UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR ÁREA DE CONOCIMIENTO DE CIENCIAS DEL MAR DEPARTAMENTO ACADEMICO DE BIOLOGÍA MARINA TESIS

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1 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR ÁREA DE CONOCIMIENTO DE CIENCIAS DEL MAR DEPARTAMENTO ACADEMICO DE BIOLOGÍA MARINA TESIS Efecto in vitro del extracto etanólico de Macrocystis pyrifera sobre el desarrollo de microepífitos. QUE COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TÍTULO DE BIÓLOGO MARINO PRESENTA: Lucero Gómez Alcalá DIRECTOR: Dr. Iván Murillo Álvarez LA PAZ, BAJA CALIFORNIA SUR, DICIEMBRE DEL 2012

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3 Agradecimientos A mi comité revisor, Iván Murillo, Mauricio Muñoz, Francisco Nieto, Juan Manuel López y Rafael Riosmena agradezco la oportunidad que me dieron de trabajar con ustedes, el tiempo que dedicaron, el basto conocimiento que me compartieron, la cordialidad y su amistad. Aprovecho también para agradecer por los trabajos de Lorena Durán y Gaël Quesseveur, los cuales fueron la base primordial para elaborar este trabajo. Del mismo modo, agradezco a todo aquel que compartió su conocimiento, experiencia, apoyo y amistad para terminar este proyecto que es el inicio de algo mayor. GRACIAS

4 Índice Lista de Figuras Lista de Tablas... Glosario.. Resumen II II III VII 1. Introducción Antecedentes Distribución y descripción de Macrocystis pyrifera Justificación Objetivo Metodología Zona de estudio y recolecta de Macrocystis pyrifera Obtención del extracto etanólico Fraccionamiento inicial del extracto etanólico Evaluación de la actividad antibacteriana y anti-incrustante Ensayo de difusión en agar con discos Ensayo de microdilución en placa Fraccionamiento de CC2F Identificación estructural del compuesto activo Resultados Actividad biológica Caracterización estructural Discusión Conclusiones Literatura citada Anexos 49

5 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Macrocystis pyrifera. Al norte, se distribuye sobre las costas del Pacífico de Norteamérica, México, EU y Alaska. Al sur tiene una distribución circunsubantártica desde Perú hasta Cabo de Hornos en América, Sudáfrica, Australia y Nueva Zelanda 11 Figura 2. Punta Eugenia, BCS. Sitio de colecta de M. pyrifera (mapa de Durán-Riveron, 2009) Figura 3. Fraccionamiento guiado por bioensayo de la fracción CC2 F3 derivada de la fase orgánica del extracto de M. pyrifera. 24 Figura 4. Espectro infrarrojo de la fracción CC3F2. Se observan cuatro señales principales en la zona general del espectro y pequeñas señales en la zona de la huella dactilar, entre 600m -1 y 1400m LISTA DE TABLAS Tabla I. Actividad anti-incrustante de M. pyrifera, método de dilución en microplacas 27 Tabla II. Efecto de M. pyrifera sobre el crecimiento microalgal, método de microdilución en placa. 28 Tabla III. Actividad antibacteriana de M. pyrifera, método de difusión en agar. 29 II

6 GLOSARIO Ácidos grasos: son biomoléculas de naturaleza lipídica que consisten en un grupo carboxilo (polar) unido a una cadena hidrocarbonada lineal con número par de átomos de carbono. La mayoría de los ácidos grasos encontrados en la naturaleza contienen entre átomos de carbono. La principal función de los ácidos grasos es como reserva de energía. Agar: es un polisacárido compuesto de agarosa (70%) y agaropectina, que se extrae de algunas algas rojas. Los geles de agar son transparentes, duros y quebradizos, sirven como coloides y espesantes, y son un valioso medio de cultivo utilizado en bacteriología. Agar Mueller Hinton: es un medio utilizado para realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en microorganismos aeróbicos. El Agar Mueller Hinton cumple con los requerimientos de la Organización Mundial de la Salud y está especificado en la FDA (Food and Drug Administration). Este medio es el seleccionado por la NCCLS (National Commitee for Clinical Laboratory Standards) para realizar las pruebas de susceptibilidad, por su alta reproducibilidad, su bajo contenido de substancias inhibidoras y el crecimiento satisfactorio que presentan la mayoría de los patógenos. Anti-incrustante: se refiere a las sustancias que tienen actividad contra organismos involucrados en el epifitismo. Biocidas: definidos por la legislación Europea actual, como: las sustancias activas y preparados que contengan una o más sustancias activas, presentados en la forma en que son suministrados al usuario, destinados a destruir, contrarrestar, neutralizar, III

7 impedir la acción o ejercer un control de otro tipo sobre cualquier organismo nocivo por medios químicos o biológicos. Biofouling: deterioro o degradación ocasionada por organismos vivos (bacterias, algas, protozoos y crustáceos) sobre superficies tales como tuberías, tanques y cascos de buques que se encuentran sumergidas en el agua, lo que resulta en corrosión, obstrucción, contaminación o disminución en la eficiencia de piezas móviles. Bosques de kelps: son ecosistemas marinos, uno de los hábitat más productivos del mar que ofrecen protección y alimento a una gran cantidad de organismos. Destaca la alta tasa de crecimiento del género Macrocystis y la especie Nereocystis luetkeana. Cromatografía: es el método físico de separación de los componentes de una muestra. Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, donde los componentes se distribuyen entre dos fases, una estacionaria y otra móvil. Los componentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase estacionaria, lo que hace que atraviesen esta fase a distintas velocidades y así se separan los componentes. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido y puede estar empaquetada en una columna, extendida en una capa o distribuida como una película. Cromatografía en columna: donde la fase estacionaria se sitúa dentro de una columna, y según el fluido empleado, puede ser cromatografía de líquidos o gases. Cromatografía plana: donde la fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre papel (en papel o capa fina). IV

8 Epifitismo: forma de vida en donde un organismo vegetal, el epífito, utiliza como sustrato para vivir a otro organismo vegetal. Este término se deriva de epi (sobre) y fito (vegetal). Epibiosis: es la relación, permanente o no, que se establece entre dos especies diferentes en la que una sirve de sustrato de fijación para la otra, el epibionte. También se aplica el concepto como ensuciamiento biológico, o bien, asentamiento de algún organismo en cualquier estructura sumergida en el agua. Espectrometría de infrarrojo: La espectrometría de infrarrojos (espectroscopia IV) es un tipo de espectrometría de absorción que utiliza la región infrarroja del espectro electromagnético. Grupo funcional: Conjunto de átomos, enlazados de una determinada forma, que presentan una estructura y propiedades físico-químicas determinadas que caracterizan a los compuestos orgánicos que los contienen. Metabolismo: es el conjunto de reacciones químicas que ocurren en el interior de la célula. Metabolismo primario: se refiere al conjunto de procesos metabólicos que desempeñan una función esencial en el vegetal, tal como la fotosíntesis, respiración y el transporte de solutos, los productos de este metabolismo (metabolitos primarios) tienen una distribución universal en todas las plantas, como aminoácidos, nucleótidos, lípidos, etc. Metabolismo secundario: no es fundamental para el crecimiento, desarrollo o reproducción del organismo, y sus productos, metabolitos secundarios, no poseen una distribución universal, sin embargo se cree que la función principal es de incrementar la probabilidad de la sobrevivencia de los organismos. V

