Quimiometría CALIBRACIÓN MULTIVARIADA
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- Juan José Lagos Ferreyra
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1 CALIBRACIÓN MULTIVARIADA
2 Calibración multivariada un método multivariado implica que: existe una dependencia múltiple de la variable x (independiente) y múltiples variables y (dependiente) el número de muestras de calibración debe ser mayor que el número de predictores
3 Calibración multivariada aproximaciones multivariadas para crear una curva de calibración: regresión clásica u ordinaria (classical/ordinary least squares, CLS) regresión de componentes principales (principal component regression, PCR) regresión de cuadrados mínimos parciales (partial least squares regression, PLS) optimizan el ajuste de los datos de manera diferente método de evaluación y resultados similares
4 Calibración bivariada se emplean datos instrumentales medidos utilizando: más de un sensor para la determinación simultánea de dos o más analitos un analito en presencia de interferentes ejemplo típico de datos multisensoriales: espectros de absorción electrónica (UV-Vis-IR) o de emisión: absorbancia o intensidad de fluorescencia: señal instrumental longitudes de onda: sensores
5 Calibración bivariada etapa de calibración típica: preparar soluciones de concentración conocida de ambos analitos estimar, a partir de las señales medidas a dos longitudes de onda (o a dos sensores diferentes), las respectivas relaciones señal-concentración las soluciones de calibrado pueden ser mezclas de ambos analitos (o soluciones conteniendo los analitos en forma pura, si estos es experimentalmente posible)
6 Calibración bivariada Quimiometría etapa de calibración: determinación de las sensibilidades individuales a cada longitud de onda se supone que se cumple la ley de Beer ejemplo: la señal de la mezcla número 1 a la longitud de onda 1 se obtiene a partir de la suma de las contribuciones de ambos analitos: Y 11 = X 11 S 11 + X 12 S 12 S 11 y S 21 : sensibilidades del analito 1 y 2 respectivamente a la longitud de onda 1
7 en notación matricial: Calibración bivariada las correspondientes respuestas instrumentales Y ij (absorbancias de la solución patrón i a la longitud de onda j) se reúnen en la matriz (2 2) de calibración Y: Y=[ Y 11 Y 12 Y 21 Y 22]
8 en notación matricial: Calibración bivariada las concentraciones de ambos analitos en las soluciones de calibrado se agrupan en la matriz de concentraciones de calibración (2 2) X elemento genérico X in es la concentración en la mezcla i del analito n: X=[ X 11 X 12 X 21 X 22]
9 Calibración bivariada Quimiometría en notación matricial: en general Y se puede escribir mediante el siguiente producto matricial: Y= X S T donde S es una matriz (2 2) cuyo elemento genérico S jn es la sensibilidad a la longitud de onda j del analito n se puede obtener la matriz S a partir de: S= (X 1 Y) T = Y T (X 1 ) T
10 Calibración bivariada si X se expresa términos de concentraciones molares, entonces S jn es la absortividad molar a la longitud de onda j del componente n (multiplicada por el paso óptico) sin embargo, se prefiere llamar a los elementos S jn sensibilidades, dado que el modelo matemático no está restringido a datos de absorción
11 Calibración bivariada en forma gráfica: para N analitos, I muestras de calibrado y J longitudes de onda
12 etapa de predicción: Calibración bivariada se miden las señales instrumentales para una muestra incógnita (ejemplo, dos absorbancias a las longitudes de onda a las que se realizó la calibración) estas señales y 1 e y 2 se agrupan en el vector columna (2 1) y: y=[ y 1 y 2]
13 Calibración bivariada Quimiometría etapa de predicción: se recurre a la ley de Beer aplicada a la muestra incógnita: y= S x x: es un vector columna (2 1) que contiene los elementos buscados en el análisis (las concentraciones desconocidas) de ambos analitos en la incógnita despejando x : x= S 1 y
14 Coeficientes de regresión Quimiometría en forma gráfica: la concentración de cada analito en la muestra incógnita se predice mediante el siguiente producto escalar: x n = (n ava fila de S 1 ) y
