FACULTAD DE FARMACIA. Alumno:

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1 Cuaderno de Prácticas MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Curso FACULTAD DE FARMACIA Alumno:

2 LUNES ASPECTOS GENERALES Normas de bioseguridad en el laboratorio Medios de contención Niveles de bioseguridad Gestión y tratamiento de los residuos Aspectos generales infecciones urinarias Toma de muestra de orina REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA ANÁLISIS CUANTITATIVO ORINA ANÁLISIS CUALITATIVO ORINA ANÁLISIS CUALITATIVO MUCOSA FARÍNGEA L-1 L-2 L-3 L-4 L-5 Siembra de la muestra de orina (Bote nº 2) en Agar CLED Siembra de la muestra de orina (Bote nº 1) en Agar Cromogénico y Agar MacConkey Toma de muestra de mucosa faríngea Siembra de dos placas de Agar Sangre Siembra de una placa de Agar Salino Manitol 1

3 NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA LABORATORIO DE NIVEL DE BIOSEGURIDAD 2 Los agentes biológicos se clasifican en cuatro grupos de riesgo en función de los siguientes factores: Virulencia Dosis infectiva del microorganismo Disponibilidad de tratamiento Modo de transmisión en el laboratorio Riesgo de difusión en la comunidad Viabilidad del microorganismo en el entorno GRUPO DE RIESGO PATOGENICIDAD 1 No suelen causar enfermedad en personas sanas Causan infecciones moderadas o graves Las infecciones suelen ser de buen pronóstico Generalmente no se transmiten por vía aérea Se suelen transmitir por contacto o ingestión Es difícil su propagación en la comunidad Existen tratamiento y profilaxis eficaces Causan infecciones graves Algunos se transmiten por vía aérea Pueden propagarse en la comunidad La terapia es de eficacia variable Causan infecciones graves o muy graves Muchos se transmiten por vía aérea Se propagan fácilmente en la comunidad La terapia no es muy eficaz 2

4 GRUPO DE RIESGO 1 ALGUNOS EJEMPLOS BACTERIAS: Escherichia coli Staphylococcus epidermidis Lactobacillus bulgaricus Streptococcus lactis Streptomyces sp. HONGOS: Saccharomyces cerevisiae Penicillium roqueforti BACTERIAS: Bordetella pertussis Clostridium botulinum Clostridium tetani Corynebacterium diphtheriae Staphylococcus aureus Streptococcus sp. Haemophilus influenzae Salmonella enterica Shigella sp. Yersinia enterocolitica Legionella Neisseria sp. Treponema pallidum 2 HONGOS: Aspergillus sp. Candida sp. Cryptococcus neoformans VIRUS: Adenovirus Rotavirus Virus de la hepatitis A Virus de la gripe Virus del sarampión Virus de las paperas Virus de la rubéola PARÁSITOS: Cryptosporidium sp. Entamoeba histolytica Toxoplasma gondii Trichinella 3

5 BACTERIAS: Bacillus anthracis Brucella Escherichia coli enterotoxigénica Francisella tularensis Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium leprae Rickettsia Salmonella typhi Shigella dysenteriae Yersinia pestis 3 HONGOS: Blastomyces dermatitidis Coccidioides immitis Histoplasma capsulatum VIRUS: Virus de la encefalitis de California Virus de la encefalitis equina americana Virus de la estomatitis vesicular Virus de la hepatitis B Virus de la hepatitis C Virus de la hepatitis D Virus de la fiebre amarilla Virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) PARÁSITOS: Echinococcus Leishmania brasiliensis Leishmania donovani Plasmodium falciparum Taenia solium Tripanosoma cruzi 4 VIRUS: Virus de la viruela Virus de la fiebre hemorrágica de Crimea (Congo) Virus de Marburg Virus Ébola 4

6 Según el grupo de riesgo al que pertenezca un determinado microorganismo su estudio deberá ser llevado a cabo en laboratorios con mayores o menores medidas de bioseguridad. MICROORGANISMOS RIESGO PROVOCADO TIPO DE LABORATORIO GRUPO DE RIESGO 1 INDIVIDUAL Bajo COLECTIVO Bajo BÁSICO (Enseñanza) GRUPO DE RIESGO 2 INDIVIDUAL Moderado COLECTIVO Moderado SEGURIDAD (Hospital) GRUPO DE RIESGO 3 INDIVIDUAL Elevado COLECTIVO Elevado ALTA SEGURIDAD (Diagnóstico especializado) GRUPO DE RIESGO 4 INDIVIDUAL Elevado COLECTIVO Elevado MÁXIMA SEGURIDAD (Servicio estatal) Los microorganismos incluidos dentro del grupo de riesgo 2 constituyen la mayoría de los que se manipulan habitualmente en los Laboratorios de Microbiología Clínica. Por lo que se refiere a las prácticas de nuestra asignatura estos son los microorganismos que normalmente podremos encontrar en las muestras personales que se han tomado, y que se van a manipular tratando de establecer la identificación y susceptibilidad antimicrobiana de algunos de ellos. 5

7 MEDIOS DE CONTENCIÓN El término contención se utiliza para describir los métodos que hacen segura la manipulación de los agentes infecciosos en el laboratorio y su objetivo es reducir al mínimo la exposición del personal y del entorno a agentes potencialmente patógenos. Para la seguridad de los laboratorios de Microbiología Clínica son importantes tres elementos de contención: 1. BARRERAS PRIMARIAS: Constituyen la primera línea de protección y pertenecen a esta categoría los siguientes elementos: Batas Gorros Guantes Gafas Mascarillas Cabinas de Seguridad Biológica 2. BARRERAS SECUNDARIAS: Se refieren a las normas que deben cumplirse para la construcción de un Laboratorio de Microbiología Clínica tales como: Alicatado Paredes Grifos Interruptores Aparatos que generan ruido Aparatos que generan calor etc. 6

8 3. PROCEDIMIENTOS ESTÁNDAR: Se refieren a la metodología de funcionamiento del laboratorio y de la manipulación de las muestras clínicas. 1. Personal autorizado. El laboratorio de Microbiología Clínica es un espacio restringido y solo pueden permanecer en él personas autorizadas. Estas personas deben conocer al responsable de seguridad del laboratorio. 2. Meticulosidad en el trabajo. Las personas deben trabajar concentradas en las manipulaciones que están realizando y realizar todo su trabajo con meticulosidad para minimizar el riesgo de salpicaduras, pinchazos, cortes, formación de aerosoles, etc. 3. Costumbres improcedentes. Las personas no deben llevarse a la boca lápices u otros objetos. 4. Cabinas de bioseguridad. Las actividades que generan aerosoles o salpicaduras, tales como la esterilización del asa y la agitación en vortex, deben realizarse en cabinas de bioseguridad. También deben utilizarse cabinas de bioseguridad cuando se manipulen muestras clínicas sospechosas de contener agentes infecciosos de transmisión aérea, tales como las muestras respiratorias. 5. Material punzante y cortante. Es muy importante desechar el material punzante o cortante (agujas, hojas de bisturí, etc.) en recipientes específicos para ese material. No envainar las agujas una vez utilizadas. 6. Material contaminado Desechar el material contaminado en recipientes adecuados. Recipientes de seguridad para material de vidrio. Recipientes de plástico o metálicos para esterilización o incineración. 7. Lavado de las manos Se deben lavar las manos después de cada tarea o accidente. Siempre se deben lavar las manos ANTES DE SALIR DEL LABORATORIO. Utilizar jabón neutro y frotar al menos durante 20 segundos antes de aclarar con agua. 8. Informar al Responsable de Seguridad del Laboratorio Cualquier accidente o anomalía debe comunicarse al responsable de seguridad del laboratorio. 7

