EXTRACCIÓN DE POLIFENOLES DURANTE LA MACERACIÓN EN FRÍO DE UVA GARNACHA TRATADA POR PULSOS ELÉCTRICOS DE ALTO VOLTAJE: ENSAYO EN BODEGA.

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1 EXTRACCIÓN DE POLIFENOLES DURANTE LA MACERACIÓN EN FRÍO DE UVA GARNACHA TRATADA POR PULSOS ELÉCTRICOS DE ALTO VOLTAJE: ENSAYO EN BODEGA. Luengo E. 1, Gayán E. 1, Franco E. 2, Ballesteros F. 3, Álvarez I. 1 y Raso J.* 1 1 Tecnología de Alimentos, Facultad de Veterinaria. C/ Miguel Servet, Zaragoza Spain. jraso@unizar.es 2 Centro de Transferencia Agroalimentaria. Gobierno de Aragón 3 Bodegas Aragonesas Palabras clave: Vino, antocianos, polifenoles, maceración-fermentación. RESUMEN El objetivo de esta investigación fue evaluar la influencia de la aplicación de un tratamiento de pulsos eléctricos de alto voltaje (PEAV) a uva de la variedad garnacha, en la extracción de polifenoles durante una maceración prefermentativa en frío y, sobre la calidad del vino obtenido. Los estudios se realizaron en una bodega y se trataron por PEAV (4,3 kv/cm, 60 µs) 3000 kg de uva con un caudal de 2000 kg/h utilizando una cámara de tratamiento colineal. Tras 8 días de maceración en frío, la intensidad de color (IC), el contenido en antocianos totales (CAT) y el índice de polifenoles totales (IPT) del mosto que contenía uva tratada por PEAV era un 26%, un 31% y un 17% mayores, respectivamente, que en el mosto control. Tras la fermentación alcohólica, justo antes del embotellado, el IC y el contenido en taninos de ambos vinos era similar. Por otro lado, mientras que el CAT era ligeramente superior en el vino control, el vino elaborado con hollejos tratados por pulsos eléctricos de alto voltaje tenía un IPT un 10% mayor. El vino elaborado con uva tratada por PEAV fue más apreciado por los catadores en un análisis sensorial de preferencia. Los resultados obtenidos en este estudio demuestran el potencial de los PEAV en combinación con la fermentación en frío para mejorar la extracción de compuestos fenólicos y la calidad del vino. INTRODUCCIÓN Los compuestos fenólicos juegan un papel fundamental en la calidad del vino tinto debido a que algunos de sus atributos sensoriales como el color, el cuerpo o la astringencia están directamente relacionados con su presencia (del Llaudy et al., 2008). Además, en los últimos años los efectos beneficiosos para la salud derivados del consumo de vino tinto se han atribuido a la presencia de estos compuestos fenólicos en su composición (Rice-Evans et al., 1996, Nichenameltla et al., 2006). Los compuestos fenólicos del vino proceden fundamentalmente de la piel de la uva y en menor medida de las pepitas. La piel de la uva es rica en antocianos y proantocianidinas (taninos) que se localizan fundamentalmente en el interior de las vacuolas de las células (Pinelo et al., 2006). Estos compuestos difunden al mosto durante el proceso de fermentación-maceración estando condicionada la velocidad de extracción y la cantidad de compuestos fenólicos extraídos por la integridad de las envolturas de las células de la piel de la uva. La composición fenólica del vino depende de las características de la uva utilizada para la elaboración del mismo pero también por las técnicas enológicas utilizadas durante el proceso de vinificación (Sacchi et al., 2005). Debido a la importancia que tiene la extracción de compuestos fenólicos en el proceso de elaboración de vino tinto, se han propuesto distintas técnicas alternativas con objeto de incrementar la concentración de estos compuestos en el vino. La maceración prefermementativa en frío (Ortega-Heras et al., 2012) y los pulsos eléctricos de alto voltaje (PEAV) (Puértolas et al., 2010b) son dos de estas técnicas. La maceración en frío es una técnica de maceración desarrollada inicialmente con objeto de obtener vinos con una mayor riqueza polifenólica en vinificaciones con uva pobre en polifenoles, y que posteriormente se ha extrapolado a otras variedades tintas (Hidalgo- Togores, 2003a). Consiste en mantener la uva despalillada en los depósitos de fermentación a temperaturas inferiores a los 10ºC durante varios días. Estas temperaturas impiden el

