LEER CAMBIOS SOMBREADOS

Transcripción

1 BIO-FLASH CMV IgG tests BIO-FLASH CMV IgG es un inmunoensayo quimioluminiscente de dos pasos totalmente automatizado para la determinación semicuantitativa de anticuerpos IgG anti-citomegalovirus en suero o plasma humano con el instrumento BIO-FLASH. Sumario El citomegalovirus (CMV) humano pertenece al grupo de los Herpesvirus, que también incluye los Herpes virus simplex tipo 1 y 2, el virus de la Varicela Zoster y el virus Epstein-Barr. Una característica común de estos virus es que pueden causar infecciones latentes. 1 El CMV es un agente ubicuo que normalmente infecta a individuos de diversas áreas geográficas y económicas. La mayor parte de la población se ve infectada por el virus en algún momento de su vida; hasta un 81% de los individuos de Estados Unidos mayores de 35 años han estado expuestos al virus. 2 Una característica del CMV consiste en que, tras la infección primaria, el virus puede persistir en forma latente durante mucho tiempo y puede reactivarse en un momento dado. La infección, reinfección o reactivación del CMV en adultos normales y niños generalmente es leve o asintomática. Sin embargo, las infecciones en pacientes inmunodeprimidos, con cáncer o como resultado de una infección intrauterina o perinatal pueden derivar en casos clínicamente graves. 1-8 Las transfusiones de sangre y el transplante de órganos son causa importante de infección por CMV en pacientes inmunodeprimidos. 9 Se puede prevenir la transmisión del CMV a receptores de órganos mediante la selección de los donantes, que han de ser seronegativos de anticuerpos anti-cmv. La reactivación, debido a terapias inmunosupresivas, de virus latentes endógenos es otra causa importante de patología en pacientes inmunodeprimidos. 10 La detección de un aumento significativo de anticuerpos IgG específicos para CMV en sueros pareados y la detección de anticuerpos IgM específicos para CMV aportan información al diagnóstico serológico de infección por CMV. Las pruebas serológicas para la detección de anticuerpos anti-cmv son importantes en la determinación de la existencia de una infección previa, en el diagnóstico de una infección activa o reciente así como en el análisis de sangre para practicar transfusiones a recién nacidos y receptores inmunodeficientes. 11 Principio Cuando las micropartículas paramagnéticas de BIO-FLASH CMV IgG se mezclan e incuban con la muestra, si ésta presenta anticuerpos específicos anti-cmv, éstos se combinan con los antígenos de CMV que recubren las micropartículas. Después de una separación magnética y lavado para eliminar la muestra residual, se añade un trazador consistente en un anticuerpo monoclonal anti-igg humana marcado con isoluminol que se une a los anticuerpos IgG anti-cmv capturados por las micropartículas. Tras una segunda incubación, separación magnética y otro lavado, se añaden los reactivos que activan la reacción quimioluminiscente. El luminómetro del BIO-FLASH mide la luz emitida como unidades relativas de luz (URL) que son directamente proporcionales a la concentración de IgG anti-cmv de la muestra. El BIO-FLASH utiliza un método de reducción de datos con ajuste a una curva logística de 4 parámetros (4PLC) para generar una Curva de Calibración Maestra (CCM). Esta curva viene predefinida, depende del lote y se almacena en el instrumento a través del código de barras del cartucho. Con la medición de los calibradores (que se suministran en un kit aparte), la CCM predefinida se transforma en una Curva de Calibración de Trabajo (CCT) nueva y específica para el instrumento. Las concentraciones de los calibradores están incluidas en los códigos de barras de los tubos de calibradores. Esquema de la reacción: LEER CAMBIOS SOMBREADOS Activadores (Triggers) URL Partícula magnética Muestra Trazador Emisión de luz

2 Componentes Cartucho de reactivos El kit BIO-FLASH CMV IgG contiene un cartucho de reactivos para 50 determinaciones (REF ). Nota: El diseño del cartucho está protegido por patente (US D565,741 / Diseño CE ) Composición del cartucho de reactivos: El cartucho se compone de 4 viales que contienen: A. 1 vial cilíndrico de suspensión de micropartículas recubiertas con antígeno de CMV en tampón de glicina. Contiene < 0,1% de azida sódica. B. 1 vial de tampón de ensayo. Contiene < 0,1% de azida sódica. C. 1 vial opaco de trazador que consiste en anticuerpo monoclonal murino anti-igg humana marcado con isoluminol. Contiene < 0,1% de azida sódica. D. 1 vial vacío. Preparación Véase la figura siguiente. Cartucho: las micropartículas sedimentan durante su transporte y almacenamiento, por lo que se tienen que mezclar para volverlas