9 Método de difusión en agar con disco: método generalmente utilizado y aprobado por el NCCLS para efectuar las pruebas de sensibilidad. Principios activos: es la sustancia responsable de la actividad biológica, ya sean drogas, antibacterianos, etc. y regularmente derivan de recursos naturales para emplearse en los fármacos, sin embargo existen principios activos sintéticos. Productos naturales: compuestos producidos por los organismos vivos, son los metabolitos secundarios, y se ha observado que tienen un valor terapéutico causando algún efecto sobre los organismos vivos, actuando como antibióticos, antitumorales, antivirales, insecticidas, sustancias citotóxicas y neurotóxicas, además de anti incrustantes. Protocolo de aislamiento guiado por bioensayo: metodología que consiste en el fraccionamiento de una mezcla para aislar los principios activos, a partir de ensayos de actividad biológica previos a cada fraccionamiento; de este modo se eligen únicamente fracciones activas y/o las más activas. Sensidiscos: son discos de papel filtro que se emplean para los ensayos de actividad biológica. Sílica: el gel de sílice es una forma granular y porosa de dióxido de silicio fabricado sintéticamente a partir de silicato sódico. En química se usa en la cromatografía como la fase estacionaria. VI

10 Resumen La epibiosis, o bien, el asentamiento de los organismos ya sea sobre otros organismos o sobre estructuras creadas por el hombre, suelen tener efectos negativos, de modo que en la acuacultura y en la transportación naval principalmente, se han valido del conocimiento de los productos naturales que se obtienen a partir del metabolismo secundario de algunas especies, principalmente marinos, para elaborar revestimientos que eviten o disminuyan el encrustamiento de organismos epibiontes. Con el objetivo de identificar metabolitos con actividad anti-incrustante en el alga parda Macrocystis pyrifera se eligió la fracción de baja polaridad CC2F3 resultado del fraccionamiento que realizó Durán-Riverol, la cual presentó actividad contra varias cepas bacterianas. Para continuar con el fraccionamiento guiado por bioensayo, se realizó la técnica de cromatografía en placas TLC y se estableció el sistema de fraccionamiento para realizar la técnica de cromatografía en columna sobre sílica. En total se realizaron dos fraccionamientos, se obtuvieron ocho fracciones y se determinó que M. pyrifera puede inhibir el crecimiento de Staphylococcus aureus y Vibrio parahaemolyticus, bacterias que están relacionadas en el microepifitismo. Mediante espectroscopia de infrarrojo se analizó la fracción más activa y se determinó que está compuesta por ácidos grasos. Palabras clave: Ácidos grasos, Macrocystis pyrifera, actividad anti-incrustante, productos naturales, cromatografía. VII

11 1. Introducción El epifitismo se define como una forma de vida que ocurre cuando un organismo, el epífito, utiliza como sustrato para vivir a otro organismo vegetal (Borowitzka & Lethbridge, 1989). Se sabe que el epífito busca recursos tales como espacio, refugio y alimento en los hospederos; la mayoría de las publicaciones sugieren que estos organismos pueden tener una marcada y negativa influencia en el alga hospedera al interferir en su susceptibilidad, en la esporulación o en la captación de luz o nutrientes (Dixon et al., 1981; Scheibling et al., 1999). Esta información ha hecho suponer que los epífitos tienen un efecto negativo en el crecimiento, sobrevivencia y fecundidad del alga colonizada, cuando en realidad no existen tales evidencias (Hepburn & Hurd, 2005). Por el contrario, se ha demostrado una posible relación de mutuo beneficio, donde las algas proveen protección y alimento (De Burg & Frankboner, 1978); al mismo tiempo que aprovechan el amonio y dióxido de carbono que producen sus epífitos cuando la concentración de estas moléculas en el ambiente se encuentra limitada (Hurd et al., 1994; Taylor & Ress, 1988). El fenómeno de epifitismo, sin embargo, no se restringe a los vegetales marinos; cualquier otro organismo o superficie sólida sumergida en el mar es susceptible a la epibiosis, o bien, al asentamiento de otras especies. Para que cualquier comunidad biótica de bacterias, algas o invertebrados se asiente sobre una superficie, existen varias etapas que implican en su fase inicial, un microepifitismo, es decir una primera colonización por microorganismos, ya sean 1

12 bacterias o microalgas. La primera colonización comprende cuatro pasos: primero los biopolímeros que están en el agua se adsorben a la superficie, luego, si hay atracción química con alguna bacteria se da una adsorción reversible donde únicamente hay un asentamiento en la superficie, casi inmediatamente la adsorción es irreversible cuando la bacteria se une a la superficie con estructuras celulares y finaliza con la formación de colonias bacterianas. Con el crecimiento bacteriano se produce un mucílago o sustancia exopolimérica (EPS) que les permite a los nuevos epibiontes establecerse sobre un sustrato más adecuado, y ocurre entonces una sucesión ecológica (Bakus et al., 1986; Henschell & Cook, 1990). Hay ciertas especies de bacterias, cuyo asentamiento tiene efectos negativos sobre el organismo hospedero, de modo que muchos organismos en el ambiente marino han evolucionado a mecanismos de defensa contra el asentamiento y crecimiento de estas especies, lo que en farmacognosia se conoce como capacidad anti-incrustante (Scardino & de Nys, 2010). La gran mayoría de organismos sésiles, tales como esponjas, cnidarios y algas, que no presentan formas motoras de defensa, se ven obligadas a desarrollar adaptaciones metabólicas que les permitan sintetizar naturalmente compuestos de defensa que les proporcionan ventajas en el ambiente marino. A la elaboración de estos compuestos se le denomina metabolismo secundario, y a lo que resulta de él, se conoce como metabolitos secundarios o bien productos naturales. Se define como metabolismo secundario porque a diferencia del metabolismo primario, no es un 2

13 proceso fundamental para el crecimiento o reproducción del organismo, sin embargo, los compuestos resultantes tienen un papel ecológico importante en contra de la herbivoría, ataque de patógenos o depredadores, competencia y/o en la protección en relación con el estrés biótico, como cambios térmicos o lumínicos y deficiencias nutricionales (Darías-Jerez, 1998; Márquez et al., 2003; Maschek & Baker, 2008). Por eso la ocurrencia y concentración de los metabolitos secundarios depende de condiciones externas como el modo de vida y el hábitat; por lo que los organismos que habiten ambientes menos estables y altamente competitivos tienden a producir una mayor cantidad de defensas químicas (Hay & Fenical, 1996). Por ejemplo, Bakus & Kawaguachi (1984) demostraron que los organismos marinos tropicales tienen un potencial mayor como anti-incrustantes que el de especies de otras latitudes. Por otra parte, Nakatsu et al. (1983), al igual que McCaffrey & Endean (1985) observaron que organismos con superficies libres de epibiontes contienen una mayor cantidad de compuestos derivados del metabolismo secundario que organismos epifitados, lo que comprueba el papel ecológico de los metabolitos secundarios. Es por la importancia ecológica de estos organismos que se obtienen productos naturales que no solamente son anti-epífitos o anti-incrustantes, sino que también son valiosos para la elaboración de antibióticos, antitumorales, antivirales, insecticidas, sustancias citotóxicas y neurotóxicas (Donia & Hamann, 2003). En los últimos cuarenta años, el auge en las investigaciones sobre la química y actividad biológica se ha enfocado principalmente en los organismos 3