2 desarrollo de las levaduras por lo que la extracción de los polifenoles se realiza en ausencia de etanol. Por otro lado, se ha demostrado que la aplicación de un tratamiento de PEAV a la uva antes del proceso de fermentación-maceración provoca la electroporación de las membranas celulares favoreciendo la posterior extracción de compuestos fenólicos (López et al., 2008a). El objetivo de esta investigación fue evaluar la influencia de la aplicación de un tratamiento de PEAV a uva de la variedad Garnacha en la extracción de polifenoles durante una maceración prefermentativa en frío y sobre la calidad del vino final obtenido. El estudio se realizó en una bodega experimental tratando las uvas mediante pulsos eléctricos de alto voltaje a un caudal de 2000 kg/h. MATERIAL Y MÉTODOS Uva El estudio se realizó con uvas de la variedad Garnacha de la D.O. Campo de Borja que fueron vendimiadas en el año 2011 y cuyas características se muestran en la Tabla 1. Se utilizaron un total de 2600 kg de uva que se vendimiaron manualmente en su momento óptimo de maduración y con buenas condiciones sanitarias. Las uvas se transportaron a la bodega en cajas de 20 kg. Tabla 1. Características de la uva garnacha utilizada en esta investigación. Peso de 100 bayas (g) 139,33 Relación mosto/sólidos (m/m) 0,53 Diámetro medio de baya (mm) 13,24 ºBrix 26,30 ph 3,52 Acidez total (g Ac. Tartárico/L) 5,63 Equipo de pulsos eléctricos de alto voltaje El generador de pulsos eléctricos de alto voltaje utilizado en este estudio (Modulator PG, ScandiNova, Uppsala, Sweden) aplica pulsos de onda cuadrada de una anchura de 3 µs a una frecuencia máxima de 300 Hz. El voltaje y la intensidad de corriente aplicadas durante el tratamiento se midieron con una sonda de alto voltaje (Tektronix, P6015A, Wilsonville, Oregon, USA) y una sonda de corriente eléctrica (Stangenes Industries Inc. Palo Alto, California, USA) conectadas a un osciloscopio (Tektronix, TDS 220, Wilsonville, Oregon, USA). La cámara de tratamiento utilizada tenía una configuración colineal y consistía en 3 electrodos tubulares de acero inoxidable separados por dos tubos de metacrilato. La cámara disponía de dos zonas de tratamiento con un diámetro de 3 cm y una separación entre los electrodos también de 3 cm. Procesado de la uva por pulso eléctricos de alto voltaje Tras el despalillado, la uva se impulsó hacia la cámara de tratamiento mediante una bomba peristáltica (Rotho, MS1 Ragazzini, Faenza Italy) utilizando una tubería de 6 centímetros de diámetro. La uva tratada continuó su avance a través de la tubería hacia el tanque de maceración-fermentación. La uva se trató a caudal de 1900±50 kg/h siendo el tiempo de residencia en la zona de tratamiento de 0,41 segundos. El tratamiento de PEAV se aplicó a una frecuencia de 250 Hz recibiendo la uva 20 pulsos de 3 µs a una intensidad de campo

3 eléctrico de 4,3 kv/cm (1,5 kj/kg). A efectos comparativos, la uva no tratada se hizo pasar a través del mismo circuito pero sin la aplicación del tratamiento de PEAV. Elaboración del vino Las vinificaciones se realizaron en depósitos de fermentación de un volumen de de 2000 L utilizando 1300 kg de uva por vinificación. En ambos depósitos, nada más introducir la uva se añadió metabisulfito sódico (8 g de SO 2 /100 kg of uva). Tanto a la uva tratada por pulsos eléctricos de alto voltaje como la no tratada se mantuvieron a una temperatura inferior a los 10ºC durante 8 días haciendo circular líquido refrigerante a través de la camisa de refrigeración de los tanques. A partir del noveno día se aumentó la temperatura a 20ºC y se añadieron levaduras de Saccharomyces bayanus (EC1118, Lalvin, Ontario, Canada) a una concentración de 10 g de levadura seca/100 kg de uva. Tanto durante la maceración en frío como durante la fermentación, se midió diariamente la densidad del mosto que estaba fermentando. Al finalizar la fermentación, los hollejos se prensaron y el vino obtenido se mezcló con el resto. Los vinos se decantaron, se les ajustó la concentración de SO 2 a 30 mg/l, y se filtraron antes de su embotellado. Análisis químicos Las características cromáticas del vino se determinaron mediante la media directa de la absorbancia de los vinos a 420, 520 and 620 nm. La intensidad de color (IC) se calculó sumando los valores de absorbancia obtenidos a las tres longitudes de onda. El tono se determinó a partir de la proporción de las absorbancias medidas a 420 nm y 520 nm; mientras que el porcentaje de las componentes amarilla (%Am), roja (%R) y azul (%Az) se determinó a partir de la relación entre las absorbancias a 420, 520 and 620 nm respectivamente y la intensidad de color (Glories, 1984b). El contenido en antocianos totales (CAT) se determinó a partir de la medida de la absorbancia a 520 nm del vino o del mosto diluido en agua destilada con un 1% de HCl. El índice de polifenoles totales (IPT) se determinó mediante la medida directa de absorbancia a 280 nm del mosto o del vino diluido 1/100 (v/v) en agua destilada. La acidez total y volátil, el ph, la concentración de etanol y la concentración de azúcares reductores se determinaron según se ha descrito previamente (Zamora, 2003). Análisis sensorial Trascurridos dos meses tras el embotellado, se realizaron un test de preferencia y uno triangular para determinar si los catadores (8 catadores entrenados) eran capaces de detectar diferencias entre los vinos elaborados. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Influencia de la aplicación de un tratamiento de PEAV en la evolución de la IC, CA e IPT durante la maceración prefermentativa en frío y posterior fermentación. La Figura 1 muestra la evolución de la IC, el CAT y el IPT durante el periodo de maceración prefermentativa en frío y posterior fermentación de uva de la variedad garnacha tratada por PEAV y sin tratar (control). Los valores de estos índices dependen directamente del paso de los compuestos fenólicos al mosto durante el periodo de maceración prefermentativa o al mosto que está fermentando una vez que las levaduras comienzan a transformar el azúcar en etanol. En la Figura 1A, se muestra también la evolución de la densidad del mosto en ambos depósitos. Durante todo el periodo de fermentación en frío (9 días) la densidad del mosto se mantuvo constante en ambos depósitos, indicando que a temperaturas inferiores a 10ºC, las levaduras salvajes presentes de manera natural en los hollejos de la uva fueron incapaces de comenzar a fermentar los azúcares. En el momento en el que se aumentó la temperatura de los tanques y se añadieron levaduras, la densidad del mosto comenzó a disminuir como consecuencia de la transformación de los azúcares en etanol terminando la fermentación entre los 4 y 5 días de su comienzo. Según se muestra en la Figura 1, en ambos tanques, durante el periodo de maceración prefermentativa en frío la IC y el CAT aumentaron progresivamente hasta alcanza el valor más elevado justo antes del comienzo de la fermentación (día 8). Sin embargo, en el caso

4 del índice de polifenoles totales se observó que su valor máximo se alcanzó a los 6 días. Este comportamiento podría ser debido a que la extracción de antocianos, principales responsables del color del vino, no es tan dependiente de la presencia de etanol como la extracción del resto de compuestos fenólicos debido a su mayor solubilidad en agua. La estabilización del IPT a partir del sexto día de maceración parece indicar que en ese periodo de tiempo se habían extraído todos los polifenoles que se podían extraer en un medio acuoso y que se requería la presencia de etanol para extraer los polifenoles menos solubles en agua y para degradar la capa lipídica que protege a las pepitas de la uva, que dificulta la extracción de los polifenoles (Busse-Valverde et al., 2010). La aplicación de un tratamiento de pulsos eléctricos de alto voltaje a la uva antes del proceso de fermentación maceración incrementó la IC, el CAT y el IPT en el mosto durante el periodo de maceración prefermentativa. Por lo tanto, la electroporación de las membranas de las células de la piel de la uva favoreció la extracción de compuestos fenólicos en ausencia de etanol. Similares resultados han sido observados previamente con distintas variedades de uva, incluida la variedad Garnacha, durante el periodo de maceración-fermentación en el que la concentración de etanol en el medio va aumentando a medida que avanza la fermentación (Puértolas 2010a). Justo antes del comienzo de la fermentación, la IC, el CAT y el IPT del mosto que contenía uvas tratadas por pulsos eléctricos de alto voltaje era un 27%, un 31% y unos 17% mayores que en el mosto control. Por lo tanto, estos resultados indicarían que el tratamiento de pulsos eléctricos de alto voltaje podría permitir conseguir mostos con mayor color y concentración de compuestos fenólicos al final del periodo de fermentación en frío o reducir el tiempo de maceración prefermentativa. Se observó que los niveles de IC, CAT e IPT que se obtuvieron tras 8 días de maceración en frío en los depósitos que contenían la uva control se alcanzaron entre 4 y 5 días en los depósitos que contenían la uva tratada por PEAV. Esta reducción del tiempo de maceración en frío favorecería la rotación de los depósitos en bodega al permitir acortar el tiempo total de fermentación y reduciría los costes energéticos requeridos para mantener la uva a temperaturas inferiores a los 10ºC. Intensidad de color A Densidad (g/l) Contenido antocianos totales (CAT) (mg/l) B Tiempo (días) Tiempo (días) Índice de polifenoles totales (IPT) C Tiempo (días) Figura 1. Evolución de la intensidad de color (IC), contenido de antocianos (CA) (B) e índice de polifenoles totales (IPT) (C) a lo largo de la maceración-fermentación de uvas sin tratar (barras blancas) y uvas tratadas por pulsos eléctricos de alto voltaje (barras negras). La figura 1A muestra también la evolución de la densidad del mosto a lo largo de todo el periodo de vinificación.

