DIFERENCIAS DE SUSCEPTIBILIDAD A LA PROTEÓLISIS DE FRACCIONES PROTEÍNICAS DE ARROZ Y FUNCIONALIDAD DE LOS PRODUCTOS DE HIDRÓLISIS

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1 Clave: DIFERENCIAS DE SUSCEPTIBILIDAD A LA PROTEÓLISIS DE FRACCIONES PROTEÍNICAS DE ARROZ Y FUNCIONALIDAD DE LOS PRODUCTOS DE HIDRÓLISIS Oscar J Ramos-Herrera; Ma. Isabel Cortés-Vázquez; Roberto Briones-Martínez. Km 8.5 Yautepec-Jojutla, Yautepec, Morelos. rbriones@ipn.mx INTRODUCCIÓN Las proteínas son el principal componente estructural y funcional de las células, y tienen numerosas e importantes funciones dentro del organismo, que van desde su papel catalítico hasta su función en la motilidad corporal, pasando por su papel mecánico, de transporte y almacén, protección, reguladora, etc. (Martínez y Martínez de Victoria, 2006). El estudio de las proteínas de los alimentos es motivo de una gran atención, no solo desde el punto de vista funcional o nutricional, sino por sus propiedades como bioactivos (Vioque y Millán, 2005). Las proteínas funcionales y los péptidos bioactivos son compuestos que, además de su valor nutricional por ser fuente de aminoácidos, son capaces de ejercer efectos biológicos específicos. Los péptidos generados durante la degradación de una proteína pueden presentar mejoras en dichas propiedades y estas pueden variar dependiendo del grado de la modificación estructural. En la industria de alimentos se utilizan distintas vías para realizar estas modificaciones. Una alternativa muy eficaz es la hidrólisis enzimática, controlando el grado de hidrólisis (GH) y, por lo tanto, la modificación de la estructura (Adler-Nissen, 1986). Los hidrolizados de proteínas tienen un uso muy difundido por sus propiedades nutricionales y funcionales Se ha demostrado que la proteólisis limitada, la cual es controlada por el tiempo de reacción o GH, en combinación con la especificidad enzimática, ofrecen condiciones óptimas para obtener mejoras específicas en propiedades funcionales de las proteínas (Adler-Nissen et al., 1983). Por otra parte, en estudios bioquímicos y estructurales de proteínas son ampliamente utilizados los métodos de susceptibilidad a la proteólisis y el empleo de proteasas altamente específicas como la tripsina. La tripsina es, por varias razones, la enzima más comúnmente utilizada en proteómica basada en espectrofotometría de masas para digerir proteínas en fragmentos peptídicos. Una de las razones del éxito de la tripsina en espectrofotometría de masas es que corta exclusivamente después de arginina y lisina.

2 Las proteínas del arroz son componentes que tienen influencia significativa en las propiedades estructurales, funcionales y nutricionales de este cereal. Son un factor muy importante que se le considera determinante de la textura, la capacidad para formar pastas y de las características sensoriales. En años recientes las proteínas del arroz han sido reconocidas por su poder nutritivo e hipoalergénico, lo que hace que cada vez más interese y aumente su consumo (Champagne, 2006). Como en cualquier otro cereal, la mayor proporción de la proteína se encuentra en el endospermo. Se han desarrollado diferentes métodos para extraer las proteínas del arroz. Generalmente, la harina desengrasada contiene 80% de glutelinas y 12% de globulinas, las dos principales proteínas, en menor proporción las albúminas (5%) y las prolaminas (3%) (Juliano, 1994). Mediante electroforesis se ha determinado que las albúminas tiene un peso molecular entre kda, la α-globulina de 25.5 kda, la β y γ-globulina de 15 kda, mientras que la δ-globulina es >200 kda. Para las prolaminas se han informado valores de 10, 13 y 16 kda. En las glutelinas las subunidades α son de kda y las subunidades β de kda (Shih, 1996). La clasificación Osborne de proteínas basadas en su solubilidad ha sido muy usada en la química de proteínas vegetales (Osborne, 1924). Esencialmente las proteínas son clasificadas en albúminas (solubles en agua), globulinas (solubles en sales), prolaminas (solubles en alcohol) y glutelinas (solubles en álcalis). Algunos estudios han demostrado que la clasificación realizada por Osborne no es muy eficiente y que las fracciones que se obtienen no son muy homogéneas (Juliano, 1985; Wilson, 1987). No obstante, la clasificación de Osborne proporciona información útil sobre la solubilidad y es una base sólida para estudios de proteínas vegetales. El objetivo del presente trabajo fue analizar comparativamente la susceptibilidad a la proteólisis de proteínas de arroz Morelos A98 y de suero lácteo, ensayando dos proteasas de diferente especificidad y origen: tripsina y hemisfericina. El estudio incluyó la separación de las fracciones de arroz, la obtención de hidrolizados ph-stat, la determinación de los perfiles de grado de hidrólisis para cada sistema proteasa-sustrato y, con objeto de conocer las propiedades de los productos de reacción, caracterizar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida los patrones de proteínas y las propiedades emulsionante y antioxidante. MATERIALES Y MÉTODOS Materiales La muestra de arroz Morelos A-98, marca La Perseverancia obtenida en Jojutla, Morelos, fue convertida en harina, la cual se desengrasó por el método de Wang et al (1999) con algunas modificaciones. El suero lácteo fue proporcionado por el Laboratorio de Lácteos del CBTA 8 de Xoxocotla, Morelos, y fue procesado en el Laboratorio de Enzimas Vegetales (LENZIVEG) del CEPROBI-IPN para obtener una preparación proteínica

