ANÁLISIS CUANTITATIVO DE MEZCLAS COMPLEJAS EN MEDIO FARMA POR ESPECTROSCOPIA RAMAN
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- Pascual Río Ortíz
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1 î TECNOLOGÍA DE LABORATORIO Dr. Enrique Lozano Diz B&WTek MsC Jaime de Sousa Gómez Microbeam ANÁLISIS CUANTITATIVO DE MEZCLAS COMPLEJAS EN MEDIO FARMA POR ESPECTROSCOPIA RAMAN La capacidad de la espectroscopia Raman para realizar análisis cuantitativos precisos y sencillos es menos conocida que la de otras técnicas espectroscópicas. Esto ha cambiado en la última década con la introducción en el mercado de instrumentación Raman de altas prestaciones portátiles (ref. 1). La espectroscopia Raman es una técnica espectroscópica que produce información precisa e inequívoca de los modos vibracionales de la materia. Tiene unas ventajas bien conocidas por el público afín, tales como la generación de una señal única y específica de cada sustancia, la capacidad de hacer análisis sin contacto directo con la muestra, el ser una técnica no destructiva, etc. (ref. 2). La Espectroscopia Raman es utilizada de forma intensiva para la realización de análisis cualitativos, gracias a su altísima especificidad en áreas como la identificación de materias primas en los almacenes farmacéuticos o industria química en general. Pero el uso de Raman cuantitativo ha estado relegado durante muchos años al ambiente de laboratorio y poco al análisis en proceso. La cuantificación en espectroscopia Raman ha experimentado un avance muy importante en los últimos 5-10 años, principalmente impulsada por el interés en algunas industrias para obtener más y mejor información del proceso productivo. La capacidad única de la espectroscopia Raman para usar fibras ópticas de casi cualquier longitud, su uso con sondas de inmersión directamente en reactores y su capacidad única para producir información espectros de manera clara y precisa a cerca de lo ocurre en un reactor, o incluso para identificar y cuantificar mezclas complejas, hacen que la técnica sea en los últimos años muy demandada por la industria farmacéutica para procesos de PAT -Process Analytical Technology-. La cuantificación en espectroscopia Raman no es una técnica de cuantificación directa, sino basada en análisis quimiométricos, es decir, requiere del uso de curvas de calibración. En este artículo, se presentarán los resultados obtenidos con instrumentos portátiles i-raman Plus de B&WTek en dos puntos diferentes del proceso productivo farmacéutico: primeramente, la cuantificación at-line de una mezcla de azúcares para su uso en una formulación y un segundo caso, relativo a la cuantificación de un API -Active Pharmaceutical Ingredient- en una formulación terminada. Con estos ejemplos se pretende demostrar el enorme potencial que la espectroscopia Raman tiene hoy para las aplicaciones PAT, siendo ambos casos ejemplos típicos de aplicaciones en la industria Farma actual, contemplando un ejemplo de un API y un ejemplo de un excipiente. Caso 1: análisis cuantitativo de mezclas de excipientes Las mezclas de azúcares tienen amplio uso en la industria farmacéutica como excipientes, a tal fin, la correcta valoración y cuantificación de su concentración es importante. Con este estudio se demuestra la capacidad de la técnica para cuantificación 68 SEPTIEMBRE/OCTUBRE15 FARMESPAÑA INDUSTRIAL
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3 TECNOLOGÍA DE LABORATORIO Figura 1. Figura 2. Figura 3. de mezclas complejas en la industria Farma de manera rápida y sencilla. Introducción Como se ha mencionado, el Raman es una herramienta espectroscópica ampliamente desarrollada para la identificación molecular y es generalmente aceptada para el análisis cualitativo donde puede proporcionar una identificación rápida de materiales, a menudo en su punto de uso o entrega. Debido a la alta resolución que puede proporcionar, también se utiliza para la elucidación estructural así como el análisis cuantitativo (ref 3). Un beneficio de Raman sobre otras herramientas espectroscópicas moleculares es que puede ser utilizado para medir soluciones acuosas. En este estudio, hemos utilizado las soluciones espectroscópicas de BWTek, tanto la instrumentación Raman como el software quimiométrico BWIQ para desarrollar un modelo de calibración cuantitativa para determinar las concentraciones de glucosa, fructosa y sacarosa en una mezcla acuosa terciaria. BWIQ es un paquete de software de análisis multivariable para el análisis de datos espectrales y se