a resuspender. La primera vez que vaya a utilizar el cartucho, inviértalo suavemente 30 veces sin que se forme espuma (las burbujas pueden hacer que los sensores de líquido del instrumento den lecturas erróneas). Compruebe que las micropartículas se hayan resuspendido totalmente. Si no es así, siga invirtiendo el cartucho hasta que se resuspendan en su totalidad. Si las micropartículas no se resuspenden o detecta que el precinto de los reactivos está roto, NO UTILICE EL CARTUCHO. Una vez resuspendidas las micropartículas, sitúe el cartucho sobre una superficie sólida y retire con cuidado la lengüeta roja de seguridad para el transporte. Manteniendo el cartucho en la superficie sólida, apriete las dos pestañas situadas a los lados del tapón perforador (parte gris) y presione la parte superior del cartucho hasta que quede en posición de bloqueo. Una vez en posición de bloqueo, las pestañas tienen que quedar ocultas. No invierta el cartucho abierto. Deje reposar el cartucho durante 5 minutos antes de cargarlo en el instrumento. Una vez cargado el cartucho, el instrumento mezcla su contenido de forma automática a intervalos periódicos.

3 Precauciones Los reactivos BIO-FLASH son para diagnóstico IN VITRO. Uso exclusivo para profesionales. La azida sódica puede reaccionar con tuberías y desagües de plomo o cobre dando lugar a azidas metálicas altamente explosivas. Al desechar los restos de reactivos, deje correr agua abundante. ATENCIÓN: MATERIAL DE RIESGO BIOLÓGICO. Deseche todos los materiales usados en recipientes adecuados para material biocontaminante. Por favor, no reutilice ni reintroduzca reactivos en los cartuchos o viales. Recolección y conservación de las muestras Usar suero fresco (también se pueden utilizar tubos con gel separador de suero) o plasma (EDTA, Li-heparina, Li-heparina en tubo con gel separador, Na-heparina y Na-citrato). Otros anticoagulantes deben ser comprobados antes de utilizarse. Los anticoagulantes líquidos como el Na-citrato ejercen un efecto de dilución y pueden reducir la concentración de muestras de pacientes. Las muestras no deben ser inactivadas por calor. Las partículas en suspensión deben eliminarse por centrifugación. En las directrices CLSI H18-A3 y H21-A5 encontrará más información sobre la manipulación, el transporte, el procesamiento y la conservación de las muestras. Suero Las muestras de suero pueden ser conservadas entre 2-8 C durante 8 días. Si es por un período de tiempo más largo, deben ser congeladas a una temperatura igual o inferior a -20 C. Las muestras pueden congelarse/descongelarse un máximo de 3 veces. Mezclar bien después de descongelarlas. Compruebe que no haya burbujas en las muestras y, en caso contrario, elimínelas en su totalidad antes del análisis. Plasma Las muestras de plasma pueden ser conservadas entre 2-8 C durante 8 días. Si es por un período de tiempo más largo, deben ser congeladas a una temperatura igual o inferior a -20 C. Descongelar el plasma a 37 C. Descongelar las muestras sólo una vez. Mezclar bien después de descongelarlas. Compruebe que no haya burbujas en las muestras y, en caso contrario, elimínelas en su totalidad antes del análisis. Volumen de muestra El volumen de muestra necesario para realizar una única prueba con BIO-FLASH CMV IgG varía en función del tipo de recipiente que se utilice. Una prueba requiere al menos 10 µl más el volumen muerto, que es de 200 µl si se utiliza la copa de muestra recomendada (REF ). Otros materiales Los siguientes materiales no se suministran con el cartucho de reactivos y deben adquirirse por separado. REF REF BIO-FLASH CMV IgG Calibrators (Calibradores) BIO-FLASH CMV IgG Controls (Controles) Lea detenidamente las instrucciones correspondientes si desea más información. No utilice otros calibradores. La información que necesita el instrumento BIO-FLASH para calibrar el ensayo BIO-FLASH CMV IgG está incluida en los códigos de barras de los viales. Utilizar controles de otros fabricantes puede dar lugar a resultados imprevistos. Asegúrese de que en el instrumento BIO-FLASH haya una cantidad suficiente de los siguientes consumibles antes de procesar muestras, calibradores o controles: REF BIO-FLASH Cuvettes (Cubetas) Nota: El diseño de las cubetas está protegido por patente (US D560,816 / Diseño CE ) REF REF BIO-FLASH Triggers (Activadores) BIO-FLASH System Rinse (Solución del sistema) El siguiente consumible es necesario si se activa la opción de re-run automático. REF BIO-FLASH Sample Diluent (Diluyente de las muestras) Instrumento / realización del ensayo En el Manual del Usuario del BIO-FLASH encontrará las instrucciones completas para realizar el ensayo.