9 NIVELES DE BIOSEGURIDAD Existen cuatro niveles de bioseguridad que se corresponden con los cuatro grupos de riesgo en que se clasifican los agentes infecciosos. MUESTRA CLÍNICA SOSPECHOSA DE CONTENER MICROORGANISMOS TIPO DE LABORATORIO RECOMENDADO PARA SU ESTUDIO NIVEL DE BIOSEGURIDAD QUE DEBE TENER EL LABORATORIO Grupo de Riesgo 1 Básico 1 Grupo de Riesgo 2 Seguridad 2 Grupo de Riesgo 3 Alta Seguridad 3 Grupo de Riesgo 4 Máxima Seguridad 4 GESTIÓN Y TRATAMIENTO DE LOS RESIDUOS Ante la posibilidad de contraer infecciones en el laboratorio al manipular una muestra clínica o un cultivo, parece razonable realizar un tratamiento particularizado de los residuos infecciosos antes de eliminarlos como residuos urbanos. Objetos punzantes y cortantes Los objetos punzantes y cortantes, como agujas, pipetas Pasteur de vidrio y otros, constituyen un claro riesgo de inoculación accidental de microorganismos. Se depositan en recipientes específicos resistentes a la punción y con cierre hermético. Es muy importante cerrar correctamente estos recipientes, que deben ser autoclavados o incinerados antes de desecharlos. Líquidos infecciosos Los líquidos infecciosos deben recogerse en recipientes herméticos y someterlos a esterilización. Residuos sólidos Los residuos sólidos (muestras clínicas, medios de cultivo sembrados, etc.) deben ser incinerados o esterilizados por autoclave antes de ser desechados. 8

10 ASPECTOS GENERALES DE LAS INFECCIONES URINARIAS En una persona sana el tracto urinario está libre de microorganismos. Únicamente existe microbiota normal de forma permanente en la mucosa de la uretra. Las infecciones del tracto urinario están causadas generalmente por bacterias de la microbiota intestinal que, ascendiendo por la uretra, alcanzan la vejiga urinaria y en algunos casos progresan afectando a los uréteres y los riñones. Las infecciones urinarias se presentan con mayor frecuencia en las mujeres que en los hombres. Ello es debido a la cortedad de la uretra lo cual facilita el tránsito de la microbiota intestinal hasta la uretra. Por otra parte, existen ciertos modos de conducta o estados fisiológicos que pueden favorecer la aparición de infecciones en el tracto urinario: - Relaciones sexuales - Cambios morfológicos durante el embarazo - Hipertrofia de la próstata - Reflujo vesicouretral - Introducción de sondas permanentes Las infecciones extrahospitalarias suelen ser monomicrobianas, mientras que las infecciones intrahospitalarias suelen ser polimicrobianas. RECOGIDA DE LA MUESTRA DE ORINA SEGÚN TÉCNICA DEL CHORRO MEDIO La técnica más utilizada para la recogida de muestras de orina es la llamada TÉCNICA DEL CHORRO MEDIO. Esta técnica, que vamos a describir seguidamente, es la correcta para establecer conclusiones válidas acerca del diagnóstico de un paciente. Sin embargo, y por conveniencia de la práctica de laboratorio que vamos a realizar, la toma de la muestra de orina la haremos, intencionadamente, de forma incorrecta (frasco nº 1) para aumentar la probabilidad de encontrar microorganismos con los cuales poder seguir trabajando el resto de los días de la semana, y de forma correcta (frasco nº 2) para realizar un análisis cuantitativo de la muestra de orina que se está procesando. 9

11 TÉCNICA DEL CHORRO MEDIO (METODOLOGÍA CORRECTA) Se procede primero al lavado de las manos. Seguidamente, se lava con agua y jabón la zona genital, se enjuaga con abundante agua y se seca bien. Recogida del chorro medio: Se empieza a orinar y se recoge en el bote solo la muestra del chorro medio, es decir, NO SE DEBE RECOGER NI LA PRIMERA NI LA ÚLTIMA PARTE DEL CHORRO DE ORINA. Se tapa bien el bote, se rotula y se lleva al laboratorio lo más pronto posible. Si van a transcurrir más de dos horas hasta su llegada al laboratorio el transporte debe realizarse manteniendo la muestra en frío (la refrigeración no es necesaria en el caso de la muestra recogida para las prácticas). RECOGIDA DE LA MUESTRA DE ORINA PARA LA REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA Para la realización de la práctica realizaremos dos tomas de muestra en dos botes. Ambas tomas se recogerán por la mañana temprano y habiendo tenido como mínimo una retención de 6-8 horas sin orinar. Se procederá en la forma siguiente: 1. En el bote que llamaremos nº 1 se recogerá la primera porción de orina. En este bote, la orina recogida habrá arrastrado la microbiota existente en la mucosa uretral. Aunque esta no es la forma correcta para hacer una evaluación del número de bacterias existentes en la orina, nos permitirá realizar un ANÁLISIS CUALITATIVO de la muestra estudiada. 2. En el bote que llamaremos nº 2 se recogerá la muestra del chorro medio. Esta muestra la vamos a considerar válida para realizar el ANÁLISIS CUANTITATIVO de la muestra en estudio aunque no se haya realizado el lavado de los genitales. 3. El resto de la orina no se recoge. 10

12 L-1 ANÁLISIS CUANTITATIVO DE ORINA Siembra de la muestra de orina (Bote nº 2) en Agar CLED Se trata de sembrar una cierta cantidad de la muestra de orina para hacer un recuento total del número de microorganismos presentes. El número obtenido se referirá al índice de Kass y se establecerán conclusiones acerca de posibles infecciones del tracto urinario (ITU). Medio de cultivo utilizado. Utilizaremos como medio de cultivo una placa de Agar CLED (Cistina-Lactosa-Deficiente en Electrolitos) que es un medio no selectivo y diferencial que permite realizar la identificación presuntiva de los principales patógenos que causan infecciones del tracto urinario. En este medio, la deficiencia en electrolitos dificulta el movimiento de bacterias muy móviles, como Proteus, que acabarían invadiendo toda la placa, enmascarando e impidiendo el recuento de otras colonias. METODOLOGÍA: 1. Introducir verticalmente en el bote de orina nº 2 un asa de plástico estéril y calibrada de 1 μl. El bote nº 2 se corresponde con la orina tomada del chorro medio. 2. Sembrar una placa de Agar CLED en la forma indicada: - Repartir la gota en la placa en forma diametral - Con la misma asa hacer estrías para aislar colonias - Incubar la placa inoculada a 37º C durante 24 horas. 11

13 L-2 ANÁLISIS CUALITATIVO DE ORINA Siembra de la muestra de orina (Bote nº 1) en Agar Cromogénico y Agar MacConkey Se trata de sembrar una muestra de orina en medios de cultivo para aislamiento de colonias y posterior identificación de una enterobacteria que pudiera estar presente en la muestra de orina. Medios de cultivo utilizados. Utilizaremos una placa de Agar Cromogénico (medio no selectivo y diferencial) y otra de Agar MacConkey (medio moderadamente selectivo y diferencial). El carácter diferencial se traduce en que las colonias crecidas presentan diferentes pigmentaciones en función de su capacidad para utilizar ciertos sustratos (presentes en el Agar Cromogénico) y la lactosa (presente en el Agar MacConkey). MEDIO CULTIVO AGENTES INHIBIDORES CRECIMIENTO GRAM + CRECIMIENTO GRAM - CARÁCTER DIFERENCIAL AGAR MACCONKEY AGAR CROMOGÉNICO Sales biliares Cristal violeta - + SÍ NO + + SI METODOLOGÍA Sembrar la placa de Agar MacConkey de la siguiente manera: 1. Con un asa (de plástico) calibrada de 10 μl agitar el bote nº 1 desde el fondo. 2. Tomar 10 μl de la muestra con el asa y descargarlos en un sector de la placa (sector 1) realizando estrías. Repetir la descarga dos veces más. En total se habrán descargado 30 μl. 3. Después de la tercera descarga, sembrar otros sectores de la placa (del sector 2 hasta el sector 7) arrastrando inóculo en cada ocasión del sector anterior, en la forma que se indica en el esquema, pero sin tomar más inóculo. 12