15 Coeficientes de regresión la n ava fila de S 1 una vez traspuesta (o sea, convertida en un vector columna) cumple un papel importante en el análisis multivariado, donde corrientemente se denomina β n (vector de los coeficientes de regresión) β n = (n ava fila de S 1 ) T Quimiometría x n = β n T y = β 1n y 1 + β 2n y 2 la concentración predicha es el producto escalar del vector β n por el vector de respuestas instrumentales
16 Colinealidad un paso crítico para estimar la concentración con la ecuación x= S 1 y es la inversión de la matriz S una matriz es invertible si su determinante es distinto de cero sino la matriz es singular (y su inversa no existe) si por alguna razón el determinante de la matriz S, aunque no sea exactamente cero, es pequeño (en comparación con el nivel de ruido instrumental): S será difícilmente invertible, en el sentido que los elementos de S 1 estarán pobremente definidos
17 Colinealidad la singularidad de la matriz S (su dificultad de inversión) está directamente relacionadas con el concepto de paralelismo o colinealidad espectral en términos matemáticos: el determinante de S será cercano a cero si sus filas son combinaciones lineales
18 Colinealidad Quimiometría si se grafica la sensibilidad para cada analito (1 y 2) a cada una de las dos longitudes de onda de trabajo (λ 1 y λ 2 ) y se unen los puntos correspondientes a cada analito se obtienen dos líneas rectas cuanto más paralelas sean estas líneas rectas, más difícil será la inversión de S y más cercano a cero su determinante
19 Cifras de mérito Quimiometría sensibilidad para el analito n SEN n = β 1 n : longitud o norma del vecto β n 1 = β 2 n β n selectividad para el analito n: cociente entre la SEN n y el valor que tendría dicha sensibilidad si n estuviese presente en su forma pura: SEL n = SEN n / n ava. columna de S
20 Cifras de mérito Quimiometría selectividad: número adimensional que varía entre 0 (no selectivo para n) y 1 (específico para n) sensibilidad analítica: el cociente entre el valor de SEN n y el ruido instrumental (s R ) obtenido a partir de replicados de una muestra blanco: γ n = SEN n / s y
21 Regresión multivariada es una extensión del método anterior para el análisis de varios analitos mediante múltiples sensores etapa de calibración: es preciso preparar mezclas de patrones de los analitos: en un número como mínimo igual al de analitos (en general, mayor) el rango de concentraciones debe ser representativo de las concentraciones que se espera encontrar etapa de validación: para probar el modelo etapa de predicción
22 Aplicación de regresión multivariada determinación de la concentración de constituyentes en una mezcla de analitos por análisis espectral por regresión multivariada o regresión lineal múltiple las variables para cada muestra se pueden dividir en dos grupos: variables respuestas: absorbancias a las diferentes longitudes de onda variables predictoras: concentraciones de los analitos análisis multivariado es apropiado si los espectros de los constituyentes se superponen (por lo cual no se puede determinar la concentración sin separación química previa)
23 Aplicación de regresión multivariada etapa de calibración: se toman una serie de soluciones conteniendo diferentes mezclas de analitos y se obtienen los espectros de absorción ejemplo: absorbancia UV (x100) a seis longitudes de onda de 10 soluciones para calibración conteniendo los tres constituyentes de interés en la práctica se obtienen cientos de longitudes de onda
24 Ejemplo regresión multivariada C 1 C 2 C 3 A 1 A 2 A 3 A 4 A 5 A 6 A 0,89 0,02 0,01 18,7 26,8 42,1 56,6 70,0 83,2 B 0,46 0,09 0,24 31,3 33,4 45,7 49,3 53,8 55,3 C 0,45 0,16 0,23 30,0 35,1 48,3 53,5 59,2 57,7 D 0,56 0,09 0,09 20,0 25,7 39,3 46,6 56,5 57,8 E 0,41 0,02 0,28 31,5 34,8 46,5 46,7 48,5 51,1 F 0,44 0,17 0,14 22,0 28,0 38,5 46,7 54,1 53,6 G 0,34 0,23 0,20 25,7 31,4 41,1 50,6 53,5 49,3 H 0,74 0,11 0,01 18,7 26,8 37,8 50,6 65,0 72,3 I 0,75 0,01 0,15 27,3 34,6 47,8 55,9 67,9 75,2 J 0,48 0,15 0,06 18,3 22,8 32,8 43,4 49,6 51,1