puede utilizar para explorar las relaciones entre los espectros y los datos de respuesta, o bien entre los espectros y los tipos de muestra. BWIQ combina métodos tradicionales quimiométricos, como el de Regresión de Mínimos Cuadrados Parciales (PLSR) y el Análisis de Componentes Principales (PCA), con nuevos métodos como la adaptación iterativa reponderada de los mínimos cuadrados penalizados (airpls) y algoritmos de Maquina de Apoyo Vector (SVM). Tabla 1. Experimentación y Resultados Para este estudio, se eligió el i-raman Plus de B&WTek, ya que es el espectrómetro Raman portátil más sensible del mercado. Se utilizó una sonda de fibra óptica para recoger los espectros a través de viales de centelleo de vidrio. Se preparó un conjunto de 31 muestras estándar con cantidades conocidas de glucosa, fructosa y sacarosa en agua destilada, siguiendo un diseño experimental para el desarrollo de una curva de calibración. La concentración total en cada muestra fue de 0,4 M de azúcar. Los espectros Raman se recogieron en el rango de cm -1 bajo las siguientes condiciones: 785nm de longitud de onda de excitación, potencia de salida de 300 mw y un tiempo de integración de 50 segundos. Los espectros representativos de las soluciones de los azúcares individuales se muestran en la Figura 1. Se recogieron un total de 62 espectros (cada muestra por duplicado) con concentraciones variadas de los tres componentes y se importaron al software BWIQ para su análisis. Cincuenta espectros (25 muestras digitalizadas por duplicado) fueron elegidos como el conjunto de calibración y los 12 restantes se utilizaron como un conjunto de predicción. Los datos se utilizaron sin ningún tipo de pre-procesado. La curva de calibración se creó usando el método de regresión PLS1 sobre los datos encontrados en la región espectral de cm -1. En la Figura 2 se muestra una superposición de las muestras con concentración variable. Se desarrolló un modelo PLS de tres factores para cada uno de los tres componentes. Las concentraciones se representaron gráficamente para mostrar la exactitud del modelo. Los resultados para la glucosa se muestran en la Figura 3, y tienen un valor R2 mayor a 0,999 para las concentraciones medidas y predichas. Del mismo modo se calcularon la RMSEC y RMSEP, siendo inferiores a 0,008. Las muestras que no fueron utilizadas en la calibración se utilizaron como conjunto de predicción utilizando el modelo de calibración desarrollado en el software BWIQ. Los modelos se utilizaron para determinar con éxito la concentración en estas muestras. A partir de este experimento, hemos demostrado el uso exitoso del espectrómetro Raman portátil i-raman Plus con software BWIQ para desarrollar un modelo cuantitativo para determinar la concentración de glucosa en mezclas acuosas terciarias de glucosa, sacarosa, fructosa tal y como se muestra en la Figura 1. Caso 2: análisis cuantitativo de apis en mezclas combinadas y pastillas Hemos hecho una demostración de la validez de la técnica para un caso de una mezcla de excipientes, haciendo un seguimiento at-line, continuando con la exposición de ejemplos del proceso productivo farmacéutico, exponemos ahora el caso de un principio activo en un proceso distinto de la línea productiva. Introducción Las pastillas de origen farmacéutico consisten habitualmente en un Ingrediente Farmacéutico Activo (API) con excipientes que incluyen entre otros rellenos, aglutinantes, y lubricantes. En la fabricación de la pastilla, la mezcla es el proceso donde los API y los diversos excipientes se juntan para formar una mezcla homogénea. El control de proceso de mezclado es muy importante para la calidad de la pastilla final, y el control de los procesos de mezcla puede ser muy difícil cuando se trata de la detección o caracterización de las variaciones de las materias primas y la homogeneidad de la mezcla final. La guía de la FDA (ref 4) en el control de procesos de fabricación farmacéutica indica que cada lote incorporado en 70 SEPTIEMBRE/OCTUBRE15 FARMESPAÑA INDUSTRIAL