14 1 2 3 Descargar 30 μl de la muestra en el sector Inoculación para aislamiento de colonias en Agar MacConkey Sembrar la placa de Agar Cromogénico de la siguiente manera: 1. Dividir la placa de Agar Cromogénico en dos, dibujando un diámetro en la base de la placa con el rotulador negro. Por parejas, cada alumno sembrará la mitad de la placa. 2. Tomar 10 μl de la muestra con el asa y realizar estrías continuas desde un extremo a otro de su mitad de la placa. Se puede sembrar horizontal o verticalmente. 3. Después de la tercera descarga, sembrar otros sectores de la placa (del sector 2 hasta el sector 7) arrastrando inóculo en cada ocasión del sector anterior, en la forma que se indica en el esquema, pero sin tomar más inóculo. Tras la incubación en Agar MacConkey, las bacterias que fermentan la lactosa producen ácidos que cambian el ph del medio, por lo que se produce el viraje del indicador. En función de la mayor o menor cantidad de ácidos liberados, el ph baja más o menos y las colonias 13

15 aparecen finalmente con diferentes colores. Esta diferencia en la coloración nos permite establecer una identificación presuntiva del microorganismo que ha dado lugar a la formación de la colonia. De igual manera, la utilización de los sustratos en el Agar cromogénico produce la diferente coloración de las colonias crecidas. En días sucesivos realizaremos observaciones microscópicas y pruebas bioquímicas tratando de identificar alguna de las enterobacterias que pudieran estar presentes originariamente en la muestra de trabajo. L-3 ANÁLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARÍNGEA Toma de muestra de microbiota presente en la mucosa faríngea Realizaremos una toma de muestra de la mucosa faríngea donde existe una población microbiana muy abundante. El objetivo de la práctica es sembrar esta muestra en medio de cultivo para el aislamiento de colonias y posteriormente realizar observaciones microscópicas y pruebas bioquímicas tratando de identificar cocos Gram positivos pertenecientes a los géneros Staphylococcus y/o Streptococcus. METODOLOGÍA 1. Con ayuda de un depresor estéril presionar la lengua hacia abajo. 2. Utilizando un hisopo de algodón estéril tocar la mucosa faríngea realizando una ligera presión al tiempo que se gira la punta del hisopo. 3. La toma de muestra descrita se realiza entre dos compañeros de forma recíproca. 4. Inmediatamente después se siembra la muestra en dos placas de agar sangre en la forma que se describe en el siguiente apartado. 14

16 L-4 ANÁLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARÍNGEA Siembra de las placas nº 1 y nº 2 de Agar Sangre Medio de cultivo utilizado: AGAR SANGRE Medio No selectivo Componentes específicos Sangre desfibrinada de oveja al 5% Eritrocitos intactos Utilización preferente Utilización general Observación de hemólisis METODOLOGÍA 1. Siembra de la placa de Agar Sangre nº 1. Descargar el hisopo en un sector próximo al borde de la placa y después continuar sembrando el resto de la placa haciendo estrías muy próximas de forma que no quede agar sin inocular entre ellas. El sector donde hemos descargado inicialmente el hisopo lo llamaremos zona densa. 15

17 Zona densa donde se ha descargado el hisopo 2. Siembra de la placa de Agar Sangre nº 2. Tomar con el asa de metal inóculo de la zona densa de la placa nº 1 y sembrar la placa nº 2 haciendo estrías continuas y próximas entre si comenzando en un borde de la placa. Dirección antero-posterior de la siembra en estrías L-5 ANÁLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARÍNGEA Siembra de una placa de Agar Salino Manitol Medio de cultivo utilizado Utilizaremos una placa de agar salino manitol. Este medio es altamente selectivo debido a la elevada concentración de cloruro sódico que contiene (7,5%). Este medio resulta muy recomendable para el aislamiento de Staphylococcus aureus a partir de muestras clínicas que lleven poblaciones bacterianas mixtas. Numerosas especies bacterianas son inhibidas en su crecimiento en este medio. Los estafilococos coagulasa positivos (S. aureus) resisten la elevada concentración salina del medio y, además, al fermentar el azúcar manitol, acidifican el medio formando colonias de color amarillo que aparecen también rodeadas de una zona de color amarillo. Los estafilococos coagulasa negativos (S. epidermidis, S. saprophyticus) son capaces de soportar la alta concentración salina pero no son capaces de fermentar el manitol. Las colonias son transparentes presentando la tonalidad rojiza propia del medio de cultivo. 16

18 Los enterococos (Enterococcus) también pueden soportar la alta concentración salina y algunas especies de este género pueden fermentar el manitol y dar lugar a la aparición de colonias amarillas. METODOLOGÍA 1. Realizaremos una nueva toma de muestra de mucosa faríngea en la misma forma que ya se ha descrito para realizar la siembra de la placa de agar sangre nº Sembraremos la placa de agar salino manitol deslizando uniformemente el hisopo por toda la superficie de la placa en una dirección antero-posterior. LUNES APUNTES PERSONALES 17

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20 MARTES REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA ANÁLISIS CUANTITATIVO ORINA M-1 M-2 Lectura de la placa de Agar CLED Identificación presuntiva de las colonias crecidas en las placas de Agar Cromogénico y Agar MacConkey ANÁLISIS CUALITATIVO ORINA M-3 M-4 Tinción de Gram de colonias aisladas en las placas de Agar Cromogénico y Agar MacConkey Prueba de la citocromo-oxidasa a la presunta enterobacteria M-5 Siembra de la colonia seleccionada en Agar MacConkey M-1 ANÁLISIS CUANTITATIVO DE ORINA Lectura de la placa de Agar CLED Se trata de conocer el número de microorganismos que están presentes en cada ml de orina y, en función del resultado, establecer conclusiones teóricas acerca de si existe o no infección en el tracto urinario. Desde 1956 se vienen siguiendo los parámetros establecidos por KASS: 19

21 Nº DE BACTERIAS EN ORINA Nº> 10 5 /ml Bacteriuria significativa Probable infección 10 5 /ml > Nº > 10 4 /ml Diagnóstico dudoso Debe repetirse el análisis con otra toma Nº< 10 4 / ml Bacteriuria no significativa Probable contaminación AGENTES MICROBIANOS AISLADOS FRECUENTEMENTE EN CASOS DE INFECCIONES URINARIAS INDIVIDUO SIN FACTORES PREDISPONENTES INDIVIDUO CON FACTORES PREDISPONENTES FRECUENTES Escherichia coli Proteus mirabilis Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Otras enterobacterias Enterococos Candida albicans Staphylococcus epidermidis POCO FRECUENTES Enterococos Staphylococcus saprophyticus Corynebacterium urealyticum METODOLOGÍA: 1. Cada alumno contará el número de unidades formadoras de colonias crecidas en la placa de Agar CLED que sembró ayer lunes con el asa calibrada de 1 μl. Se contarán todas las colonias. Para realizar el recuento podemos ayudarnos de un transiluminador existente en el laboratorio. Puede darse la circunstancia de que no aparezcan colonias crecidas, o por el contrario que el número sea tal alto 20

22 que no puedan ser contadas con exactitud. En tales circunstancias el profesor indicará la conclusión que debe establecerse. 2. Conocido el número de colonias que han crecido en la placa debemos considerar que tales colonias han crecido a partir de la muestra de orina tomando la cantidad de 1 μl. Para establecer las conclusiones teóricas siguiendo los parámetros de KASS debemos referir el número de colonias encontrado a la cantidad de 1 ml. Ejemplo práctico Cantidad de orina tomada con el asa 1 μl 0,001 ml Número de colonias crecidas en la placa x 10 3 Número de bacterias / ml orina (= Nº) 0,56 x 10 5 (= Nº) Nº > 10 5 ( ) Bacteriuria significativa Parámetros de KASS Nº < 10 4 (10.000) Bacteriuria no significativa 10 5 > Nº > 10 4 Bacteriuria dudosa Conclusión del ejemplo Bacteriuria dudosa 21