4 Calibración El código de barras del cartucho contiene una Curva de Calibración Maestra (CCM) que es válida para el lote de reactivos. Sin embargo, para todos los reactivos se necesita una Curva de Calibración de Trabajo (CCT), que es específica para cada lote y válida hasta la fecha de caducidad de éste. Se debe obtener una nueva CCT cuando los resultados de los controles salgan fuera del rango de aceptación o cuando se hayan realizado ajustes en el instrumento. Lea detenidamente el Manual del Usuario del BIO-FLASH para configurar una CCT. Control de calidad Para realizar un programa completo de control de calidad se recomiendan dos niveles de control. Los controles BIO-FLASH CMV IgG negativo y positivo se han diseñado para dicho programa. Los controles se deben analizar al menos cada 24 horas por día de utilización. Asegúrese de que los resultados de los controles se encuentran dentro del rango de aceptación ya que, si no es así, puede ser indicativo de resultados no válidos, ante los que el usuario deberá tomar medidas correctivas. En este caso, verifique todos los resultados obtenidos desde la última comprobación de control de calidad aceptable del analito en cuestión. Puede resultar necesario recalibrar el instrumento. En el Manual del Usuario del instrumento encontrará más información. Para la identificación y resolución de situaciones anormales de control de calidad, consulte Westgard et al. 12 Conservación y estabilidad Los reactivos que no se hayan abierto se mantienen estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del cartucho si se conservan entre 2-8 C en posición vertical. Una vez abierto, la estabilidad del cartucho cargado en el instrumento BIO-FLASH o guardado a 2-8 C es de 5 semanas. Trazabilidad de calibradores y controles Dado que no hay disponible un estándar internacional, los resultados se expresan en UA/mL y fueron asignados mediante múltiples ensayos con el instrumento BIO-FLASH utilizando lotes específicos de reactivos, frente a patrones internos. Interpretación de resultados La cantidad de analito en cada muestra se determina a partir de la luz emitida (URL) mediante interpolación en la Curva de Calibración de Trabajo almacenada. La determinación de las IgG anti-cmv con el ensayo BIO-FLASH CMV IgG ayuda a determinar el estado inmunitario del paciente: Las muestras con una concentración < 8,0 UA/mL se consideran no reactivas (negativas). Las muestras con una concentración 8,0 y < 10,0 UA/mL se consideran indeterminadas (zona gris). Las muestras que se interpreten como indeterminadas deben reanalizarse. Si al reanalizarse se obtiene un resultado indeterminado, se debe reportar como tal y debe realizarse otro ensayo con un método alternativo o debe obtenerse y analizarse una segunda muestra. Las muestras con una concentración 10,0 UA/mL se consideran reactivas (positivas) para IgG anti-cmv. Un resultado positivo indica una infección pasada o aguda por CMV. Un aumento significativo en la concentración de anticuerpos IgG anti-cmv en muestras pareadas tomadas con intervalo de 2-4 semanas, analizadas al mismo tiempo, puede ser indicativo de una infección reciente o de reactivación. No obstante, para el diagnóstico se recomienda acompañar este procedimiento con la detección del ADN del virus en leucocitos o en sangre mediante técnicas de amplificación y la detección de anticuerpos IgM anti-cmv específicos. El ensayo BIO-FLASH CMV IgM REF resulta adecuado para esta finalidad. Limitaciones El resultado de una única muestra no es suficiente para diagnosticar una infección reciente por CMV o su reactivación. Por tanto, además de los resultados de BIO-FLASH CMV IgG deben tenerse en cuenta otros datos como, por ejemplo, la sintomatología, la historia clínica, los resultados de otras pruebas, y demás información relevante. El ensayo es semicuantitativo. No diluya las muestras que se encuentren dentro de los límites de trabajo. Si la opción de re-run automático está activada, algunas de las muestras con valores superiores al límite superior pueden reportar resultados inferiores a los esperados.