25 Ejemplo regresión multivariada aproximación clásica: variables dependientes: absorbancias Quimiometría variables independientes: concentraciones se busca una ecuación entre estos dos grupos de variables que permita relacionar la absorbancia A i a cada λ con las concentraciones de los analitos asumiendo que la A a cada λ es la suma de las A de cada componente individual: A i = b 0i + b 1i c 1 + b 2i c 2 + b 3i c 3 + b 4i c 4 + b 5i c 5 + b 6i c 6
26 Ejemplo regresión multivariada en la práctica este modelo aditivo simple puede no ser adecuado las sustancias de interés pueden interferir químicamente entre ellas afectando los espectros las muestras reales pueden contener otras sustancias además de las consideradas que contribuyan a la absorbancia
27 Ejemplo regresión multivariada Quimiometría es mejor usar una calibración inversa: la concentración del analito se modela a partir del espectro c i = b 0i + b 1i A 1 + b 2i A 2 + b 3i A 3 + b 4i A 4 + b 5i A 5 + b 6i A 6 las c i : no son consideradas variables controladas para llevar a cabo la regresión lineal múltiple el número de muestras debe ser mayor que el número de predictores, como en la tabla: muestras: 10 predictores: 6
28 Empleando Minitab Quimiometría Regression Analysis: c 1 versus A 1. A 2.A 3. A 4. A 5. A 6 The regression equation is c 1 = 0, ,00252 A 1-0,00939 A 2 + 0,00375 A 3-0,00920 A 4-0,00106 A 5 + 0,0179 A 6
29 Empleando Minitab Quimiometría Regression Analysis: c 1 versus A 1. A 2.A 3. A 4. A 5. A 6 Predictor Coef SE Coef T P Constant 0, , ,56 0,615 A 1 0, , ,30 0,783 A 2-0, , ,07 0,365 A 3 0, , ,64 0,567 A 4-0, , ,79 0,172 A 5-0, , ,20 0,857 A 6 0, , ,95 0,004 S = 0, R-Sq = 99,6% R-Sq(adj) = 98,9% PRESS = 0, R-Sq(pred) = 90,55%
30 Analysis of Variance Empleando Minitab Source DF SS MS F P Regression 6 0, , ,52 0,001 Residual Error 3 0, , Total 9 0, Source DF Seq SS A 1 1 0, A 2 1 0, A 3 1 0, A 4 1 0, A 5 1 0, A 6 1 0,022506
31 Empleando Minitab repetir para c 2 y c 3 c 2 = 0, ,0067 A 1-0,0007 A 2-0,0184 A 3 + 0,0141 A 4 + 0,0160 A 5-0,0152 A 6 c 3 = - 0, ,00168 A 1 + 0,00754 A 2 + 0,00668 A 3 + 0,00221 A 4-0,00510 A 5-0,00237 A 6
32 para evaluar el modelo: coeficiente de regresión análisis de residuos validación cruzada: Empleando Minitab dejar la muestra A fuera y repetir la regresión predecir las concentraciones de A calcular la suma de los cuadrados de las diferencias PRESS (predicted residual error sum of squares): cuanto más cercano a cero, mejor es la capacidad predictiva del modelo
33 Empleando Minitab los residuos están distribuidos al azar y no siguen un patrón particular
34 Empleando Minitab los residuos están distribuidos normalmente, no se observan datos atípicos
35 Empleando Minitab para probar la hipótesis nula: valores de los estadísticos t (T) y de p (P) si se consideran todas las variables en el modelo solo A 6 es significativa las longitudes de onda A 1 a A 5 se pueden dejar de lado sin reducir la efectividad del modelo se podrían probar todas las posibles combinaciones de variables predictoras y encontrar el modelo que logra la mejor predicción (menor PRESS) para el menor número de variables predictoras
36 Ventajas de la regresión multivariada modelo matemático sencillo posibilidad de desacoplar componentes se pueden estudiar mezclas complejas mediante un proceso de calibración en el que se conoce sólo la concentración del componente de interés
37 Desventajas de la regresión multivariada es necesario concoer los componentes químicos presentes en las mezclas, sino los interferentes producirán errores se debe realizar validación cruzada y cálculo de PRESS cuando se tienen cientos de longitudes de onda y las variables predictoras exceden el número de muestras es sensible a las colinealidades espectrales Quimiometría se debe usar un número reducido de sensores, con la consecuente pérdida de información y por ende de sensibilidad cuando las variables predictoras están altamente correlacionadas puden surgir complicaciones matemáticas y se obtienen predicciones poco confiables