23 M-2 ANÁLISIS CUALITATIVO DE ORINA Identificación presuntiva de las colonias crecidas sobre las placas de Agar Cromogénico y Agar MacConkey Esta práctica la iniciamos ayer lunes sembrando muestras de orina en dos placas con diferentes medios de cultivo. Recordemos que las dos placas que habíamos sembrado eran: Agar MacConkey y Agar Cromogénico. La identificación presuntiva que vamos a realizar estará basada en los diferentes colores que presenten las colonias, lo cual es el resultado de las diferencias existentes en la capacidad de las bacterias para utilizar la lactosa presente en el Agar de MacConkey y descomponer los sustratos presentes en el Agar Cromogénico. Utilización de la lactosa 1. La lactosa, que es un nutriente externo, debe penetrar dentro de la célula bacteriana para ser metabolizada. Para ello es necesario una enzima (beta-galactósido-permeasa) que transporta la lactosa desde el exterior hasta el citoplasma bacteriano. 2. Una vez en el citoplasma bacteriano la lactosa debe ser desdoblada en sus dos componentes (glucosa y galactosa), para lo cual es necesaria la existencia de otra enzima (betagalactosidasa). Los dos monosacáridos resultantes pueden ser metabolizados por diferentes rutas catabólicas, produciéndose una mayor o menor cantidad de liberación de ácidos. 3. Por todo lo anterior, resulta evidente que para que un microorganismo pueda utilizar la lactosa debe poseer las dos enzimas. Si carece de alguna de ellas el microorganismo no puede utilizar la lactosa. 4. Con respecto al enzima beta-galactósido-permeasa, existen ciertos microorganismos con una actividad permeasa intensa (fermentadores fuertes o rápidos) y otros con una actividad débil (fermentadores débiles o tardíos). Ello se traduce, en una rápida y abundante liberación de ácidos o en una liberación lenta y escasa, respectivamente. 22

24 FERMENTACIÓN DE LA LACTOSA POR ENTEROBACTERIAS Microorganismo Fermentador de lactosa Tipo fermentación de la glucosa Liberación ácidos Liberación CO 2 Escherichia coli Fuerte Acido mixta Muchos Poco Enterobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae Fuerte Butilén-glicólica Pocos Mucho Fuerte Butilén-glicólica Pocos Mucho Citrobacter Lento Ácido mixta Muchos Poco Serratia Lento Ácido mixta Butilén-glicólica Muchos Pocos Poco Mucho Salmonella Shigella Proteus Edwarsiella Providencia NO FERMENTAN LA LACTOSA MICROORGANISMO MACCONKEY CLED Escherichia coli Enterobacter Klebsiella Roja-Rosada Precipitado Rosadas No mucosa Rosada Mucosa Amarillas Grandes Amarillas Grandes Amarillentas Azuladas Grandes Citrobacter Incolora-Roja Amarillas Serratia Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Roja-Rosada No mucosa Rosada Puntiforme Rosada Puntiforme Azul intenso Amarillas Pequeñas Amarillas Pequeñas Proteus Incolora Azules 23

25 CRECIMIENTO EN AGAR CROMOGÉNICO β-galactosidasa Hidrólisis lactosa β- Glucosidasa Hidrólisis celobiosa Triptofano Desaminasa Trp Pigmentación colonia E. coli + Rosa Enterococos + Coliformes + + Proteus Morganella Providencia Pseudomonas Estafilococos S. saprophyticus Estreptococos Azul Turquesa Azul oscuro Púrpura + Halo marrón Verde Marrón Blanco Crema Rosa Blanco pálido Blanco METODOLOGÍA: Se observarán las colonias crecidas en Agar MacConkey y Agar Cromogénico y en base al color se establecerán identificaciones presuntivas. M-3 ANÁLISIS CUALITATIVO DE ORINA Tinción de Gram de colonias aisladas y crecidas en las placas de Agar Cromogénico y Agar MacConkey METODOLOGÍA: 1. Se harán tinciones de Gram de colonias individuales que hayan crecido en estas dos placas. Deben observarse bacilos cortos Gram negativos (color rojo) para su posible correspondencia con enterobacterias. 24

26 2. Muy importante. Cada alumno deberá controlar con exactitud la relación existente entre lo que se está observando al microscopio y la colonia de la cual fue realizada la tinción (de qué placa procede y qué color tenía la colonia). TINCIÓN DE GRAM Tomar con el asa una pequeña cantidad de la colonia a estudiar Realizar una extensión sobre una gota de agua en el portaobjetos Secar en la parte alta del mechero o en una plancha con control de temperatura Fijar la extensión pasando el portaobjetos por la llama del mechero Cristal violeta 2 minutos Lavar abundantemente con agua Lugol (mordiente) 2 minutos Lavar abundantemente con agua Alcohol 96º (decoloración) segundos Lavar abundantemente con agua Safranina 2 minutos Lavar abundantemente con agua Secar en la parte alta del mechero Añadir aceite de inmersión y observar con el objetivo 100X 25

27 M-4 ANÁLISIS CUALITATIVO DE ORINA Prueba de la citocromo-oxidasa de presunta enterobacteria aislada en Agar Cromogénico o Agar MacConkey Se realizará la prueba de la oxidasa a aquella colonia: a) Aislada sobre Agar Cromogénico o Agar MacConkey. b) Identificada presuntamente como una enterobacteria (en función del color de la colonia en el medio correspondiente y de su comportamiento en la tinción de Gram). METODOLOGÍA: Prueba de la citocromo-oxidasa La citocromo oxidasa es un complejo formado por los citocromos a y a 3 (citocromo-oxidasa = complejo a+a 3 ). Este complejo es el último de la cadena respiratoria y transfiere directamente los electrones al oxígeno molecular. A B C D E Depositar unas gotas del reactivo tetrametil-parafenilén diamina (existente en unas ampollas de plástico) sobre un trozo de papel de filtro. Este reactivo es incoloro en estado reducido. Tomar con un palillo de madera (las asas de hierro dan falsos positivos) una muestra de la colonia a investigar y extenderla encima de las gotas del reactivo. Si el microorganismo posee el enzima citocromooxidasa, el enzima capta los electrones del reactivo y los transfiere directamente al oxígeno molecular. Como resultado el reactivo se oxida. El reactivo es azul intenso en estado oxidado. El resultado debe observarse en un tiempo inferior a 30 segundos. Un tiempo más prolongado conduce a una oxidación espontánea del reactivo y a un falso positivo. Interpretación: No hay cambio de color Oxidasa Azul intenso Oxidasa + 26

28 M-5 ANÁLISIS CUALITATIVO DE ORINA Siembra de 1 colonia (presunta enterobacteria procedente de Agar Cromogénico o Agar MacConkey) en Agar MacConkey El objetivo de esta siembra es tener masa suficiente de la presunta enterobacteria para realizar otras pruebas. METODOLOGÍA: Tocar con un asa estéril una porción de la colonia a la que se haya realizado tinción de Gram, con el resultado de la aparición de bacilos Gram negativos, y que haya dado la prueba de la oxidasa negativa, y hacer estrías en dirección antero-posterior sobre una placa de Agar MacConkey. MARTES APUNTES PERSONALES 27

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30 MIÉRCOLES REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA X-1 Observación de halos de hemólisis en las placas de Agar Sangre nº 1 y nº 2 ANÁLISIS CUALITATIVO MUCOSA FARÍNGEA X-2 X-3 Tinción de Gram de presuntos cocos Gram + crecidos en: placa de Agar Sangre nº 2 Observación de la placa de Agar Salino Manitol y tinción de Gram de colonias aisladas X-4 Siembra de cocos Gram + en sectores sobre la placa de agar sangre nº 3 X-1 ANÁLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARÍNGEA Observación de halos de hemólisis en las placas de Agar Sangre nº 1 y nº 2 En el agar sangre se puede conocer la capacidad de ciertas bacterias para producir enzimas extracelulares (hemolisinas) que actúan sobre los glóbulos rojos provocando distintos tipos de hemólisis: Beta hemólisis Lisis completa de los glóbulos rojos Halo transparente alrededor de la colonia 29