14 marinos, pues se ha determinado que estos contienen una gran cantidad y variedad de metabolitos secundarios con estructuras químicas diferentes a las encontradas en organismos terrestres y además con diferentes actividades biológicas (Blunt et al., 2009; Faulkner, 2000); lo que probablemente se debe a las condiciones físicas y químicas del mar. Un recurso marino de gran relevancia son las algas, quienes han tenido una participación muy importante en la química de productos naturales. Hoy en día se conocen casi 3,000 compuestos derivados del metabolismo secundario de algas marinas, que representa un 20% de los productos naturales marinos (Amsler, 2009), en donde se incluye una variedad de polisacáridos, fenoles bromados, esteroles, polifenoles y péptidos que tienen aplicaciones alimenticias e industriales, como alginatos, agar y carragenanos; o son de interés farmacológico por su potencial de aplicación como moduladores en la coagulación sanguínea, como el fucoidan; o presentan actividad anti-bacteriana, citotóxica y anticancerígena (Maschek & Baker, 2008; Muñoz-Ochoa, 2010). De estos compuestos, más de 1,100 se han extraído de las algas pardas, clase Phaeophyceae, incluyendo terpenos, florotaninos y pequeñas acetogeninas (Blunt et al., 2009). La mayor parte de los compuestos aislados de estas algas han sido diterpenos lineales como el crinitol; y principalmente fenoles y meroterpenos fenólicos derivados del floroglucinol, que son los metabolitos secundarios más abundantes en las algas pardas, se han reportado en casi todos los órdenes y pueden llegar a constituir hasta el 20% del peso seco del alga, además se ha 4

15 observado que actúan como defensa química contra la fijación de larvas de animales marinos y bacterias (Maschek & Baker, 2008). Dentro de las algas pardas, Macrocystis pyrifera se considera como la base del ecosistema de los bosques de kelps cuya productividad y valor ecológico son muy altos, ya que en estos hábitat pueden soportar hasta 270 diferentes especies. Se sabe que tiene actividad anti-microepífita porque también experimenta una gran variedad de condiciones ambientales que la hacen propensa al epifitismo a lo largo de sus extensas frondas que llegan a medir hasta 50m (Zimmerman & Kremer, 1986). 2. Antecedentes M. pyrifera ha sido un recurso marino sumamente explotado, pues tiene muchas aplicaciones industriales: se ha utilizado principalmente como fuente importante para la obtención de ficocoloides, especialmente de alginatos que son usados como agentes espesantes, gelificantes y estabilizantes; tiene una amplia gama de aplicaciones en diversas industrias como la alimenticia, cosmética, textil, papelera, cervecera y en medicina se emplea para obtener emulsiones, encapsulados, pastillas e impresiones dentales (Casas-Valdéz, 2001). Estados Unidos, México, Chile y Perú fueron los primeros en emplearla para la obtención de alginatos; en Argentina la utilizan como alimento; y en Australia la aprovechan en la agricultura. Mientras, otros países como Japón, 5

16 China, Francia o Reino Unido la importan para procesarla de distintas maneras (Zemke-White & Ohno, 1999). En México se empezó a cosechar esta alga desde 1958, y aunque tiene una distribución restringida solo a la parte norte de la Península de Baja California, que va de Isla Coronado a Isla San Martín, BC, México llegó a ser de los principales exportadores del recurso como materia prima (Zemke-White & Ohno, 1999). En la década de 1950 s, se determinó el primer caso de sobreexplotación en California, EU: con una cosecha anual de aproximadamente 100 mil toneladas en peso húmedo de M. pyrifera, se había mermado casi un 70% del recurso en solo 50 años (North, 1987). Al dañar todo un ecosistema altamente productivo y que además es hábitat para una amplia variedad de mamíferos, aves, peces, invertebrados y otras algas, surge una inquietud por mantener el recurso, ya que empezaron a haber pérdidas en otras actividades como la pesca, haciéndose evidente que era mayor el valor económico de los organismos que crecen en los bosques de M. pyrifera, al valor del alga cosechada. A partir de la década de 1960 s se iniciaron varios programas de investigación sobre M. pyrifera en California, más tarde en British Columbia, Chile y México. En México se establece hasta 1982 el programa Evaluación y Aprovechamiento de M. pyrifera por parte del Centro Interdisciplinario de Ciencias Marinas (CICIMAR), donde se determinó la composición química de proteína, fibra cruda, extracto etéreo, cenizas, carbohidratos e inclusive de humedad de acuerdo 6

17 a las condiciones ambientales, distribución y cambio estacional (Rodríguez- Montesinos & Hernández-Carmona, 1991; Serviere-Zaragoza et al., 2002). También se estudió la abundancia del alga en relación a la variabilidad climática, según la temperatura superficial del agua, nivel medio del mar e índice de surgencias. Del mismo modo, se le dio mucha importancia a los estudios relacionados con la sobrevivencia y reclutamiento de M. pyrifera (Hernández- Carmona et al., 2006) y el efecto que tiene sobre este proceso la disponibilidad de nutrientes (Hernández-Carmona et al., 2001). Con el fenómeno El Niño se evaluaron los efectos en la sobrevivencia de estadios microscópicos, en la sobrevivencia del kelp en aguas profundas (Ladah & Zertuche, 2004), en el reclutamiento (Ladah et al., 1999), y se abordaron técnicas de restauración del recurso en México (Hernández-Carmona et al., 2000). Además se realizaron investigaciones sobre el método de extracción de alginatos (Hernández-Carmona et al., 2002), y el uso de ellos en materiales de impresión dental (Reyes-Tisnado et al., 2004). En otros países, se enfocaron más a aspectos ecológicos (Graham et al., 2007), se estudiaron los procesos físicos, químicos y biológicos que regulaban la abundancia y distribución de M. pyrifera (Moreno & Sutherland, 1982; Plana et al., 2007); mecanismos de reclutamiento del kelp (Kinlan et al., 2003) y sus limitantes (Reed et al., 2004). Asimismo la influencia del medio ambiente (Barrales & Lobban, 1975) y del tipo de vida multifacética (Schiel & Foster, 2006) sobre la biología poblacional del alga así como en la estructura y organización de las comunidades de bosques de kelp. Y en menor medida, se ha puesto interés en 7

18 establecer la relación de M. pyrifera con otros géneros de laminariales desde un punto de vista evolutivo (Coyer et al, 2001). Pero poco se había estudiado sobre el potencial biomédico de sus metabolitos secundarios. Hasta mediados de la década de 1980 s se publicó por primera vez la actividad biológica de un extracto de M. pyrifera (Mayer & Panick, 1984; Mayer et al., 1986), donde el extracto crudo mostró tener actividad antitumoral, citotóxica, genotóxica y antiviral, y como se había observado actividad en el fucoidan de otras especies de algas pardas, las investigaciones subsecuentes se enfocaron en purificar el fucoidan, y observar si era el responsable de la actividad antitumoral o citotóxica (Mayer et al., 1987a), genotóxica (Larripa et al., 1987) y antiviral (Mayer et al., 1987b); además probaron la actividad biológica del alginato de sodio y laminaran. Debido a sus resultados negativos, concluyeron que la actividad biológica en M. pyrifera se debe a una compleja interacción de metales y polisacáridos, por lo que no se continuó con estudios más finos, y mucho menos con intenciones de aislar el compuesto activo, de modo que la explotación de este recurso continuó basándose en productos para la industria agroalimentaria, y el único interés biomédico fue en la impresión dental y en sus propiedades espesantes. Pero en la investigación de productos naturales es menester la constante producción de los mismos, ya sea evaluando nuevos organismos o empleando distintas metodologías. Por lo que M. pyrifera no deja de ser candidata para evaluar su potencial biológico. Por el contrario, algunas evidencias de otras algas 8