5 Resultados esperados La prevalencia de la infección por CMV en poblaciones adultas varía enormemente en diversas áreas del mundo, e incluso entre diferentes grupos socioeconómicos y de edad en una misma zona geográfica. En un estudio interno, la prevalencia de seropositividad hallada en 642 muestras aleatorias de donantes de sangre de Barcelona, España, se situaba en un 70%. Alrededor del 50% de los adultos jóvenes de Europa Central están infectados por CMV. En la población de mayor edad, la seropositividad alcanza el 70-80%. 13 Características funcionales Nota: los datos siguientes son representativos; los resultados en experimentos aislados pueden variar respecto a estos datos. Comparación de métodos BIO-FLASH CMV IgG se evaluó en estudios comparativos con otros ensayos comerciales. Evaluación interna Se analizó con BIO-FLASH CMV IgG un panel de muestras de distinta procedencia que incluía sueros positivos y negativos de anticuerpos IgG anti-cmv y los resultados se compararon con los obtenidos con un método de EIA CMV IgG comercial. En los cálculos no se tuvieron en cuenta los resultados indeterminados. Método de referencia BIO-FLASH CMV IgG NEG POS Total IND NEG POS Total Se obtuvieron los siguientes resultados iniciales de sensibilidad y especificidad relativas y concordancia global: Sensibilidad relativa Especificidad relativa Concordancia global ,8% 98,7% a 100,0% 100,0% 98,2% a 100,0% 99,8% 99,1% a 100,0% Se utilizaron otros métodos comerciales de CMV IgG para probar muestras de este panel y se resolvieron algunos de los resultados discrepantes. El resumen de los resultados de consenso, excluidas las 5 muestras indeterminadas con BIO-FLASH CMV IgG y las 3 muestras para las que no se llegó a un consenso, se muestra en la siguiente tabla: Consenso BIO-FLASH CMV IgG NEG POS Total NEG POS Total Frente al consenso se obtuvieron los siguientes resultados de sensibilidad, especificidad y concordancia global: Sensibilidad vs. consenso Especificidad vs. consenso Concordancia vs. consenso ,8% 98,7% a 100,0% 100,0% 98,1% a 100,0% 99,8% 99,1% a 100,0% Evaluación externa Se realizó una evaluación externa en el Servei de Microbiologia del Hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona (España). Las muestras fueron caracterizadas mediante otro método MEIA CMV IgG comercial y analizadas con BIO-FLASH CMV IgG. En los cálculos no se tuvieron en cuenta los resultados indeterminados.