31 Lisis parcial de los glóbulos rojos Se abren poros en la membrana Alfa hemólisis Salida de hemoglobina al medio Oxidación del grupo hemo Formación de biliverdina (color verdoso) Halo verdoso alrededor de la colonia Aproximación interpretativa según relación tamaño colonia / tamaño halo de hemólisis: Relación Podría tratarse de Colonia grande / Halo hemólisis pequeño Staphylococcus Colonia pequeña / Halo hemólisis grande Streptococcus Aproximación interpretativa según observaciones Colonia Grande Amarillenta-Incolora Beta-hemolítica Pequeña Blancas-Grisácea No hemolítica Grande Blancas-Amarillenta Anaranjada No hemolítica Morfología celular Células esféricas Racimos irregulares Células esféricas Racimos irregulares Células esféricas Racimos irregulares Podría ser Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus 30

32 Pequeña Grisáceas-Translúcida Beta-hemolítica Pequeña Grisáceas-Translúcida Alfa-hemolítica Pequeña Gris Alfa-hemolítica No hemolítica Células esféricas Células ovoides Aisladas-Parejas Cadenas Células esféricas Células ovoides Aisladas-Parejas Cadenas Células esféricas Células ovoides Aisladas-Parejas Cadenas Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Grupo Viridans: S. mutans S. salivarius S. bovis S. mitis METODOLOGÍA: 1. Se observarán las placas de agar sangre denominadas nº 1 y nº 2. Dada la técnica utilizada para la siembra la placa nº 1 deberá tener crecimiento en masa, mientras que sobre la placa nº 2 deberían observarse colonias aisladas. X-2 ANÁLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARÍNGEA Tinción de Gram de presuntos cocos Gram + crecidos en: la placa de Agar Sangre nº 2 METODOLOGÍA: 1. Tinción de Gram de colonias bien aisladas sobre la placa de agar sangre nº 2. Igual que con las demás tinciones, es muy importante controlar la correspondencia entre la colonia y la observación que se está haciendo al microscopio. 2. Interpretación: Agrupación Morfología celular Posible Racimos Esféricas Staphylococcus 31

33 Aislados Parejas Cadenas cortas Cadenas largas Esféricas/ Ovaladas Streptococcus X-3 ANÁLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARÍNGEA Observación de la placa de Agar Salino Manitol y tinción de Gram de colonias aisladas Este medio resulta muy adecuado para el aislamiento de S. aureus a partir de muestras nasales, faríngeas y fecales. Este microorganismo es capaz de soportar la alta concentración salina del medio (7,5 % NaCl) y de fermentar el manitol (formación de ácidos y viraje del indicador con formación de halos amarillos alrededor de la colonia que también adquiere color amarillo). Otras especies también pueden crecer en este medio con producción de ácidos, por lo que la identificación definitiva deberá ser confirmada por pruebas bioquímicas. Microorganismo Fermentación Manitol Colonia S. aureus SI Halo amarillo S. epidermidis No Incoloras S. urealyticus Si Halo amarillo S. xylosus Si Halo amarillo S. lentus Si Halo amarillo S. simulans Si Halo amarillo S. saprophyticus Variable Halo amarillo o incoloro S. haemolyticus Variable Halo amarillo o incoloro Enterococcus faecalis Si Halo amarillo Enterococcus faecium Variable Halo amarillo o incoloro Enterococcus avium Si Halo amarillo Enterococcus durans Variable Halo amarillo o incoloro 32

34 METODOLOGÍA: 1 Observación de las colonias crecidas en el medio atendiendo al color que presentan. 2. Realizar tinción de Gram de colonias aisladas y observar al microscopio para determinar la morfología y la agrupación celular, si existe. X-4 ANÁLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARÍNGEA Siembra de cocos Gram positivos en sectores sobre la placa de Agar Sangre nº 3 Los cultivo identificados como cocos Gram + serán seleccionados para sembrar una nueva placa de agar sangre que llamaremos nº 3. Pretendemos con ello, pasadas 24 horas de incubación, obtener cultivos puros y abundantes de cocos Gram + que serán sometidos a pruebas de caracterización enzimática para poder identificarlos. METODOLOGÍA: 1. Rotulación de la placa: Tomaremos la placa de agar sangre nº 3 y la dividiremos en sectores, tantos como colonias diferentes hayamos identificado pertenecientes a cocos Gram positivos, sea cual sea su morfología celular (esférica u ovalada), sea cual sea su agrupación (racimos, células aisladas, parejas, etc.) y sea cual sea su procedencia (Agar Sangre o Agar Salino Manitol). Para dividir la placa en sectores se rotulará la base en forma radial. 33

35 PLACA ROTULADA EN TRES SECTORES SECTOR 1 SECTOR 2 SECTOR 3 2. Siembra de los sectores: Cada sector será inoculado con un cultivo diferente de cocos Gram positivos. MIÉRCOLES APUNTES PERSONALES 34

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38 JUEVES REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA ANÁLISIS CUALITATIVO ORINA J-1 J-2 Siembra de Agar KLIGLER a partir de colonias crecidas en Agar MacConkey Siembra de la galería API 20 E a partir de colonias crecidas en Agar MacConkey PRUEBA DE BAUER-KIRBY (ANTIBIOGRAMA) J-3 Siembra de una placa de Agar M.H. a partir de colonias crecidas en Agar MacConkey PRUEBA DE ÉPSILON (DETERMINACIÓN DE LA CMI) J-4 Siembra de una placa de Agar M.H. a partir de colonias crecidas en Agar MacConkey ANÁLISIS CUALITATIVO MUCOSA FARÍNGEA J-5 J-6 Siembra de la galería API STAPH a partir de placa de Agar Sangre nº 3 Siembra de la galería API STREP a partir de placa de Agar Sangre nº 3 J-1 ANÁLISIS CUALITATIVO DE ORINA Siembra de un tubo de Agar Kligler a partir de colonias crecidas en Agar MacConkey El medio Kligler se utiliza preferentemente para la identificación de enterobacterias. La lectura del medio no es suficiente para la identificación de especies ni siquiera para la identificación de géneros. No obstante, después de ser inoculado con una enterobacteria su 37

39 lectura establece un abanico de varios géneros de enterobacterias capaces de dar los resultados observados. La lectura del medio Kligler nos proporciona datos interesantes del microorganismo inoculado Capacidad de utilizar fermentativamente la glucosa Capacidad de utilizar fermentativamente la lactosa Capacidad de producir SH 2 durante el metabolismo Capacidad de producir un abundante desprendimiento de gases Composición fundamental del medio Kligler Peptona Lactosa/Glucosa (10/1 g/l) Sulfato ferroso Tiosulfato sódico Fuente de C y energía Fuente de C y energía Fuente de Fe Fuente de S METODOLOGÍA: 1. Inóculo a utilizar El medio será inoculado individualmente por cada alumno con la presunta enterobacteria que tiene aislada y crecida abundantemente en su placa de Agar MacConkey. 2. Fondo y superficie del tubo de agar inclinado Al tratarse de un medio sólido con la superficie inclinada podemos distinguir en el tubo dos partes diferenciadas: Fondo Pico de flauta En condiciones de anaerobiosis En contacto con el oxígeno 3. Inoculación del tubo de Agar Kligler Utilizando un hilo de siembra, tomar inóculo de la placa de Agar MacConkey donde se ha aislado en cultivo puro una 38