3 mediante un procedimiento que incluye una operación de termocoagulación a 85ºC (Comunicación personal con Reyes-Nava, Cortés-Vázquez y Briones-Martínez del LENZIVEG). La tripsina utilizada fue de Sigma Chemical Co., EUA) y la hemisfericina una preparación refinada obtenida en el LENZIVEG por el método de Briones-Martínez et al. (1994). Métodos. Extracción de las fracciones de proteínas de arroz. La extracción de las proteínas totales del arroz se realizó de acuerdo al método de Sudarat et al. (2005) y las fracciones albúmina, globulina y glutelina por el método de Ju et al (2001). Hidrolizados. Los hidrolizados se prepararon en un vaso de reacción de 100 ml con doble pared para control de la temperatura, acoplado a un titulador automático ph-stat con registro de consumo de NaOH (0.1N). Las proteínas fueron hidrolizadas a un ph y temperatura constantes de 7.6 y 45ºC en un volumen de reacción de 50 ml. La concentración de enzima fue de 1% (v/v) con respecto al volumen del sustrato. Los tiempos de hidrólisis ensayados fueron de 15, 60, 180 y 360 minutos, para cada sistema enzimasustrato. Los tiempos de reacción ensayados para la hidrólisis de las fracciones fueron 0, 10, 30, 60 y 120 minutos. En cada tiempo se tomó una alícuota de 8 µl para el análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida (Laemmli (1970). Se utilizó una solución de tripsina al 0.4% (p/v) en regulador de fosfatos (0.05M, ph 7.6) para la hidrólisis del concentrado de proteína de arroz y de suero lácteo, y al 0.5% para las fracciones peptídicas. La hemisfericina se ensayó en una dispersión al 5% (p/v) en regulador de fosfatos activada con cisteína 1.6M. Grado de hidrólisis. El GH, el número total de enlaces peptídicos rotos, de las proteínas de arroz se determinó utilizando los miliequivalentes por gramo (meqv/g), es decir el valor htot, el cual se calculó del promedio de la composición de aminoácidos de las proteínas de arroz como la suma de moles de los aminoácidos individuales por gramo de proteína, de acuerdo con el método descrito por Adler-Nissen (1986). Así se determino un valor de htot de 8.1 meqv/g que se utilizó en este estudio para calcular el GH de los tratamientos enzimáticos a que se sometieron las proteínas de arroz. Los valores que se calcularon para albúmina, globulina y glutelina fueron 7.9, 8.0 y 8.2 (meqv/g) respectivamente, mientras que para el suero lácteo se utilizó 8.8 meqv/g, (Adler-Nissen, 1986). Determinación de las propiedades funcionales. El índice de actividad emulsionante (IAE) y la estabilidad emulsionante (EE) se determinaron mediante el método de Pearce y Kinsella (1978), con algunas modificaciones. Los análisis fueron realizados por triplicado. Actividad antioxidante. Se midió la de actividad antioxidante (AOX) del radical DPPH por el método de Von Gadow et al (1997) con algunas modificaciones. Los análisis se realizaron por triplicado.

4 DESARROLLO Se realizó un estudio de la susceptibilidad a la proteólisis de proteínas obtenidas de arroz Morelos A98 (PA), de sus fracciones proteínicas: albúminas, globulinas y glutelinas y, comparativamente, de proteínas aisladas de suero lácteo (PSL). Se analizó el efecto de dos proteasas de diferente especificidad y origen: tripsina y hemisfericina, ensayando diferentes tiempos de hidrólisis. Asimismo, con el propósito de conocer las propiedades funcionales de los productos de reacción generados en la proteólisis se determinaron las propiedades emulsionante y antioxidante. RESULTADOS En la Figura 1 se muestran los perfiles de grado de hidrólisis para las proteínas en estudio. Como puede observarse, en un tiempo de reacción de 120 min los valores de GH obtenidos fueron significativamente diferentes entre si, presentando las globulinas el valor más alto (11.5%). Es decir, las glutelinas fueron las proteínas que mostraron las mayor susceptibilidad a la tripsinólisis. Figura 1: Perfiles de grado de hidrólisis (GH) obtenidos con tripsina y hemisfericina. GH máximo alcanzado en 120 min de hidrólisis de las proteínas de arroz y de suero lácteo.

