto inferior de cada diente de muestra con la del punto inferior al diente de control negativo (Figura 6). Un punto de mayor intensidad que el del control negativo es considerado como una reacción positiva (concentración de HsAg > 0.5 ng/ml). Si no aparece un punto, o aparece con una intensidad menor o igual a la del control negativo, es considerado como un resultado negativo (concentración de HsAg < 0.5 ng/ml ). Resultados s < Resultado Positivo Figura 6. Resultados de la Prueba Documentación de los Resultados Debido a que el color que aparece en el Peine es estable, es posible archivar los Peines para consulta posterior. Limitaciones Los resultados positivos de la prueba del ImmunoComb II HsAg indican la presencia del antígeno de superficie de la hepatitis. Sin embargo, no debe ser considerado como una prueba definitiva de la infección viral de la hepatitis activa. Como otras pruebas usadas para el diagnóstico in vitro, los resultados de esta prueba deben ser evaluados en relación con todos los síntomas, el historial clínico y otros resultados de pruebas de laboratorio del paciente Características del Ensayo * La sensibilidad y especificidad del kit ImmunoComb II HsAg fueron evaluadas en un panel de muestras de suero, en comparación con un radioinmunoensayo de referencia. El panel incluye 196 muestras positivas para HbsAg de pacientes con alguna infección aguda o crónica de VH, y 248 muestras negativas para HsAg. Los resultados son resumidos en la tabla 1. Tabla 1. Resultados de la Prueba Ensayo de Referencia ImmunoComb II HsAg Positivo Positivo Sensibilidad 100 % Especificidad % (asados en 1748 muestras de donantes de sangre) Una evaluación adicional realizada en un panel, suministrado por ADM - Francia, mostró un límite de detección de 0.5 ng/ml de HsAg en muestras de suero. Repetitividad Diez peines fueron escogidos al azar de diferentes partes del lote de producción. Un suero adicionado con HsAg (0.5 ng / ml) fue probado 12 veces en cada peine. Todas las veces el suero fue positivo para HsAg. Reproducibilidad Cuatro muestras de diferentes subtipos de HsAg y con diferentes concentraciones fueron realizadas en peines tomados de tres lotes diferentes de producción. En todos los casos, todas las muestras positivas fueron detectadas. Reactividad cruzada Reacción Cruzada con muestras positivas para antígeno core de Hepatitis o para anticuerpos de Hepatitis se encontró insignificante. Reacción cruzada con muestras positivas de otras enfermedades tales como Rubéola, VIH, virus de la Hepatitis C, Citomegalovirus and Toxoplasma también se encontró insignificante. Interferencias No se observó interferencia con muestras hemolisadas (hasta 10 mg/ml), lipémicas (Colesterol hasta mg/dl; Triglicéridos hasta mg/dl) y bilirrubina alta (hasta 20 mg/dl). * Datos detallados disponibles ibliografía Follet EAC Diagnosis of hepatitis infection. In: Hugh Y, McMillan A, eds. Immunological diagnosis of sexually transmitted diseases. Marcel Dekker, New York. pp Herrera JL Serological diagnosis of viral hepatitis. S Med J 87: Hollinger F Hepatitis virus. In: Viral Hepatitis. (Hollinger F, Purcel RH, Robinson WS, Gerin JL, Ticehurst J, eds.) Raven Press, New York. pp Kiyasu PK, Caldwell SH Diagnosis and treatment of the major hepatotropic viruses. Am J Med Sci 306: Krugman S, Overby LR, Mushawar IK, Ling C-M, Frösner GG, Deinhart F Viral hepatitis, type : studies on natural history and prevention re-examined. N Engl J Med 300: Ogra PL, eutner KR Hepatitis viruses. In: Milgrom F, Abeyounis CJ, Kano K, eds. Principles of immunological diagnosis in medicine. Lea & Febiger, Philadelphia. pp Robinson WS Hepadnaviridae and their replication. In: Viral Hepatitis. (Hollinger F, Purcell, RH, Robinson WS, Gerin JL, Ticehurst J, eds. Raven Press, New York. pp /S11/OR 3
4 Swenson PD Hepatitis viruses. In: alows A, Hausler WJ, Herrmann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ, eds. Manual of Clinical Microbiology, Fifth edition. American Society for Microbiology, Washington, DC. pp Leyenda de los símbolos CARD ImmunoComb tarjeta PLATE CONTROL + CONTROL - PERFORATOR andejas de Desarrollo positivo negativo Perforador Consulte las instrucciones de uso Atención,ver instrucciones de uso IVD Producto sanitario para diagnóstico in vitro Limite de temperatura Σ n Contenido suficiente para n ensayos Fabricante Representante autorizado en la Comunidad Europea REF LOT Número de catálogo Código de lote Fecha de caducidad Número de serie Version: /S11/OR (04/2008) /S11/OR 4
5 Resumen de los Principales Procedimientos de la Prueba Preincubación de la andeja de Desarrollo: 45 minutos a 37 C Tomar las muestras y controles Agregar muestras y controles a la fila A. Mezclar Sacar el Peine del empaque Insertar el Peine y mezclar en la fila A. Incubar a 37 C Perforar la fila Absorber el líquido adherido a los dientes Insertar el Peine y agitar en la fila. Incubar Después de mezclar/agitar e incubar en filas C,D y E Reacción de color en fila F Resultados Resumen del Procedimiento de la Prueba Las instrucciones abreviadas a continuación son para personas experimentadas en el uso del kit ImmunoComb II HsAg. (Para instrucciones detalladas favor de referirse al texto completo) 1. Incube la andeja de Desarrollo a 37 C durante 45 minutos. 2. Deposite 75 µl de cada muestra y control en pocillos de la fila A de la andeja de Desarrollo y mezcle. 3. Inserte el Peine en la fila A y continúe según se describe en la Tabla 1. Tabla 1. Resumen del Procedimiento de la Prueba Etapa Fila Proceda como se indica Captura del antígeno A Mezcle;incube 2 horas a 37 C; absorba. Lavado Agite; incube 2 minutos; absorba. Unión del anti-hs biotinilado Unión de estreptavidina/ fosfatasa alcalina C D Mezcle; incube 30 minutos a 37 C; absorba. Mezcle; incube 20 minutos a 37 C; absorba. Lavado E Agite; incube 2 minutos; absorba. Reacción de color F Mezcle; incube 10 minutos a 37 C. Detención de reacción E Incube 1 minuto; seque al aire. ending and breaking the Comb /S11/OR 5
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