38 Regresión por componentes principales (PCR) objetivo: reducir el número de variables predictoras usando los primeros componentes principales en lugar de las variables originales el método funciona bien si hay un alto grado de correlación entre variables predictoras, lo cual suele ocurrir en casos de calibración inversa
39 Regresión por componentes principales (PCR) aspecto fundamental: estimación del número de PC (por scree plot, PRESS, variación explicada) si se emplean menos PC que los necesarios se obtiene una situación poco deseable llamada subajuste de los datos demasiados PC no aportan información relevante sino esencialmente ruido: sobreajuste en general, no es aconsejable utilizar un número de PC superior a la mitad del número de mezclas de calibración
40 Empleando Minitab debe realizarse primero un PCA para los datos de la tabla anterior Principal Component Analysis: A 1.A 2.A 3.A 4.A 5.A 6 Eigenanalysis of the Covariance Matrix Eigenvalue 210,01 73,86 4,62 0,93 0,79 0,28 Proportion 0,723 0,254 0,016 0,003 0,003 0,001 Cumulative 0,723 0,977 0,993 0,996 0,999 1,000
41 Empleando Minitab Quimiometría Principal Component Analysis: A 1.A 2.A 3.A 4.A 5.A 6 Variable PC1 PC2 PC3 A 1-0,124-0,592-0,253 A 2-0,017-0,513 0,048 A 3 0,066-0,571-0,102 A 4 0,244-0,239 0,575 A 5 0,510-0,042 0,545 A 6 0,813 0,043-0,544 los primeros PCs explican más del 99 % de la variación en las absorbancias se pueden seleccionar solo estas dos absorbancias (sin sentido cuando son tan pocas variables predictoras)
42 Empleando Minitab Quimiometría obtener las puntuaciones (scores) de los PC seleccionados, en este caso 3, pero se pueden calcular más Muestra Z 1 Z 2 Z 3 A 117,126-61, ,7148 B 82,975-73, ,6156 C 89,007-76, ,8135 D 86,833-58, ,3197 E 76,229-74, ,4500 F 81,880-60, ,0386 G 78,686-66, ,2530 H 103,970-58, ,9048 I 108,561-74, ,1318 J 76,919-51, ,3175
43 Empleando Minitab Quimiometría obtener la ecuación de regresión Regression Analysis: c 1 versus z 1. z 2. z 3 The regression equation is c 1 = 0, ,0119 z 1 + 0,00419 z 2-0,0171 z 3 Predictor Coef SE Coef T P Constant 0, , ,04 0,337 z 1 0, , ,05 0,000 z 2 0, , ,14 0,000 z 3-0, , ,27 0,000 S = 0, R-Sq = 99,5% R-Sq(adj) = 99,3% PRESS = 0, R-Sq(pred) = 98,96%
44 Empleando Minitab en este caso PRESS PCR < PRESS CLS cuál modelo es mejor? por qué?
45 Empleando Minitab Quimiometría para obtener una expresión en función de la concentración reemplazar z en términos de A empleando las puntuaciones (loadings) z 1 z 2 z 3-0, , , , , , , , , , , , , , , , , ,543617
46 Empleando Minitab Quimiometría para obtener una expresión en función de la concentración reemplazar z en términos de A empleando las puntuaciones (loadings) z 1 = - 0,124A 1-0,017A 2 + 0,066A 3 + 0,244A 4 +0,510A 5 +0,813A 6 c 1 = 0, ,00037 A 1 0,00317 A 2 + 0,00014 A 3 0,00792 A 4 0,00343 A 5 + 0,0190 A 6 repetir para las otras concentraciones
47 Ventajas de la PCR PCR combina las ventajas de la regresión multivariada es posible la calibración directa, que permite ignorar las concentraciones de compuestos químicos desconocidos durante el calibrado el uso de espectros abstractos (scores) elimina los problemas asociados con la colinealidad espectral
48 Desventajas de la PCR interfencias no modeladas: si aparece en una muestra incógnita un compuesto no contenido en la calibración, el análisis no será exacto los modelos son capaces de detectar interferencias, aunque no de corregirla PCR sólo utiliza correlaciones entre las variables predictoras si se miran los datos de la tabla se observa que también hay correlación entre las variables predictoras y las variables respuesta
49 Regresión por cuadrados mínimos parciales (PLS) PLS (partial least-squares) emplea combinaciones lineales para predecir diferencia con PCR es la forma de elegir estas combinaciones: PCR: describen la máxima variación de las variables predictoras PLS: las variables que tienen mayor correlación con la respuesta tienen un peso extra por ser más efectivas para la predicción