5 La separación por electroforesis en gel de poliacrilamida de los hidrolizados enzimáticos se muestran en la Figura 2. Los patrones de componentes de los hidrolizados de PSL con ambas enzimas, en todo el intervalo de tiempos de reacción ensayados, no mostraron grandes diferencias, indicativo de modificaciones menos extensivas: los componentes aparecen con pesos moleculares muy similares, con mayores diferencias principalmente en la concentración de algunas bandas y aparición de algunos componentes de bajo peso molecular. Los cambios electroforéticos que se observan de manera más objetiva son los de los componentes de las proteínas de arroz hidrolizadas con hemisfericina, siendo estos los que mostraron más diversidad de productos en función del grado de hidrólisis (tiempo de reacción). En general, los hidrolizados obtenidos con tripsina mostraron pocos cambios apreciables en la separación electroforética. Figura 2. Electroforesis en gel de poliacrilamida de los hidrolizados de proteínas de arroz y de suero lácteo. A: PSL-tripsina; B: PSL-hemisfericina; C: PA-tripsina y D: PAhemisfericina. M: marcadores de pesos moleculares; 1: sin tratamiento enzimático; 2: 15 min de hidrólisis; 3: testigo 15 min; 4: 60 min de hidrólisis; 5: testigo 60 min; 6: a 180 min de hidrólisis; 7: testigo de 180 min; 8: 360 min de hidrólisis; y 9: testigo de 360 min.

6 Figura 3. Índice de actividad emulsionante de los hidrolizados enzimáticos. A: proteínas de arroz; S: proteínas de suero lácteo; T: tripsina, H: hemisfericina; 15, 30, 60, 180 y 360: tiempo de hidrólisis (min). En la Figura 3 se presentan los resultados de la determinación de IAE de las proteínas totales de arroz y de las PSL, así como de los hidrolizados trípticos de las fracciones de arroz. El hidrolizado de PSL con hemisfericina a 180 minutos fue el que presentó la mayor actividad emulsionante, mientras que el valor más bajo se determinó en el hidrolizado de proteínas de arroz con tripsina a 60 minutos de reacción. El hidrolizado tríptico de la fracción de globulinas presentó el IAE más alto, en comparación con las otras dos fracciones aisladas y las proteínas totales de arroz; mientras que las albuminas, no obstante presentar valores de IAE menores, fueron las que mostraron las emulsiones más estables. En los hidrolizados de proteínas de arroz con tripsina se observaron valores de IAE bajos pero con una tendencia a aumentar con el tiempo de reacción. Por otra parte, los productos de reacción contenidos en los hidrolizados de PSL con hemisfericina fueron los que presentaron los valores significativamente más altos y mostraron tendencia a aumentar con el incremento del tiempo de reacción entre min.

7 Figura 4. Actividad antioxidante de los hidrolizados de proteínas de suero lácteo y arroz. A: Hidrolizados PSL-hemisfericina (SH); PSL-tripsina (ST); PA-hemisfericina (AH); PA-tripsina (AT). B: Hidrolizados trípticos (120 min) de las fracciones albúminas, globulinas y glutelinas de arroz. Ac. Asc.: ácido ascórbico. En la Figura 4 se muestran los resultados de AOX del DPPH de los hidrolizados con tripsina y hemisfericina de las proteínas de arroz y de las proteínas de suero lácteo. En general, puede observarse que los hidrolizados obtenidos con ambas proteínas produjeron una mejor respuesta antioxidante en tiempos de hidrólisis de 180 minutos (Figura 4-A); siendo los hidrolizados con hemisfericina los que resultaron con mayor capacidad antioxidante comparativamente con los hidrolizados trípticos. Los productos de reacción de los hidrolizados trípticos de las fracciones globulinas, albúminas y glutelinas mostraron altos valores de actividad antioxidante.