6 Método de referencia BIO-FLASH CMV IgG NEG POS Total IND NEG POS Total Se obtuvieron los siguientes resultados iniciales de sensibilidad y especificidad relativas y concordancia global: Sensibilidad relativa Especificidad relativa Concordancia global ,4% 96,0% a 99,6% 98,3% 95,0% a 99,6% 98,3% 96,6% a 99,3% Las muestras discrepantes se analizaron con un método ELFA CMV IgG comercial. Tras el ensayo adicional se obtuvieron los siguientes resultados finales de sensibilidad, especificidad y concordancia global: Sensibilidad final Especificidad final Concordancia global final ,4% 96,0% a 99,6% 98,8% 95,8% a 99,9% 98,6% 96,9% a 99,5% Panel SeraCare-BBI Se analizó el panel comercial de BBI panel de título mixto anti-cmv PTC202, que se compone de 11 muestras caracterizadas. Los resultados del ensayo BIO-FLASH CMV IgG concordaron en todos los casos con el consenso de resultados de la mayoría de fabricantes. Panel CDC El panel de sueros CMV IgG de la CDC compuesto por 53 muestras de suero positivas y 47 muestras de suero negativas fue analizado con el ensayo BIO-FLASH CMV IgG con un resultado de sensibilidad y especificidad del 100,0%. En los cálculos no se tuvo en cuenta un resultado indeterminado de BIO-FLASH. Precisión Se evaluó, conforme a las directrices CLSI EP05-A, la precisión intra-ensayo y total (ensayo a ensayo y día a día) en múltiples ensayos. Los resultados se resumen en la tabla siguiente: Media (UA/mL) CV% (Intra-ensayo) CV% (Total) Control negativo 5,1 7,3 13,3 Control positivo 121,9 7,2 10,9 Alrededor del valor de corte 12,2 6,8 10,0 Reproducibilidad Se evaluó la reproducibilidad entre réplicas, entre lotes y entre instrumentos. Los resultados se muestran en la tabla siguiente: Pendiente Intersección R Réplica 2 vs. Réplica ,01 1,00 a 1,04 0,00-0,53 a 0,46 1,00 0,99 a 1,00 Lote 2 vs. Lote ,08 1,05 a 1,12-0,08-1,14 a 0,05 0,99 0,98 a 1,00 Instrumento 2 vs. Instrumento ,04 1,02 a 1,08 0,00-2,01 a 0,30 0,99 0,99 a 1,00 Interferencias Estudios conforme a las directrices CLSI EP7-A han demostrado que las siguientes sustancias potencialmente interferentes no alteran los resultados de BIO-FLASH CMV IgG: Sustancia potencialmente interferente Concentración % Interferencia Hemoglobina 500 mg/dl 10 Bilirrubina indirecta 18 mg/dl 10 Bilirrubina directa 18 mg/dl 10 Triglicéridos 1300 mg/dl 10

7 Reactividad cruzada Cuando se analizaron 102 muestras con potencial de producir reacción cruzada con el ensayo BIO-FLASH CMV IgG y se compararon los resultados con ensayos comerciales de CMV IgG, se evidenció la siguiente concordancia: Reacción cruzada potencial Concordancia IgG frente a rubéola 4/4 Anti-Toxo IgG (anticuerpos frente a Toxoplasma gondii) 8/8 Anti-HIV (anticuerpos frente al virus de la inmunodeficiencia humana) 6/6 HAMA (anticuerpo humano antimurino) 5/5 SLE (lupus eritematoso sistémico) 1/1 ANA (anticuerpos antinucleares) 10/10 Anti-EBV (anticuerpos frente al virus Epstein-Barr) 4/5 Anti-PV B19 (anticuerpos frente a Parvovirus B19) 6/6 Anti-HSV 1 (anticuerpos frente a Herpes simplex virus tipo 1) 4/5 Anti-VZV (anticuerpos frente al virus de la Varicela Zoster) 4/5 Paraproteínas IgG e IgM 6/6 IgG e IgM elevadas 5/5 Anticuerpos heterófilos 4/4 RF (Factor Reumatoide) 10/10 Mujeres embarazadas (multíparas incluidas) 22/22 Límite de detección Conforme a las directrices CLSI EP17-A, el límite de detección (LD) se sitúa en 0,3 UA/mL. Límite de cuantificación Conforme a las directrices CLSI EP17-A, el límite de cuantificación (LC) se sitúa en 0,7 UA/mL. Linealidad El ensayo BIO-FLASH CMV IgG es un ensayo semicuantitativo y el límite de trabajo se sitúa entre 0,7 y 800 UA/mL. Sin embargo, el límite de trabajo puede ampliarse hasta UA/mL mediante dilución si se habilita la opción de re-run automático. Consulte el Manual del Usuario del BIO-FLASH para habilitar la opción de re-run automático.