50 Regresión por PLS PLS opera de manera similar a PCR weigth loading factors: contenidos en una matriz usualmente llamada W loadings: contenidos en una matriz llamada P las columnas de W son ortogonales, mientras que las de P no necesariamente lo son, a diferencia de PCR
51 Regresión por PLS las columnas de W no son autovectores propiamente dichos, sino factores obtenidos mediante una técnica diferente a la de PCR, cuyos elementos dependen de las concentraciones de calibración del analito de interés la obtención de estos factores se lleva a cabo mediante un algoritmo iterativo cíclico, muy similar a PCR diferencia fundamental: en PLS los factores describen la máxima correlación posible entre la matriz de datos y el vector de concentraciones del analito de interés
52 Regresión por PLS Formas de llevar a cabor PLS: PLS1: cada variable respuesta se trata separadamente (más común) PLS2: las variables respuesta se tratan colectivamente, se suele usar solamente cuando las variables respuesta están correlacionadas entre sí
53 Regresión por PLS empleando Minitab PLS Regression: c1 versus A 1, A 2, A 3, A 4, A 5, A 6 Number of components selected by cross-validation: 4 Number of observations left out per group: 1 Number of components cross-validated: 6 Analysis of Variance for c 1 Source DF SS MS F P Regression 4 0, , ,84 0,000 Residual Error 5 0, , Total 9 0,290560
54 Regresión por PLS Model Selection and Validation for c 1 Components X Variance Error SS R-Sq PRESS R-Sq (pred) 1 0, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,905498
55 Regresión por PLS c 1 c 1 standardized Constant 0, ,00000 A 1 0, ,11981 A 2-0, ,27695 A 3 0, ,10753 A 4-0, ,22261 A 5-0, ,01425 A 6 0, ,16114
56 Regresión por PLS Quimiometría
57 Regresión por PLS evaluación de los resultados: método leave-one-out usando validación cruzada el número de componentes necesario para modelar c 1 = 4 se elige a partir del calor de PRESS es menor para el modelo de 4 componentes (PRESS=0, ) la capacidad predictiva del modelo disminuye si se agregan más componentes
58 Regresión por PLS la ecuación de regresión es: c 1 = 0, ,0040 A 1 0,0112 A 2 +0,0038 A 3-0,0092 A 4 0,0003 A 5 + 0,0176 A 6 obtener ecuaciones pjara predecir c 2 y c 3 de manera similar
59 Comparación de resultados ecuación de regresión para c 1 empleando los distintos métodos multivariados: CLR c 1 = 0, ,000252A 1 0,00939A 2 + 0,00375A 3 0,00920A 4 0,00106A 5 + 0,0179A 6 PCR c 1 = 0, ,00037A 1 0,00317A 2 + 0,00014A 3 0,00792 A 4 0,00343 A 5 + 0,0190 A 6 PLS c 1 = 0, ,0040A 1 0,0112A 2 +0,0038A 3-0,0092 A 4 0,0003 A 5 + 0,0176 A 6
60 Ventajas de la regresión por PLS es el método de calibración multivariada más empleado cuando la información instrumental proveniente de cada muestra es de tipo vectorial incorpora información útil referida a concentraciones de calibrado durante la etapa de cálculo de las variables latentes
61 Desventajas de la regresión por PLS interfencias no modeladas: desventaja de los métodos multivariados métodos para calibración multivariada: se basan en el procesamiento de datos del tipo vectorial (espectros, voltamperogramas u otro tipo similar de datos instrumentales)
62 Tipos de calibraciones Quimiometría calibración de orden cero: calibración univariada se clasificaría como de orden cero calibración de primer orden: basada en vectores para cada muestra se llama calibración (un vector se considera, en lenguaje tensorial, como un tensor de primer orden) calibración de segundo orden: empleando datos matriciales para cada muestras (EEM, obtenidas fácilmente en un espectrofluorómetro convencional), matrices de absorbancia-tiempo (obtenidas a través de una reacción química en un espectrofotómetro de arreglo de diodos), etc.
63 Ventajas de las calibraciones de orden superior ventaja de segundo orden: se pueden cuantificar analitos calibrados en presencia de interferencias no calibradas propiedad ausente en los datos de primer orden presenta inmensas posibilidades en el análisis de mezclas complejas, en particular las de origen biológico, alimentos métodos: PARAFAC,...
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