40 enterobacteria procedente de la muestra de orina. Posteriormente: a b c Inocular el tubo en picadura sin llegar a tocar el fondo Retirar el hilo de siembra en línea recta Inocular la superficie en estrías a b c Las estrías aparecen continuas Pero se hacen en zig-zag sin interrupción J-2 SIEMBRA DE LA GALERÍA API 20 E A partir de colonias crecidas en Agar MacConkey El API 20 E es un conjunto de pruebas de caracterización enzimática que se utiliza para la identificación de enterobacterias y de otros bacilos Gram negativos. El sistema API 20 E está constituido por una galería que contiene 20 micropocillos, cada uno con diferentes metabolitos estériles y deshidratados que serán ensayados para determinar si existe (o no) la actividad enzimática específica en la bacteria que estamos tratando de identificar. 39

41 5- Identification de la souche Résultats de la galerie: Cúpula Tubo METODOLOGÍA: 1. Elección del inóculo Para la inoculación de la galería API 20 E cada alumno dispone de una placa de Agar MacConkey que sembró con una presunta enterobacteria. Sin embargo, la inoculación de la galería será realizada conjuntamente por cada lateral de mesa - constituido por seis alumnos Esto nos lleva a la necesidad de tener que seleccionar una única placa de MacConkey por cada lateral de mesa. Será seleccionada aquella cuyo conjunto de datos haya sido el más convincente para pensar que se trata de una enterobacteria (color de la colonia en las placas, observación de la morfología celular al microscopio y prueba de la oxidasa). Para ello, los alumnos de Code cada n : lateral consultarán (55) sus datos y decidirán cuál será la placa seleccionada Résultats reportés sur la fiche d identification 2. Preparación de la suspensión Se référer au catalogue pour identifier la souche à l aide du code a) Preparar la placa de Agar MacConkey seleccionada. b) Utilizar una ampolla conteniendo 5 ml de Medio para Suspensión. Introducir la ampolla abierta en Densimat para ir midiendo la Densidad Óptica (D.O.). c) Con un hisopo tocar varias colonias existentes en la placa y suspender la masa microbiana en la ampolla. d) Repetir la operación hasta conseguir una suspensión coincidente con 0,5 de la escala de McFarland. 40

42 3. Preparación del soporte de la galería Es necesario incubar la galería API 20 E en condiciones de humedad dada la pequeña cantidad de suspensión que contendrán los micropocillos. De lo contrario, durante la incubación durante 24 horas a 37º C, se secarían y las pruebas no se podrían leer. Para ello, existen unos soportes con pequeños alvéolos que se llenarán con agua de grifo. El exceso de agua se desecha. 4. Colocación de la galería API 20 E encima del soporte Se depositará la galería encima del soporte que contiene los alvéolos llenos de agua. El soporte, que ya contiene la galería, será colocado en posición ligeramente inclinada. 41

43 5. Llenado de micropocillos con la pipeta de inoculación: 6. Inoculación de los micropocillos a) Llenado del Tubo de los 20 micropocillos Depositar inóculo gota a gota dejándolo deslizar por la pared lateral de cada micropocillo. Llenar toda la parte del micropocillo que hemos denominado Tubo (para ello interrumpir el llenado del micropocillo al llegar al nivel donde comienza la parte denominada Cúpula ). Debe llenarse el micropocillo sin que se formen burbujas, ya que ello propiciaría un ambiente oxigenado en el fondo del micropocillo. b) Adición de inóculo en la cúpula En algunos pocillos se debe añadir más inóculo para llenar también la Cúpula. Estos son los pocillos cuyas iniciales de la actividad enzimática que se investiga aparecen encerradas en una especie de compartimiento. Por ejemplo: 42

44 CIT c) Adición de parafina en la Cúpula En algunos pocillos hay que añadirl parafina en la cúpula para crear durante la incubación un ambiente anaerobio. Son aquellas cuyas iniciales de la actividad enzimática investigada aparecen subrayadas. Por ejemplo: ADH d) Rotular la galería e incubar a 37º C. J-3 PRUEBA DE BAUER-KIRBY (ANTIBIOGRAMA) Siembra de una placa de Agar Müeller-Hinton (M.H.) para determinar el diámetro de los halos de inhibición Con la realización de esta prueba tratamos de determinar cómo afectan diferentes antimicrobianos al crecimiento de un microorganismo. Esta prueba realizada con gran frecuencia en hospitales durante el tratamiento de pacientes con procesos infecciosos utiliza agentes microbianos aislados de estos pacientes. La utilidad radica en referir los resultados que se obtengan en el laboratorio a unas tablas ya confeccionadas y que permiten establecer conclusiones acerca de la efectividad, o no, de tratar a un paciente con un determinado antibiótico. Para realizar esta práctica vamos a seguir la técnica descrita por Bauer y Kirby, utilizando como inóculo bacteriano la presunta enterobacteria aislada de las muestras de orina y crecidas en la placa de Agar MacConkey. Medio de cultivo utilizado. Utilizaremos como medio de cultivo el llamado Agar de Müeller- Hinton. Es el medio recomendado por la OMS para realizar pruebas de susceptibilidad antimicrobiana. Existen varias razones que llevan a la utilización de este medio, pero una de las más importantes es que en este medio no se forma PABA (ácido para-amino-benzoico) el cual inhibe la actividad de algunos antibióticos y sulfamidas. 43

45 METODOLOGÍA: 1. Trazar una circunferencia sobre el papel de filtro existente en el puesto de trabajo utilizando como molde la misma placa de M. H. que va a ser sembrada. 2. Al retirar la placa señalar sobre el papel de filtro tres puntos internos en posición triangular que sean, aproximadamente, equidistantes entre ellos y equidistantes del borde de la circunferencia. 4. Con un hisopo de algodón estéril tomar colonias de la placa de Agar MacConkey e inocular un tubo de caldo hasta alcanzar una turbidez equivalente a 0,5 en la escala de McFarland. Introducir el hisopo en el tubo, empapar bien y descartar el exceso de líquido presionándolo contra el vidrio. Deslizar el hisopo suavemente por toda la superficie de la placa. Repetir la siembra dos veces, girando la placa 120 º cada vez. Se trata de repartir el inóculo por toda la superficie de la placa en forma densa y uniforme, para obtener un crecimiento confluente. 4. Colocación de los discos de antibiótico trabajando en la proximidad del mechero. a) Los discos vienen envasados en unos dispensadores de plástico. Depositar tres discos de antibióticos diferentes en la tapadera de la placa que va a ser utilizada. b) Situar la placa sembrada encima de la circunferencia dibujada en el papel de filtro. c) Con unas pinzas (pasadas previamente por la llama del mechero) coger cada disco de antibiótico y depositarlo en 44

46 la placa sembrada, haciéndolo coincidir con cada uno de los puntos dibujados en posición triangular, los cuales se ven por transparencia. d) Con la punta de la pinza presionar ligeramente cada disco de antibiótico depositado en la placa ya sembrada. e) Si algún disco se coloca mal situado no se puede volver a coger para desplazarlo al sitio correcto. f) Rotular la placa e incubar a 37 ºC. J-4 TIRA ÉPSILON (DETERMINACIÓN DE LA CMI) Siembra de una placa de Agar Müeller-Hinton a partir de colonias crecidas en Agar MacConkey Mediante esta prueba se puede determinar el valor de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) que es la mínima concentración de antibiótico que impide el crecimiento visible de un microorganismo. El valor de la CMI, que es un parámetro obtenido en el laboratorio para cada combinación de especie bacterianaantibiótico, es de gran utilidad. Igual que ocurría con los diámetros de los halos de inhibición, los valores de la CMI también pueden ser utilizados para establecer el tratamiento antibiótico más adecuado de administrar a un paciente que padece un determinado proceso infeccioso. Como inóculo bacteriano se utiliza la misma suspensión que hemos preparado anteriormente para realizar la prueba de Bauer-Kirby. Como antibiótico utilizaremos unas tiras de papel que están impregnadas de un único antibiótico. Lo trascendente de estas tiras rectangulares de papel es que por una de sus caras existen líneas transversales de ese antibiótico en concentraciones decrecientes; mientras que por la otra cara de la tira aparecen unas cifras numéricas que se corresponden exactamente con las concentraciones de antibiótico existentes sobre la otra cara. METODOLOGÍA: 1. La práctica será realizará colectivamente por cada mesa. De esta forma los 12 alumnos llevarán a cabo la determinación de un único valor de la CMI. 45