19 con actividad antibacteriana (Culioli et al., 2008; Etahiri et al., 2001; Ganti et al., 2006; Jennings & Steinberg, 1997; Plouguerné et al., 2008; Plouguerné et al., 2010) sostienen que es posible que M. pyrifera posea compuestos que inhiban las primeras etapas del micro-epifitismo, ya que se trata de especies con ecología similar. También han surgido nuevas metodologías en el estudio de la actividad anti-epífita, que son distintas a las de Mayer et al. (1987a) y Larripa et al. (1987), que podrían emplearse para reanudar nuevas investigaciones con M. pyrifera (Dhanasekaran et al., 2009; Feng et al., 2007; Hsu, 1982; Silkina et al., 2009). Durán-Riverol (2009) evaluando el protocolo de aislamiento guiado por bioensayo, observó entre otras algas, que M. pyrifera tiene actividad frente a bacterias patógenas; dicho estudio dejó asentada la actividad del alga contra Vibrio alginolyticus, V. campbellii, V. harveyi, V. parahaemolyticus, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Exiguobacterium sp. La autora obtuvo 10 fracciones cromatográficas de M. pyrifera, todas ellas con actividad biológica al menos contra una cepa bacteriana. Mientras, en la Universidad de Portsmouth en Reino Unido, en colaboración con el CICIMAR, Quesseveur (2009) evalúo el efecto de 79 extractos provenientes de 42 especies marinas colectadas en aguas del Pacífico mexicano sobre el crecimiento de bacterias marinas y terrestres comúnmente implicadas en las primeras etapas del proceso de colonización o asentamiento; entre las sustancias probadas, se encontró que el extracto de M. pyrifera y las diez fracciones 9

20 cromatográficas obtenidas del fraccionamiento realizado por Durán-Riverol (2009) presentaron actividad anti-epífita. Aunque el trabajo de Quesseveur (2009) es de los primeros en considerar a M. pyrifera como anti-incrustante, existen una gran cantidad de estudios que demuestran la actividad en otras algas, dentro de las algas pardas que presentan actividad contra algún tipo de microorganismo involucrado en el epifitismo, se encuentra el trabajo de Jennings & Steinberg (1997), quienes observan que la cantidad de florotaninos influye en la abundancia de los epífitos sobre el kelp Ecklonia radiata. Ganti y colaboradores (2006) aislaron y caracterizaron agentes anti-incrustantes en el alga Sargassum confusum. En el 2008, Culioli y colaboradores encontraron en Halidrys siliquosa productos derivados de los terpenos con actividad anti-incrustante; en el mismo año, Plouguerné et al. (2008) extraen sustancias activas contra el micro-epifitismo de las algas invasivas Grateloupia turuturu y Sargassum muticum. Plouguerné et al. (2010) encuentran ácido palmítico, linoleico y palmitoleico en Sargassum muticum, además de galactoglicerolípidos e hidrocarbonos que inhibieron el crecimiento de microalgas, bacterias y hongos implicados en el micro-epifitismo. 3. Distribución y descripción de Macrocystis pyrifera Macrocystis pyrifera (Figura 1) es un alga parda, pertenece al orden de las laminariales, se caracteriza por formar densos bosques submarinos que son el hogar de muchas especies marinas que dependen de las algas directamente para 10

21 la alimentación y la vivienda o indirectamente como un lugar de caza (Grant- Burges et al., 2003). Figura 1. Macrocystis pyrifera. Al norte, se distribuye sobre las costas del Pacífico de Norteamérica, México, EU y Alaska. Al sur tiene una distribución circunsubantártica desde Perú hasta Cabo de Hornos en América, Sudáfrica, Australia y Nueva Zelanda. 11

22 Debido a su fisiología muy variable e historia de vida, M. pyrifera ocupa una amplia variedad de ambientes. Habita en ambos hemisferios: se localiza principalmente a lo largo de las costas del Pacífico de Norteamérica, México, EU y Alaska. Al sur tiene una distribución circunsubantártica que va de Perú hasta Cabo de Hornos en América, Sudáfrica, Australia y Nueva Zelanda. En México, los mantos de M. pyrifera se localizan en la Península de Baja California, desde Islas Coronado (23 25 N; ) hasta Bahía Asunción (27 08 N; ). Aunque esta especie prospera en aguas frías, donde la temperatura del agua se mantiene por debajo de los 21 C, su distribución en altas latitudes parece estar limitada por el oleaje y la baja radiación solar; mientras que los límites que determinan su distribución en latitudes bajas parecen ser la poca disponibilidad de nutrientes en aguas cálidas donde no ocurren surgencias y/o la competencia con especies que son más termo-tolerantes (Grant-Burges et al., 2003). Dentro de estos límites, su distribución lateral corresponde a cambios abruptos en la batimetría y/o en la composición del sustrato; y su distribución superficial se ve influida por la desecación y radiación ultravioleta principalmente, aunque el oleaje, el pastoreo y la competencia con otras algas en las zonas más someras también puede ser importante. Así, se encuentra desde la zona intermareal hasta 30 m de profundidad (Grant-Burges et al., 2003). M. pyrifera puede llegar a medir hasta más de 50 m de longitud, dependiendo el ambiente donde se desarrolle. Su estructura (Figura 2) consiste en un rizoide perene mediante el cual se sujeta a un sustrato generalmente rocoso; 12

23 de este rizoide se desprenden varias ramificaciones llamadas estipes, a lo largo de estos se encuentran los neumatocistos que son pequeñas vesículas llenas de aire que le sirven como flotadores; a partir de estas estructuras crecen las láminas o filoides, los cuales miden alrededor de medio metro de largo, y todo esto compone una fronda. Las frondas son efímeras con una vida media de aproximadamente 6 meses. Las frondas jóvenes crecen hasta la superficie, con nuevas láminas formadas a intervalos regulares; una vez que la fronda alcanza la superficie, el crecimiento continúa por un corto tiempo formando doseles en la superficie del mar, luego cesa la formación de nuevas láminas y finalmente llega a la senescencia. Esta alga tiene una gran importancia ecológica en los lugares donde habita: por su gran tamaño y densidad altera de manera significativa la disponibilidad de la luz, el flujo de las corrientes oceánicas y la química de las aguas del océano en la zona donde crecen. Su presencia es crucial para mantener la organización y diversidad de comunidades ecológicas, por ello es considerada una especie clave que puede albergar y dar protección a una gran diversidad de organismos, incluyendo algas, peces, moluscos, entre otros. Además se ha determinado que M. pyrifera posee un elevado contenido de aminoácidos esenciales y ácidos grasos, y la calidad de sus proteínas y lípidos lo hace comparable con las de otras fuentes vegetales (Grant-Burges et al., 2003). 13