8 Los niveles de actividad antioxidante (AOX) sobre el radical 2,2-difenil-1-picril hidracilo (DPPH) generados por los péptidos contenidos en los hidrolizados con hemisfericina de las PA y de PSL, en tiempos de reacción cortos (30 min), produjeron un 40% de reducción de la oxidación; valor que se incrementó hasta 55% para 180 min de proteólisis. Por otra parte, los productos de los hidrolizados trípticos de las PSL mostraron una AOX muy baja, 15% aproximadamente. La tripsinólisis de las fracciones albúminas, globulinas y glutelinas del arroz generó productos de reacción con buenas características de actividad antioxidante, reduciendo hasta en un 75% la oxidación del radical DPPH (Figura 4-B). Mientras que los productos de reacción de los hidrolizados de proteínas de suero lácteo con la proteasa cisteínica hemisfericina fueron los que mostraron los mejores niveles de actividad emulsionante. DISCUSIÓN El estudio de susceptibilidad a la proteólisis de las proteínas obtenidas de arroz Morelos A98, de sus fracciones proteínicas: albúminas, globulinas y glutelinas y, comparativamente, de las proteínas aisladas de suero lácteo, mostró resultados que permiten su utilización para conformar un patrón característico de susceptibilidad de las diferentes especies proteínicas que contiene esa variedad de arroz que, se infiere, puede tener utilidad práctica para estudios comparativos entres variedades, entre tradicionales y nuevas variedades que se han mejorado en aspectos de productividad o resistencia a plagas. Adicionalmente, la proteólisis de una determinada estructura o conformación, por razón de la susceptibilidad característica que presenta a la acción de una enzima de alta especificidad, como por ejemplo la tripsina, genera patrones de fragmentos peptídicos cuyas secuencias o estructuras pueden corresponder a una funcionalidad o actividad biológica realzada. CONCLUSIONES Se logró la separación de tres de las cuatro fracciones de proteínas que contiene el arroz, empleando la variedad A-98; así como la purificación parcial rápida por reacción en lote de una preparación de proteínas de suero lácteo con CMC. Los modos de acción de la tripsina y de la hemisfericina produjeron resultados diferentes con cada tipo de sustrato ensayado, mostrando que la susceptibilidad a la proteólisis de cada proteína fue diferente. Las fracciones de proteínas aisladas de arroz presentaron diferencias significativas en su susceptibilidad a la hidrólisis tríptica, como reflejo de sus diferencias estructurales. El análisis de funcionalidad de los productos de reacción de los hidrolizados obtenidos con ambas enzimas mostró que, en general, los hidrolizados de proteínas de suero lácteo presentaron una mayor estabilidad emulsionante en comparación con los hidrolizados de

9 proteínas de arroz; mientras que la actividad antioxidante de los productos de hidrólisis de ambos sustratos fue similar. Los niveles de actividad antioxidante (AOX) sobre el radical 2,2-difenil-1-picril hidracilo (DPPH) generados por los péptidos contenidos en los hidrolizados con hemisfericina de las PA y de PSL, en tiempos de reacción cortos (30 min), produjeron un 40% de reducción de la oxidación; valor que se incrementó hasta 55% para 180 min de proteólisis. Por otra parte, los productos de los hidrolizados trípticos de las PSL mostraron una AOX muy baja, 15% aproximadamente. La tripsinólisis de las fracciones albúminas, globulinas y glutelinas del arroz generó productos de reacción con buenas características de actividad antioxidante, reduciendo hasta en un 75% la oxidación del radical DPPH. Mientras que los productos de reacción de los hidrolizados de proteínas de suero lácteo con la proteasa cisteínica hemisfericina fueron los que mostraron los mejores niveles de actividad emulsionante. Los resultados obtenidos mostraron que las propiedades de la cisteínica hemisfericina puede ser una buena alternativa para estudios bioquímicos en que interese probar la susceptibilidad de proteínas, así como, en aspectos prácticos, para modificar y mejorar la funcionalidad de proteínas de interés alimentario. Reconocimientos Financiamientos de la SPI-IPN y ; FOMIX-CONACYT-GOB CAMP Briones-Martínez Roberto y Cortés-Vázquez M. Isabel son Becarios EDI y SIBE- IPN. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Adler Nissen, J., Eriksen, S y Olsen, H. S Improvement of the functionality of vegetable proteins by controlled enzymatic hydrolysis. Qual. Plant. Plant. Foods Hum. Nutr., 32, Adler-Nissen, J Enzymatic Hydrolysis of Food Proteins; Elsevier Applied Science Publishers: London. 3. Briones-Martínez, R.; Cruz y Victoria M. T.; Oliver-Salvador, M. C. y Cortés-Vázquez, M. I Preparaciones enzimáticas de interés industrial con proteinasas de plantas mexicanas. Información Tecnológica Revista Latinoamericana, Chile. 5:1, Ju, Z. Y., Hettiarachchy, N. S. y Rath, N Extraction, denaturation and hydrophobic properties of rice flour proteins. Journal of Food Science, 66:2,

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