47 2. Elegiremos como inóculo uno de los tubos de caldo preparados anteriormente para realizar la prueba de Bauer-Kirby. 3. Siembra del inóculo Se realizará la siembra de otra placa de M.H. siguiendo la misma metodología ya descrita anteriormente para la realización de la prueba de Bauer-Kirby. 4. Colocación de la tira Épsilon. Estas tiras vienen en unos envases y de ellos cogeremos una única tira con cuidado de no tocarla por sus caras. Debemos manejarla con pinzas y cogerla por uno de sus extremos. Con posterioridad, colocaremos la tira rectangular con las cifras numéricas hacia arriba sobre el centro de la placa. Halo elíptico de difusión del antibiótico. La parte ensanchada de la elipse se corresponde con la zona donde el antibiótico presenta una mayor concentración Halo elíptico de inhibición del crecimiento Zona de crecimiento microbiano Tira de Épsilon con un gradiente de concentración expresado en μg/ml Valor numérico de la MIC (0,06 μg/ml) 46

48 J-5 ANÁLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARÍNGEA Siembra de la galería API STAPH a partir de la placa de Agar Sangre nº 3 El API STAPH es una galería semejante a la descrita en el API 20 E. La diferencia consiste en las actividades enzimáticas que se detectan en cada micropocillo. Es una prueba que nos permite identificar la especie de Staphylococcus que ha sido inoculada. Recordemos que ayer miércoles cada alumno sembró una placa de agar sangre por sectores, denominada nº 3. Los sectores fueron inoculados con cocos Gram positivos, con independencia de si pertenecían a alguna especie de Staphylococcus o de Streptococcus. Para la elección del inóculo que va a ser utilizado debemos saber qué sectores existentes sobre la placa de agar sangre nº 3 se corresponden con Staphylococcus y qué sectores se corresponden con Streptococcus. Para obtener este dato realizamos la prueba de la catalasa, la cual nos diferencia entre los dos géneros: Prueba de la catalasa Staphylococcus Catalasa + Streptococcus Catalasa La catalasa es un enzima que descompone el peróxido de hidrógeno en H 2 O y O 2 (oxígeno molecular). Ciertos anaerobios facultativos que no poseen actividad catalasa son capaces de descomponer el peróxido de hidrógeno por acción de otras enzimas, llamadas peroxidadas, pero que se muestran menos efectivas y más tardías en su mecanismo de acción que la catalasa. METODOLOGÍA: a) Depositar unas gotas de peróxido de hidrógeno encima de un portaobjetos. b) Con un palillo de madera (no asas de metal que dan falsos positivos) tomar una muestra del inóculo a investigar. c) Depositar el inóculo encima de las gotas de peróxido de hidrógeno. 47

49 Burbujeo intenso en menos de 30 segundos Catalasa + No burbujeo en menos de 30 segundos Catalasa Burbujeo débil pasados 2-3 minutos Catalasa - 1. Investigación de sectores catalasa +/- sobre la placa de agar sangre nº 3. Cada alumno debe investigar sobre los sectores crecidos en su placa de agar sangre nº 3 cuáles de ellos son catalasa + y cuáles son catalasa -. Para ello, deberá seguir la metodología descrita anteriormente y anotar el resultado de cada sector. Placa de Agar Sangre Nº 3 Prueba individual de cada alumno Investigación de cada sector Sectores que han sido inoculados con cocos Gram + PRUEBA DE LA CATALASA + - API STAPH API STREP La siembra del API STAPH será realizada conjuntamente por cada lateral de mesa, utilizando como inóculo aquel sector catalasa + cuyos resultados previos hayan sido los más satisfactorios. 2. Elección del sector catalasa + a utilizar como inóculo. a) Después de realizar la prueba de la catalasa habrán salido varios sectores catalasa + en el conjunto de las seis placas de agar sangre nº 3 investigadas. b) Se elegirá aquel sector que resulte más apropiado: - La prueba catalasa + haya sido muy clara. - Que el sector tenga un crecimiento abundante. 48

50 - Que dicho sector, recordando datos de días pasados, se corresponda al microscopio con cocos Gram + de forma esférica y agrupados en racimos. 3. Preparación de la suspensión. a) Abrir una ampolla API STAPH MEDIUM y colocarla en DENSIMAT para medir D.O. b) Con un hisopo recoger masa microbiana de un sector catalasa + y resuspenderla en el líquido de la ampolla hasta conseguir una densidad óptica coincidente con la escala 0,5 de McFarland. 4. Inoculación de la galería. Seguir exactamente la misma metodología descrita para la inoculación del API 20 E. 5. Rotular e incubar (24 horas a 37º C). 49

51 J-6 ANÁLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARÍNGEA Siembra de la galería API STREP a partir de la placa de Agar Sangre nº 3 El API STREP es una galería semejante a las ya descritas como API 20 E y API STAPH. Las diferencias radican en las actividades enzimáticas que se detectan en cada micropocillo. Es un sistema que nos permite identificar la especie de Sreptococcus que ha sido inoculada. Asimismo, esta galería también nos permite identificar otros géneros de cocos Gram +, tales como Enterococcus, Aerococcus, Gemella, etc. Para elegir el inóculo que va a ser utilizado debemos saber qué sectores existentes sobre la placa de agar sangre nº 3 se corresponden con cocos Gram + y catalasa -, datos que ya hemos obtenido anteriormente. También en este caso la inoculación de la galería será realizada conjuntamente por los alumnos de un lateral de mesa. METODOLOGÍA: 1. Elección del sector catalasa - a utilizar como inóculo. a) Después de realizar la prueba de la catalasa habrán salido varios sectores catalasa - en el conjunto de las seis placas de agar sangre nº 3 investigadas. b) Se elegirá aquel sector que resulte más apropiado: - La prueba catalasa - haya sido muy clara. - El sector tenga un crecimiento muy abundante. - Que dicho sector, recordando datos de días pasados, se corresponda al microscopio con cocos Gram + de forma ovalada. 2. Preparación de la suspensión. a) Abrir una ampolla CONTENIENDO 2mL de MEDIO SUSPENSIÓN y colocarla en DENSIMAT para medir D.O. 50

52 b) Con un hisopo recoger masa microbiana de un sector catalasa - y resuspenderla en el líquido de la ampolla hasta conseguir una densidad microbiana coincidente con la escala 4 de McFarland. 3. Inoculación de la galería. a) Siguiendo la metodología descrita a propósito del API 20 E inocular los 10 primeros micropocillos (son más pequeños que los restantes). b) Abrir una ampolla de vidrio conteniendo GP Medium y verter el contenido sobre el resto de suspensión que ha sobrado después de la inoculación de los primeros 10 micropocillos. c) Inocular con esta nueva suspensión el resto de los micropocillos. e) Los micropocillos que han de inocularse completamente y a los que hay que añadir parafina siguen la misma metodología descrita a propósito del API 20 E. 4. Rotular e incubar (24 horas a 37º C). JUEVES APUNTES PERSONALES 51