24 4. Justificación Existe desde hace mucho tiempo un esfuerzo por evitar el biofouling o epibiosis, es decir, el asentamiento de organismos sobre superficies y estructuras creadas por el hombre; en un inicio se comenzaron a añadir compuestos tóxicos como mercurio, plomo, arsénico y cloro en los revestimientos de barcos y estanques que fueron sustituidos en su mayoría por el tributilo de estaño (TBT) a principios de 1950 s, porque tenía un menor impacto ecológico mientras retrasaban el desarrollo de organismos adheridos a sus superficies; así las pinturas adicionadas con TBT permitieron el ahorro en combustible y mantenimiento, ya que permitieron intervalos entre operaciones de repintado más largos (Barreiro et al., 2004). No obstante, seguían causando daños a la biota marina, desde alteraciones bioquímicas hasta extinciones a escala local; se acumulaban en los sedimentos durante años y finalmente su uso se restringió en el 2008; el sustituto del TBT en las pinturas fue el cobre, que siguió ocasionando problemas ambientales (Fent, 1996); por lo que se optó por el empleo de otras tecnologías como limpiadores de agua a presión, antifouling por ultrasonido o vibraciones, y la limpieza criogénica que consiste en pequeños cristales de hielo seco (Fondear, 2011), sin embargo, estas tecnologías terminan teniendo costos elevados y aplicados en la acuacultura resultaría poco práctico porque se requiere un continuo mantenimiento. De modo que una alternativa que ofrece eficacia y respeto con el medio ambiente además de bajo costo es la implementación de anti-incrustantes naturales en las pinturas, tal como extractos de algas marinas. 14

25 Ya varios autores han incorporado estos productos en pinturas y otros revestimientos; aunque hace falta definir la química de los extractos utilizados (Grant-Burges et al., 2003). Por consiguiente es necesario continuar con el aislamiento e identificación de los principios activos, que si bien, representan un desafío académico, también representan el más exitoso acercamiento al descubrimiento de nuevas moléculas para el beneficio de la humanidad (Lock, 2011). 5. Objetivo Identificar metabolitos presentes en el extracto etanólico de Macrocystis pyrifera que inhiban el crecimiento de organismos involucrados en el microepifitismo sobre estructuras sumergidas en cuerpos de agua dulce y/o marina. 6. Metodología 6.1 Zona de estudio y colecta de Macrocystis pyrifera. El material algal fue recolectado en aguas superficiales en Punta Eugenia, Municipio de Mulegé, Baja California Sur (Figura 2) en agosto de El material algal recolectado fue identificado in situ como M. pyrifera por el Dr. Rafael Riosmena Rodríguez del Laboratorio de Botánica Marina de la Universidad Autónoma de Baja California Sur. 15

26 Figura 2. Punta Eugenia, BCS. Sitio de colecta de M. pyrifera (mapa de Durán-Riveron, 2009). 6.2 Obtención del extracto etanólico. Después de lavar y eliminar los epífitos conspicuos y ser secado al sol, se realizó el extracto crudo con etanol destilado (EtOHd) en las instalaciones del CICIMAR. Se obtuvo el extracto etanólico a partir de la maceración de 5.6 kg de M. pyrifera con 8 L de EtOHd en una primera extracción, y con 7 L del disolvente 16

27 recuperado en una segunda extracción. Después de filtrar el sobrenadante y concentrar a sequedad con rotavapor a presiones bajas y temperaturas de 40 C, resultaron g de extracto etanólico. 6.3 Fraccionamiento inicial del extracto etanólico Del extracto obtenido, mediante filtración simple sobre papel, se obtuvo 29 g de una porción de sales insolubles en EtOHd y 277 g de extracto orgánico libre de sales; este último sirvió para obtener tres fracciones: fase orgánica, emulsión y fase acuosa. Por la actividad que presentó contra Vibrio campbellii y V. parahaemolyticus, en el trabajo descrito por Durán-Riverol (2009), la fase orgánica se sometió a extracción en fase sólida utilizando diclorometano (CH 2 Cl 2 ) y EtOHd como disolventes en mezclas con creciente polaridad, obteniendo 5 fracciones ( EFS2 F n ); de las cuales la fracción de baja polaridad EFS2 F1, se seleccionó para ser fraccionada en búsqueda de principios activos. A partir de un tercer fraccionamiento, se obtuvieron 10 fracciones ( CC2 F n ) según la polaridad. Una parte de estas fracciones se conservaron en el CICIMAR, y se evaluó su actividad antibacteriana. Otra parte de las fracciones se enviaron a la Universidad de Portsmouth para su evaluación anti-incrustante contra bacterias y microalgas. 17

28 6.4 Evaluación de la actividad antibacteriana y anti-incrustante Se determinó la actividad antibacteriana por el método de difusión en agar con disco en un medio sólido, descrito y realizado por Durán-Riverol (2009). La actividad anti-incrustante se evaluó mediante la técnica microdilución en placas, realizada por Quesseveur (2009) Ensayo de difusión en agar con discos Los microorganismos probados mediante este ensayo fueron Vibrio alginolyticus (X56576), V. campbellii (ATCC 25920), V. harveyi (ATCC 14126), V. parahaemolyticus (ATCC 17802), Staphylococcus aureus (ATCC BAA-42), Bacillus subtilis (ATCC 6051), Escherichia coli (ATCC BAA-196), obtenidas de la American Type Culture Collection: Exiguobacterium sp. fue aislada de Artemia sp. por Carmona-Pérez (2006). Todas las cepas fueron preservadas a -70 C con 50% de glicerol hasta el momento de reactivarse. Para reactivar las cepas, fueron sembradas en agar marino [1 g de extracto de levadura (DIFCO), 5 g de peptona de carne (DIFCO), 15 g de Bacto agar (DIFCO) en 1 L de agua de mar artificial (Coral Reef)] y sembradas en agar infusión cerebro-corazón (BHI) (DIFCO) y agar tripticaseina-soya (TSA) (DIFCO) respectivamente las bacterias marinas y no marinas. Posteriormente se incubaron durante 24 h. Una vez transcurrido el período de incubación, se sembraron en 18

29 tubos de agar inclinado (dos tubos de trabajo y uno de reserva) en agar marino. Se incubaron nuevamente durante 24 h y posteriormente fueron almacenados a 11 C. Para la preparación de inóculos, se sembraron cultivos masivos en agar; se utilizó agar marino para las bacterias marinas y agar infusión cerebro-corazón (BHI) (DIFCO) y agar tripticaseina-soya (TSA) (DIFCO) para las bacterias no marinas, y se incubaron durante 24 h. Una vez obtenida suficiente biomasa bacteriana de cada especie, se tomó una parte de ella con un hisopo estéril y se suspendió en solución salina estéril (2.5% NaCl para bacterias marinas, y 0.85% para bacterias no marinas), hasta obtener una densidad óptica de aproximadamente 1.00 UA, a una longitud de onda 585 nm. Con cada especie bacteriana se inocularon masivamente placas de agar Muller-Hinton (Merck ) (2.5% NaCl), sobre las cuales se colocaron los sensidiscos con los extractos de prueba y los controles positivos y negativos. Estas placas se dejaron a temperatura ambiente (24ºC aproximadamente) por 1.5 h para permitir la difusión del compuesto en el agar y posteriormente se incubaron a 30 C por 24 h. El efecto sobre las bacterias fue registrado como negativo cuando no se observó inhibición del crecimiento y en los casos positivos, las zonas de inhibición alrededor de cada disco fueron medidas en mm. Para los sensidiscos, se emplearon discos de papel filtro Whatman No. 4, de 8 mm, esterilizados en autoclave, se impregnaron con aproximadamente 2 mg de los extracto/fracción/compuesto a probar, diluidos en los disolventes 19