5 Tras el comienzo de la fermentación del mosto, la evolución de los tres índices estudiados fue similar en ambos tanques. Se observó, en los primeros días, un incremento muy importante en la extracción de compuestos fenólicos debido a que la presencia de etanol favoreció su extracción de los tejidos de los hollejos parcialmente degradados durante el periodo de maceración prefermentativa. En el caso de la IC, se observó un rápido incremento de este índice al comienzo de la fermentación alcanzándose el valor máximo en ambos depósitos a los dos días de haber comenzado la fermentación. A partir de este momento, se observó un descenso importante de la IC de modo que al final de la fermentación alcohólica, la IC de ambos vinos era la misma. Este descenso en la IC del mosto a lo largo de la fermentación ha sido observada previamente en otros estudios y se atribuye a la precipitación y/o a la unión de los antocianos con otros compuestos (Bautista-Ortín et al., 2004, Romero-Cascales et al., 2012). En el caso de la CAT y del IPT, al segundo día de fermentación se observó que se alcanzaron los valores máximos de estos índices en el tanque que contenía los hollejos tratados por PEAV, manteniéndose, en este momento, las diferencias que se habían observado al final de la maceración. Estas diferencias tendieron a desaparecer a medida que continuó la fermentación debido a que mientras que en el tanque que contenía los hollejos tratados se mantuvieron constantes el CAT y el IPT, en el tanque control estos índices continuaron aumentando progresivamente a lo largo de toda la fermentación. Según estos resultados, a los dos días de fermentación tras la maceración en frío se podrían retirar los hollejos del tanque que contenía la uva tratada por PEAV sin que se viera afecta el CA y el IPT. La retirada de los hollejos antes de que finalizar la fermentación alcohólica permitiría mejorar la rotación de los depósitos en la bodega debido a que estos ocupan aproximadamente el 20% del volumen de los depósitos de fermentación-maceración. Caracterización físico-química de los vinos de Garnacha obtenidos La Tabla 2 muestra los parámetros físico-químicos de los vinos obtenidos tras un periodo de maceración en frío de 8 días utilizando una uva control y una uva tratada por PEAV justo antes del embotellado del vino. Se observa que el tratamiento de PEAV no afectó significativamente al contenido en etanol y ph ni a la acidez total y volátil del vino obtenido. Estos resultados confirman otros obtenidos previamente en vinos elaborados con uva tratada por pulsos eléctricos de alto voltaje a escala de planta piloto con vinificaciones de 100 kg (Puértolas et al. 2009a). Por lo que respecta a los parámetros cuyos valores dependen de la extracción de compuestos fenólicos, no había diferencias significativas en la IC, el contenido en taninos y el CAT de ambos vinos. Sin embargo, el vino elaborado con hollejos tratados por pulsos eléctricos de alto voltaje tenía un IPT un 8,5 % mayor. Tabla 2. Parámetros físico-químicos del vino control y del vino elaborado con uva tratada por pulsos eléctricos de alto voltaje antes del embotellado. Vino control Vino PEAV Etanol (% v/v) 17,2 16,1 ph 3,55 3,65 Acidez total (g de ácido tartárico/l) 5,82 5,51 Acidez volátil (g de ácido acético/l) 0,69 0,58 Contenido de antocianos totales (CAT)(mg/L) 473,41 475,68 Indice de polifenoles totales (IPT) 50,6 54,9 Taninos (g/l) 1,62 1,77 Intensidad de color 13,1 12,8 %Rojo 59,9 57,4 Evaluación sensorial Por lo que respecta a los análisis sensoriales, el panel de cata diferenció significativamente (p<0,05) ambos vinos con un porcentaje de acierto del 75%. Por otro lado, el 68 % de los catadores prefirieron el vino elaborado con uva tratada por PEAV en el análisis sensorial de preferencia.