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54 VIERNES REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA PRUEBA DE BAUER-KIRBY V-1 PRUEBA DE ÉPSILON V-2 ANÁLISIS CUALITATIVO ORINA ANÁLISIS CUALITATIVO MUCOSA FARÍNGEA V-3 V-4 V-5 V-6 Lectura del Ø de la placa de M.H. Lectura de la CMI Lectura del Agar KLIGLER Lectura del API 20 E Lectura del API STAPH Lectura del API STREP METODOLOGÍA: V-1 LECTURA DEL Ø DE LA PLACA DE M.H. Utilizando una regla milimetrada se mide el diámetro del halo de inhibición incluyendo el diámetro del disco: - Un halo de diámetro pequeño no significa que la bacteria sea resistente a ese antimicrobiano. - Un halo de diámetro grande no significa que la bacteria sea sensible a ese antimicrobiano. Para concluir si la bacteria es resistente o sensible a un determinado antimicrobiano se realiza la medida del diámetro del halo de inhibición y se acude a unas tablas ya previamente confeccionadas. 53

55 TABLA DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA PARA ENTEROBACTERIAS ANTIMICROBIANO CONTENIDO DEL DISCO Ø HALO INHIBICIÓN (mm) VALOR DE CMI (µg/ml) R I S R S Ampicilina (AM) 10 µg Amoxicilina-Ácido clavulánico (AMC) 20/10 µg /16 8/4 Gentamicina (GM) 10 µg Neomicina (N) 30 µg Kanamicina (K) 30 µg Estreptomicina (STR) 10 µg Tetraciclina (TE) 30 µg Ácido nalidíxico (NA) 30 µg Cloranfenicol (C) 30 µg Penicilina (P) 30 µg Vancomicina (V) 30 µg

56 V-2 LECTURA DE LA CMI METODOLOGÍA Observar la zona de inhibición del crecimiento en forma de elipse. La parte más ancha de la elipse se encuentra en la zona de concentración más elevada del antibiótico en la tira, y la parte más estrecha de la elipse intercepta un punto de la tira con el cultivo que corresponde al valor de la CMI en la escala de números. Leer la CMI obtenida para la combinación establecida entre el antibiótico existente en la tira y el inóculo bacteriano investigado. 55

57 FUNDAMENTOS BIOQUÍMICOS V-3 LECTURA DEL AGAR KLIGLER Para llegar a la comprensión de las reacciones bioquímicas debemos considerar: 1) La concentración de Lactosa es muy superior a la de Glucosa (10/1). 2) La superficie, en contacto con el oxígeno, sufre una alcalinización de forma biológica, de tal manera que las bacterias que están en superficie realizan el metabolismo oxidativo de las proteínas con liberación de aminas que alcalinizan el medio y neutralizan la débil acidificación que existía. Debido a la alcalinización, la zona superficial tiende a mantenerse de color rojo. 3) El medio vira a color amarillo cuando se produce una acidificación (ph < 6,8). 4) El medio lleva tiosulfato de sodio. Algunas enterobacterias (con independencia de su metabolismo normal) son capaces de utilizar el tiosulfato como aceptor de electrones. Como consecuencia se forma SH 2, el cual reacciona con los compuestos de hierro que estén presentes y forman un precipitado negro compuesto de sulfuro ferroso. UTILIZACIÓN DE NUTRIENTES 1. La glucosa empieza a utilizarse como fuente de carbono hasta su agotamiento. Como consecuencia de la fermentación, se liberan ácidos que hacen bajar el ph y todo el tubo aparece de color amarillo. 2. Al mismo tiempo, como fuente de nitrógeno, se empiezan a utilizar las peptonas (péptidos) a través de la descarboxilación oxidativa, aunque solo en la superficie del tubo donde hay oxígeno. Esto produce la alcalinización del medio que hace subir el ph. Esta subida del ph provoca que la superficie vuelva a presentar color rojo. 3. Si el microorganismo es capaz de utilizar la lactosa, se produce una fuerte acidificación y el color rojo de la superficie vuelve a ser amarillo. Si no es capaz de utilizar la lactosa la superficie permanece de color rojo. 56

58 EXISTENCIA DE PRECIPITADO NEGRO EN EL FONDO DEL TUBO En algunos casos el color amarillo del fondo resulta enmascarado por un precipitado de color negro debido al sulfuro ferroso. Para formar este precipitado, es necesario que el ph sea ácido. Por tanto, la existencia de un precipitado negro obliga a pensar que en el fondo se ha fermentado el azúcar y que habría existido un color amarillo originario que después fue enmascarado por el negro del sulfuro ferroso. TABLA DE LECTURA PICO FONDO Rojo Rojo Rojo Amarillo Rojo Negro Amarillo Amarillo Fermentación glucosa (acidificación débil) Fermentación lactosa (acidificación fuerte) Color negro (formación SH 2 ) ESPECIES TÍPICAS Pseudomonas Shigella Providencia Serratia Citrobacter Salmonella Proteus E. coli Enterobacter Klebsiella 57

59 V-4 LECTURA DEL API 20 E MICRO POCILLO ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ADICIÓN DE REACTIVO NEGATIVO POSITIVO 1 ONPG β-galactosidasa NO Incoloro Amarillo 2 ADH Arginina dehidrolasa NO Amarillo Rojo/Naranja 3 LDC Lisina Descarboxilasa NO Amarillo Naranja 4 ODC Ornitina descarboxilasa NO Amarillo Rojo/Naranja 5 CIT Utilización del citrato NO Verde pálido Amarillo Azul verdoso Azul 6 SH2 Producción de SH 2 NO Incoloro Grisáceo 7 URE Ureasa NO Amarillo 8 TDA Triptófano desaminasa Percloruro férrico Amarillo Depósito negro Rojo Naranja Marrón oscuro 9 IND Producción de indol Reactivo Kovacs Amarillo Anillo rojo 10 VP Producción de acetoína VP1 + VP2 Esperar 10 minutos 11 GEL Gelatinasa NO 12 GLU Fermentación Oxidación NO Incoloro No difusión Pigmento negro Azul Azul verdoso Rosado Rojo Difusión Pigmento negro Amarillo 13 MAN Fermentación Oxidación NO Azul Azul verdoso Amarillo 14 INO Fermentación Oxidación NO Azul Azul verdoso Amarillo 15 SOR Fermentación Oxidación NO Azul Azul verdoso Amarillo 16 RHA Fermentación Oxidación NO Azul Azul verdoso Amarillo 17 SAC Fermentación Oxidación NO Azul Azul verdoso Amarillo 18 MEL Fermentación Oxidación NO Azul Azul verdoso Amarillo 19 AMY Fermentación Oxidación NO Azul Azul verdoso Amarillo 20 ARA Fermentación Oxidación NO Azul Azul verdoso Amarillo 21 OX Citocromo oxidasa Prueba ya realizada Considerarla como prueba número 21 58

60 METODOLOGÍA Después de horas de incubación a 37º C se debe realizar la lectura de la galería según la coloración que presenten los micropocillos. Algunos de ellos son de lectura directa sin necesidad de añadir ningún reactivo; en cambio, para la lectura de otros es necesaria la adición de ciertos reactivos. En función de la coloración que adopte se anotarán los resultados +/- de cada micropocillo. Para realizar la lectura se deben seguir las indicaciones establecidas en la tabla donde se especifica cuáles son los micropocillos de lectura directa y a cuáles hay que añadir algún reactivo, incluyendo el tipo de reactivo y las coloraciones que se corresponden con resultados positivos y negativos. Los resultados +/- de cada prueba individual se trasladan a una hojilla donde aparecen las pruebas realizadas. Asimismo, los resultados +/- se transforman en valores numéricos según la siguiente tabla. En total existen 7 grupos de 3 pruebas. VALOR NUMÉRICO DE LAS PRUEBAS POSITIVAS Y NEGATIVAS CONSIDERAR GRUPOS DE 3 PRUEBAS Prueba - 1ª / 2ª / 3ª Posición Valor 0 1ª Posición Valor 1 Prueba + 2ª Posición Valor 2 3ª Posición Valor 4 Después de consignar los resultados numéricos obtendremos un código constituido por siete números. Existen unas tablas donde se busca la correspondencia entre los códigos encontrados y los microorganismos con los cuales se corresponden. También se puede realizar la identificación utilizando un programa informático. 59