30 apropiados. La preparación se llevó a cabo en campana de flujo laminar desinfectada con benzal, sobre papel aluminio lavado con etanol, para asegurar la esterilidad. En esas condiciones los discos se dejaron evaporar y se almacenaron, a -18 C por un período no mayor a 48 h. De igual manera se prepararon controles negativos con los disolventes puros utilizados y controles positivos con el antibiótico comercial Terramicina (oxitetraciclina), cápuslas de 500mg Pfizer Ensayo de microdilución en placa En este ensayo, fueron evaluadas tres bacterias marinas: Polaribacter irgensii (ATCC ), Pseudoalteromonas elyakovii (ATCC ) y Vibrio aestuarianus (ATCC 35048); tres bacterias terrestres: Escherichia coli (ATCC 23176), Enterobacter aerogenes (ATCC 13048) y Staphylococcus aureus (ATCC 25923); y tres microalgas de agua dulce: Fragilaria crotonensis, Cosmarium sp. y Scenedesmus armatus, todas ellas obtenidas de la colección de la Universidad de Portsmout. La actividad de cada extracto se probó a cinco diferentes concentraciones (0.1, 1, 10, 25 y 50 g/ml) con el fin de evaluar la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM). Las concentraciones se obtuvieron siguiendo un protocolo de dilución en serie: la primera concentración de 1 mg/ml; consecuentes fueron de 100 y 10 g/ml; de 100 g/ml se obtuvieron concentraciones de 25 y 50 g/ml y de 10 g/ml se obtuvieron las concentraciones de 0.1, 1 y 10 g/ml. Así, se 20

31 evaluó la CIM por el método de dilución utilizando placas para microdilución de 96 celdas. Para los ensayos de actividad anti-bacteriana, se utilizó el medio de cultivo para bacterias marinas que se preparó con 5 g de peptona diluida en 1 L de agua de mar filtrada y estéril (10 m, Whatman); y para bacterias terrestres, el medio que se utilizó estaba compuesto de un caldo nutritivo CM 0067 No. 2 de 25 g/ml (Oxoid). Las bacterias se incubaron durante 5 días a 30 C para determinar la densidad bacteriana por espectrometría con el método de Amsterdam (1996); todos los medios de cultivo se inocularon con la misma cantidad de bacterias de cada cepa y se dejaron incubar a temperatura constante de 30 C. Para los ensayos de actividad anti-microalgal, se elaboró un medio de cultivo compuesto de macronutrientes WC (calcio, sodio, magnesio, potasio, carbonato y fosfato), micronutrientes y vitaminas disueltas en agua destilada estéril. Por su parte se dejaron incubar las microalgas en una cámara de incubación a 25 C, con iluminación constante durante 3 semanas; para inocular los medios de cultivo con una misma concentración, se midió la concentración de clorofila a mediante métodos espectrofotométricos y la ecuación de Strickland y Parson (1968); se dejaron incubar durante 2 semanas a 30 C. Para probar cada extracto se realizaron 6 réplicas de cada una de las concentraciones obtenidas además de los dos controles, uno sin extracto y otro con metanol para probar el efecto del disolvente; de modo que por cepa hubo 42 ensayos (7 x 6). Así se comparó la turbidez de los tubos control con los del 21

32 extracto para evaluar la actividad anti-bacteriana y anti-microalgal, y dependiendo el número de réplicas activas, el criterio para calificar la actividad fue de la siguiente manera: 0 a 2 de las 6 réplicas = sin actividad 3 ó 4 de las 6 réplicas = - (inhibidora) ó (activadora) + 5 ó 6 de las 6 réplicas = - - (inhibidora) ó (activadora) Fraccionamiento de CC2F3 La fracción de baja polaridad CC2F3 se obtuvo en el tercer fraccionamiento de M. pyrifera, a partir de EFS2 F1 derivada de la fase orgánica (Anexo I); y se eligió para continuar su fraccionamiento por la actividad que mostró frente a Vibrio alginolyticus, V. campbellii, V. parahaemolyticus y Staphylococcus aureus; por el rendimiento (0.767 mg) y por su apariencia aceitosa. Primero se determinó la solubilidad de la fracción en CH 2 Cl 2 utilizando aproximadamente 1 mg de la muestra; luego se estableció el patrón de fraccionamiento de la muestra en cromatografía en placas (TLC) y se fraccionó por cromatografía en columna sobre sílica (60ª mesh ASTM) con una relación muestra adsorbente de 1:100 (76.7 mg de muestra); la elución fue realizada con hexano:diclorometano (Hex:CH 2 Cl 2 ) con una relación (5:5); y continuó con un gradiente de polaridad de diclorometano:metanol (CH 2 Cl 2 :MeOH) iniciando (CH 2 Cl 2 100%), (98:2), (95:5), (9:1) (8:2) (7:3) y se lavó con MeOH (100%). 22

33 Simultáneamente se realizó una cromatografía en capa fina, y se determinaron 8 fracciones que fueron sometidas a la prueba de actividad contra la bacteria Staphylococcus aureus (como se describe en la sección 6.4.1). Se decidió hacer la prueba únicamente para las fracciones de mediana polaridad: CC3 F3, CC3 F4, CC3 F6 y CC3 F7, tomando como criterio el perfil cromatográfico, la apariencia y el rendimiento de la fracción. Se continuó con el fraccionamiento de CC3F4 por ser la fracción más activa, esta vez la relación muestra-adsorbente fue de 1:200 (con 9.4 mg de muestra). La elusión fue realizada con CH 2 Cl 2 100% y continuó con un gradiente de polaridad CH 2 Cl 2 :MeOH (98:2), (95:5), (9:1) y (8:2). Mediante cromatografía en capa fina se determinaron 4 fracciones: CC4 F1, CC4 F2, CC4 F3 y CC4 F4. Se evaluó la actividad de CC4F2 y CC4F3 contra Vibrio parahaemolyticus como se describe en la sección 6.4.1, las cuales resultaron ser muy parecidas en cromatografía de capa fina. El proceso de fraccionamiento a partir de CC2F3 se desglosa en la Figura Identificación estructural del compuesto activo Este análisis se realizó por espectroscopia de infrarrojo (IR); las fracciones analizadas fueron CC4 F2 y CC4 F3. El espectro (IR) se obtuvo en las instalaciones del laboratorio de Farmacognosia Marina en la Universidad Autónoma de Baja California Sur con un espectrómetro Paragon 500 FT-IR en forma de película sobre pastilla de Bromuro de potasio con dominio del tiempo por 23

34 transformada de fourier. Y la estructura molecular se determinó comparando el IR contra tablas de frecuencias de absorción para determinados grupos funcionales CC2 F mg CC3 Si-gel fase normal Relación muestra:sílica 1:100 CH 2 Cl 2 100%; CH 2 Cl 2 :MeOH (98:2, 95:5, 9:1, 8:2, 7:3) F mg F mg F mg S. aureus F4 9.4 mg S. aureus F mg F mg S. aureus F mg S. aureus *8.3 mm *13.1 mm *12.6 mm *9.1 mm F mg CC4 Si-gel fase normal Relación muestra:sílica 1:200 CH 2 Cl 2 100%; CH 2 Cl 2 :MeOH (98:2, 95:5, 9:1, 8:2) F1 3.2 mg F mg V. parahaemolyticus *11.6 mm F mg V. parahaemolyticus *11.5 mm F4 3.5 mg IR: Ácidos grasos Figura 3. Fraccionamiento guiado por bioensayo de la fracción de baja polaridad CC2 F3 derivada de la fase orgánica del extracto de M. pyrifera. 24