6 CONCLUSIONES Se ha demostrado, por primera vez, en una prueba realizada en una bodega experimental que la permeabilización de los hollejos de la uva mediante un tratamiento de PEAV favoreció la extracción de compuestos fenólicos durante el periodo de maceración prefermentativa en frío del vino tinto sin afectar negativamente a las propiedades sensoriales del vino obtenido. Dicho tratamiento podría incrementar la concentración de compuestos fenólicos y la intensidad del color del mosto antes del inicio de la fermentación o reducir el tiempo de maceración prefermentativa en frío lo que conllevaría un ahorro energético y una mejora de la rotación de los depósitos en bodega. Para confirmar este extremo se requerirían nuevos estudios en los que se compare vinos elaborados con uva tratada por PEAV con distintos tiempos de maceración prefermentativa AGRADECIMIENTOS E. L. agradece al Departamento de Industria e Innovación del Gobierno de Aragón el apoyo financiero de su beca predoctoral y a Bodegas Aragonesas por su colaboración en esta investigación. REFERENCIAS Bautista-Ortín A.B., Fernández-Fernández J.J., López-Roca J.M., Gómez-Plaza E. (2004) Wine-making of high coloured wines: extended pomace contact and run-off of juice prior to fermentation, Food Science and Technology International, 10, Busse-Valverde N., Gómez Plaza E., López-Roca J.M., Gil-Muñoz R., Fernández-Fernández J.I., Bautista-Ortin AB. (2010) Effect of different enological practices on skin and seed proanthocyanidinis in three varietal wines, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 58, Del Llaudy M.C., Canals R., Canals M.J., Zamora F. (2008) Influence of ripening stage and maceration length on the contribution of grape skins, seeds, and stems to phenolic composition and astringency in wine-simulated macerations, European Food Research and Technology, 226, Glories Y. (1984b) La coleur des vins rouges. II. Mesure, origine et interpretation, Connaissance de la Vigne et du Vin, 18, Hidalgo-Togores J. 2003a. Tratado de Enología. Tomo I. Mundi-Prensa: Madrid. López N., Puértolas E., Condón S., Álvarez I., Raso J. (2008a) Effects of pulsed electric fields on the extraction of phenolic compounds during the fermentation of must of Tempranillo grapes, Innovative Food Science and Emerging Technologies, 9, Nichenametla S.N., Tarusicio T.G., Barney D.L., Exon J.H. (2006) A review of the effects and mechanisms of polyphenolics in cancer, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 46, Ortega-Heras M., Perez-Magarino S., Gonzalez-Sanjose M.L. (2012) Comparative study of the use of maceration enzymes and cold pre-fermentative maceration on phenolic and anthocyanic composition and colour of a Mencia red wine, LWT- Food Science and Technology, 48, 1-8. Pinelo M., Arnous A., Meyer A.S. (2006) Upgrading of grape skins: significance of plant cellwall structural components and extraction techniques for phenol release, Trends in Food Science and Technology, 17, Puértolas E., López N., Saldaña G., Álvarez I., Raso J. (2009a) Evaluation of phenolic extraction during fermentation of red grapes treated by a continuous pulsed electric fields process at pilot-plant scale, Journal of Food Engineering, 98, Puértolas E., Hernández-Orte P., Saldaña G., Álvarez I., Raso J. (2010a) Improvement of winemaking process using pulsed electric fields at pilot-plant scale. Evolution of chromatic parameters and phenolic content of Cabernet Sauvignon red wines, Food Research International, 43, Puértolas E., López N., Condón C., Alvarez I., Raso J. (2010b) Potential applications of PEF to improve red wine quality, Trends Food Science and Technology, 21, Rice-Evans C.A., Miller N.J., Paganga G. (1996) Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids, Free Radical Biology and Medicine, 20,

7 Romero-Cascales I., Ros-Garcia J.M., Lopez-Roca J.M., Gomez-Plaza E. (2012) The effect of a commercial pectolytic enzyme on grape skin cell wall degradation and colour evolution during the maceration process, Food Chemistry, 130, Sacchi K.L., Bisson L.F., Adams D. (2005) A review of the effect of winemaking techniques on phenolic extraction in red wines, American Journal of Enology and Viticulture, 56, Zamora F. (2003) Elaboración y crianza del vino tinto: Aspectos científicos y prácticos. AMV: Madrid.