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5 TECNOLOGÍA DE LABORATORIO Figura 4. Figura 5. Figura 6. una mezcla debe cumplir con las especificaciones de pureza establecidas de los API; también, la validación de la mezcla debe mostrar la homogeneidad del lote mezclado para APIs mezclados en seco. La espectroscopía Raman resulta particularmente beneficiosa en la calidad del producto final obtenido, por su capacidad de determinación de productos intermedios. Experimentación y Resultados En este estudio, la espectroscopia Raman, así como la quimiometría, se utilizó para establecer el método analítico para cuantificar el API Clorhidrato de Naltrexona (Naltrexone HCl) en mezclas de polvos, así como en el producto final de comprimidos de 3mg (tabla 1). Se ha vuelto a utilizar un i-raman Plus con láser de 785nm y una sonda de fibra óptica. Un soporte de sonda se utiliza para proporcionar estabilidad para el muestreo y recolección de datos, lo cual es muy importante en la precisión del modelo quimiométrico. Los espectros se recogieron en tres lugares diferentes de cada muestra a través de bolsas de plástico. Todas las mediciones se tomaron a 100% de potencia láser (~ 300 mw) con un tiempo de integración de 6s. El software BWIQ se utilizó para el análisis quimiométrico. La Figura 4 compara los espectros Raman para las muestras con diferentes concentraciones del API frente a la de 100%. Los picos Raman distintivos pertenecientes al Clorhidrato de Naltrexona destacan en los espectros Raman de las muestras utilizadas para construir el modelo quimiométrico. Mediante la recopilación de múltiples espectros de diferentes ubicaciones en una muestra, la uniformidad del API dentro de las mezclas de fusión es tenida en cuenta, así en el modelo quimiométrico se construye una representación más completa de las mezclas. Con el fin de eliminar la variabilidad que da la fluorescencia, a los datos se les corrigió la línea base utilizando un algoritmo de adaptación iterativa reponderada de los mínimos cuadrados penalizados (airpls) proporcionado en el BWIQ. La Figura 5 ilustra la eliminación del fondo para un espectro. Con la concentración de Clorhidrato de Naltrexona (mg / comprimido) establecido como la señal respuesta, se utilizó la regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS) para la construcción del modelo. Dado que las bandas Raman para el Clorhidrato de Naltrexona están dentro del rango de cm -1, la regresión PLS se realizó en ese mismo rango. El modelo da un buen ajuste lineal a los datos (R2 = , RMSEC = 0,01384), como se muestra en la Figura 6. Algunos espectros de la muestra estaban reservados para la validación cruzada. El modelo da un ajuste lineal a los datos de validación (R2 = , RMSECV = 0,05287). Los resultados previstos sobre los dos comprimidos (3 mg) se muestran en la Tabla 2. Se recogieron dos espectros de cada muestra. La falta de uniformidad física dentro de una muestra (en polvo o pastilla) podría afectar directamente a la precisión del modelo. Se necesitan múltiples mediciones a diferentes ubicaciones dentro de una muestra para la recogida de los espectros de calibración. Dicho esto, una estimación de la uniformidad del API en la muestra también se puede evaluar cuando se conocen las concentraciones reales del API en las muestras de predicción. Las buenas prácticas requieren que las muestras estándar con concentraciones conocidas del API se utilicen para verificar la Tabla 2. estabilidad del método, así como el hardware, en una base periódica regular. Conclusiones La espectroscopia Raman con quimiometría se puede usar para desarrollar un modelo cuantitativo para determinar la concentración de glucosa en mezclas acuosas terciarias de glucosa, sacarosa, fructosa tal y como se muestra en la Figura 1. Este es un ejemplo de uso de la espectroscopía Raman para hacer mediciones at-line en el análisis de un proceso mientras tiene lugar La espectroscopia Raman con quimiometría se puede utilizar también para medir la concentración de API, tales como el Clorhidrato de Naltrexona, en mezclas de compuestos y las pastillas de producto final. El método proporciona predicciones rápidas de las concentraciones de API en las mezclas, lo que permite su uso en el monitoreo en línea para procesos de mezclado. La alta sensibilidad, alta resolución, y la estabilidad del instrumento i-raman Plus cumplen con los requisitos para el desarrollo de métodos de análisis Raman cuantitativos fiables Referencias: Ref1: Ref2: An implementation Perspective on Handheld Raman Spectrometers for the Verification of Material Identity: B. Diehl, C.S. Chen, B. Grout, J. Hernandez, S. O Neill, C. McSweeney, J. M. Alvarado and M. Smith, Pfizer Inc; European Pharmaceutical Review, Non-destructive Materials Identification Supplement, Volume 17, Issue 5, 2012, wp-content/uploads/raman-supplement-2012.pdf Ref3: MJ Pelletier Applied Spectroscopy 57, 20A-42A (2003) Ref4: 72 SEPTIEMBRE/OCTUBRE15 FARMESPAÑA INDUSTRIAL
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