35 7 Resultados 7.1 Actividad biológica Se determinó que M. pyrifera es un alga capaz de sintetizar varios compuestos activos contra organismos marinos, terrestres y dulceacuícolas, tanto bacterias Gram-positivas como Gram-negativas. Si se analizan las Tablas, se observa que en general las fracciones fueron más activas contra organismos marinos, y no se observó que exista una especificidad de acción de las sustancias de acuerdo a la naturaleza de la cepa bacteriana por ser Gram-positiva o Gramnegativa. Aunque sí se observó que diferentes fracciones tuvieron diferente actividad sobre cada microorganismo. La fase orgánica del extracto etanólico de M. pyrifera inhibió el crecimiento de las bacterias Vibrio campbelili, V. parahaemolyticus, Poliaribacter irgensii, V. aestuarianus y Pseudoalteromonas elyakovii; y promovió el crecimiento de las microalgas Fragilaria crotonensis y Scenedesmus armatus. El extracto etanólico (06-019) no fue activo contra ninguna bacteria terrestre, sin embargo, varias fracciones del extracto etanólico de M. pyrifera inhibieron a Enterobacter aerogenes y Staphylococcus aureus. En la Tabla I vemos que las fracciones CC2F6 y CC2F9 fueron activas contra E. aerogenes, y en la Tabla III se observan las fracciones CC2F1, CC2F5, CC2F7, CC2F8, CC2F9 y CC2F10 que inhibieron a S. aureus. Por su parte, las fracciones CC2F3, CC2F9 y CC2F10 promovieron el crecimiento de 25

36 Cosmarium sp. a pesar de que no se determinó actividad en esta cepa por parte del extracto etanólico (Tabla II). Escherichia coli fue la única bacteria que mostró resistencia tanto al extracto como a las fracciones de M. pyrifera (Tabla III). En la Tabla III se puede observar que el extracto etanólico de M. pyrifera promovió el crecimiento algal de Scenedesmus armatus a distintas concentraciones, y las fracciones CC2F2, CC2F3 y CC2F10, contrariamente, inhibieron su crecimiento a concentraciones de 10 y 25 g/ml. Con respecto a la fracción CC2F3, en la Tabla I se muestra la actividad contra V. aestuarianus, en la Tabla III se muestra la actividad contra las bacterias Vibrio parahaemolyticus, V. campbellii, V. alginolyticus, Exiguobacterium y Staphylococcus aureus mediante el ensayo de difusión en agar por disco. Sin embargo, en la Tabla I, con el método de dilución en microplacas, no presenta actividad contra S. aureus. En la Tabla II se muestra que inhibe el crecimiento de la microalga Scenedesmus armatus, pero tiene un efecto positivo sobre el crecimiento de Fragilaria crotonensis y Cosmarium sp. A partir del fraccionamiento de CC2F3, se obtuvieron 8 fracciones ( CC3Fn 1-8 ). Y solamente se evaluó la actividad contra Staphylococcus aureus de cuatro de estas fracciones, las cuales presentaron distinta intensidad inhibitoria, lo que se muestra en la Tabla III. Donde también se observa cómo en CC3F4 y CC3F6 la actividad se incrementó en comparación con la fracción CC2F3, y sin embargo, disminuye con la fracción CC3F3. 26

37 Se obtuvieron cuatro fracciones a partir de CC3F4 (fracción más activa contra S. aureus). Dos de estas fracciones ( CC4F2 y CC4F3) inhibieron el crecimiento de V. parahaemolyticus, con un halo de inhibición de 11.5 mm. No se evaluó la actividad de las fracciones CC4 F1 y CC4 F4 porque en el caso de la primera fracción, la TLC no mostró que hubiera un compuesto evidente; y la segunda fracción mostró ser una mezcla muy compleja, y con poco rendimiento. Tabla I. Actividad anti-incrustante de M. pyrifera, método de microdilución en placa. Bacterias terrestres E. coli Fracción de M. pyrifera Concentración mínima inhibitoria g/ml E. aerogenes CC2F CC2F CC2F CC2F5 25 S. aureus CC2F CC2F CC2F CC2F Bacterias marinas P. irgensii P. elyakovii CC2F CC2F CC2F CC2F4 1 V. aestuarianus CC2F CC2F CC2F CC2F CC2F CC2F

38 Tabla II. Efecto de M. pyrifera sobre el crecimiento microalgal, método de microdilución en placa. Nota:Un signo (+) significa que promueve el crecimiento, un signo (-) significa que lo inhibe; y el número de signos refiere al número de réplicas que fueron promotoras o inhibidoras; un signo equivale a 3 ó 4 réplicas activas y dos signos equivale a 5 ó 6 réplicas. Microalgas Fracción de M. pyrifera Concentración activa Efecto sobre el g/ ml crecimiento CC2F CC2F CC2F CC2F F. crotonensis CC2F CC2F CC2F CC2F CC2F CC2F Cosmarium sp CC2F S. armatus

39 CC2F CC2F CC2F Tabla III. Actividad antibacteriana de M. pyrifera, método de difusión en agar. Nota: El número es el diámetro promedio del halo de inhibición expresado en mm. NA significa que no se observó actividad; el signo (-) significa que no se evaluó la actividad de las fracciones para la cepa bacteriana. Fracción S. aureus V. para V. algino Exiguobact E. coli V. campb CC2F NA CC2F NA CC2F NA CC2F NA CC2F NA 10.5 NA CC2F NA NA 12 NA NA CC2F NA CC2F NA CC2F NA CC2F NA NA 13 NA NA CC3F CC3F CC3F CC3F CC4F CC4F

40 Después de las pruebas bacterianas se obtuvo el espectro en infrarrojo (IR) de CC4 F2 y CC4 F3, las cuales presentaron mucha similitud en la TLC, y aunque ambas eran aún mezclas, la cantidad de muestra no permitía continuar con el fraccionamiento y los ensayos de actividad biológica. 7.2 Caracterización estructural De las señales observadas en el espectro de infrarrojo (IR) se distinguen cuatro bandas de absorción principales en la zona general del espectro: la primera se encuentra a 3432 m -1, que corresponde a la tensión de grupos OH. Dos señales más se observan a 2930 m -1 y 2850 m -1 : la primera señal, 2930 m -1, indica el estiramiento asimétrico de enlaces C-H en los alcanos (CH 3 ), y la señal 2850 m - 1 indica estiramientos simétricos en los enlaces del grupo metilo (Silverstein et al., 2005). También se identificó una absorción en 1713 m -1, la cual puede atribuirse a carbonilos en general, a esteres o ácidos carboxílicos (Silverstein et al., 2005). En la zona denominada huella dactilar, aparecen, las señales 1244 m -1 y 1176 m -1, las cuales indican la presencia ya sea de alcanos, alcoholes, esteres, eteres y/o ácidos carboxílicos (Silverstein et al., 2005). 30

41 Figura 4. Espectro infrarrojo de la fracción CC3F2. Se observan cuatro señales principales en la zona general del espectro y pequeñas señales en la zona de la huella dactilar, entre 600m -1 y 1400m -1. Estas evidencias aunadas a la apariencia y baja polaridad de la fracción, sugieren que se trata de algún derivado de ácido graso. 8 Discusión Aunque ya se había reportado en el alga parda M. pyrifera actividad citotóxica, antiviral, antitumoral (Mayer & Panick, 1984), antibacteriana (Durán- Riverol, 2009) y anti-incrustante (Quesseveur, 2009), este estudio es de los primeros en tratar de aislar y averiguar el tipo de compuesto específico que inhibe 31

42 el crecimiento de dos bacterias: la bacteria terrestre (Gram-positiva) Staphylococcus aureus y la bacteria marina (Gram-negativa) Vibrio parahaemolyticus, ambas involucradas en el micro-epifitismo y en infecciones graves en humanos. En el trabajo precedente, Durán-Riverol (2009) dejó comprobada la existencia de compuestos en M. pyrifera que inhiben el crecimiento de varias cepas bacterianas, tanto Gram-positivas como Gram-negativas: S. aureus, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, Exiguobacterium y V. campbellii. Los halos de inhibición fueron relativamente iguales para las bacterias, por lo tanto no existe una especificidad de acción evidente en relación a la naturaleza de la cepa bacteriana Gram-positiva y Gram-negativa. Por su parte, Quesseveur (2009), indica que M. pyrifera posee compuestos que inhiben el desarrollo de bacterias marinas y terrestres y puede ser promotora y/o inhibidora del crecimiento microalgal. En dicho estudio, las bacterias marinas mostraron más sensibilidad a más fracciones de M. pyrifera y a concentraciones más bajas que las bacterias terrestres, lo cual parece razonable porque pertenecen al mismo ecosistema. La actividad biológica que presenta el extracto etanólico y las fracciones de M. pyrifera es diferencial sobre cada microorganismo; así se observan fracciones que inhiben el crecimiento de más de una cepa y microorganismos que son sensibles a varias fracciones diferentes. Esto se debe a que por el proceso de purificación de compuestos activos mediante el protocolo de aislamiento guiado por bioensayo, las sustancias activas se van separando y concentrando en ciertas 32

43 fracciones, y es por eso que algunas fracciones inhibieron el crecimiento de microorganismos que el extracto crudo de M. pyrifera no inhibió, ya que en 2 g/ml de extracto crudo existe el principio activo en menor porcentaje que en las fracciones; por eso también el diámetro del halo de inhibición contra S. aureus es mayor en ciertas fracciones que en el resto, incluyendo la fracción de procedencia. Esto podría representar un problema porque empleando un método no muy sensible, y utilizando bajas concentraciones del principio activo, puede pasar por desapercibida la actividad en el extracto. Otro efecto que se observa por la concentración de la sustancia activa es con las microalgas, específicamente con Scenedesmus armatus, ya que su crecimiento se vio promovido por el extracto crudo y sin embargo, inhibido por tres de sus fracciones. Lo que estimula el crecimiento de la microalga es la alta concentración de auxina y citocinina en M. pyrifera (Stirk et al., 2004), que son hormonas reguladoras del crecimiento vegetal, y al momento de fraccionar, los compuestos con actividad inhibitoria se concentran (Bhakuni & Rawat, 2005). Así como puede surgir una fracción activa contra una cepa que no haya sido sensible al extracto crudo por cuestiones de concentración, puede que en el fraccionamiento ninguna de las fracciones obtenidas presente la actividad del extracto sobre alguna bacteria, como Poliaribacter irgensii y Pseudoalteromonas elyakovii; entonces se puede decir que se pierde la actividad porque los principios activos tienen grupos funcionales reactivos que al reaccionar originan subproductos inactivos, o porque la actividad biológica se debe precisamente a la 33

44 sinergia entre los componentes de la mezcla, entonces al separarla, los compuestos individuales no son activos (Bhakuni & Rawat, 2005). Se obtuvo el espectro infrarrojo de CC4F2 y CC4F3 aunque no eran compuestos puros, sin embargo el bajo rendimiento de la muestra no permitía continuar con los fraccionamientos, y el espectro mostró varias señales con las que se infiere que es un ácido graso. Se sabe que los ácidos grasos en los seres vivos vienen en pares de carbonos y los más comunes van de los carbonos, y mientras más larga la cadena es menor la solubilidad y más sólido el compuesto. En el trabajo de Rosell & Srivastava (1987), donde queda establecida la actividad antibacteriana de ácidos grasos de algas pardas, se identificaron en su mayoría ácidos grasos mono y poli-insaturados de 18 y 20 carbonos, que además de ser los más abundantes eran los que tenían mayor actividad. Entonces, basándonos en las señales del IR, concluimos que se trata de ácidos grasos, y tomando en cuenta las observaciones de Rosel & Srivastava (1987), determinamos que probablemente se trata de un compuesto de cadena hidrocarbonada entre carbonos, porque las fracciones tenían una apariencia aceitosa y eran de olor agradable. Determinando así que a partir de una serie de fraccionamientos de CC2F3 (fracción poco polar derivada de la fase orgánica de M. pyrifera) se obtienen ácidos grasos que presentan actividad contra Vibrio parahaemolyticus y Staphylococcus aureus. 34

45 La mayoría de los estudios que reportan actividad anti-incrustante en algas pardas se enfocan en la bioactividad de los florotaninos, sin embargo, se han aislado otros compuestos anti-incrustantes de Phaeophyceae (Plouguerné et al., 2010), como terpenos de algunas especies de Dictyota (Schmitt et al., 1995; Barbosa et al., 2007). En este trabajo se encontraron ácidos grasos con actividad antibacteriana, lo cual no es nuevo en algas pardas; Rosell & Srivastava (1987) demostraron la importancia de los ácidos grasos como anti-incrustantes con ácidos grasos insaturados derivados de Desmaresteia ligulata, al igual, Katsuoka & colaboradores (1990) aislaron galactosil y sulfoquinovosil-diacilgliceroles de las algas Costaria costata y Undaria pinnatifida, que exhibieron actividad antimacroepífita contra el bivalvo Mytilus edulis. Y en investigaciones más recientes, Ganti & colaboradores (2006), demostraron la actividad anti-incrustante de los derivados de ácidos grasos y ácido ftálico en el alga parda Sargassum confusum. Plouguerné et al. (2010), aislaron compuestos identificados como ácidos grasos y galactoglicerolípidos que exhibieron actividad anti-incrustante en Sargassum muticum, así como hidrocarburos saturados y poli-insaturados con interesante actividad antibacteriana, antifúngica y anti-microalgal. Dichos estudios recalcan el rol que tienen los ácidos grasos en la ecología de las algas; porque en realidad se consideran productos del metabolismo primario, y que tienen funciones esenciales en los seres vivos: su función principal en las algas es la reserva de energías y brindar soporte a las paredes celulares formando parte de la estructura de fosfolípidos y gucolípidos en las membranas 35

46 biológicas; aunque también hay derivados de ácidos grasos que actúan como hormonas o mensajeros intracelulares, y algunos ácidos grasos dirigen a las proteínas hacia posiciones en las membranas (Stryer, 1995). Sin embargo, ahora destaca su papel en la ecología del alga, ya que se ha demostrado que es mayor la actividad biológica de los ácidos grasos que la de los mismos florotaninos (Deal et al., 2003). La función ecológica de los ácidos grasos en M. pyrifera puede explicarse considerando precisamente la ecología del alga. M. pyrifera es parte de un ecosistema muy complejo, que son los bosques de kelps; debido al gran tamaño de las algas y a su densidad poblacional, las condiciones fisicoquímicas de las aguas en la zona donde crecen estas algas, se alteran de manera significativa, como la disponibilidad de luz, la concentración de nutrientes y el flujo de la corriente. Al disminuir considerablemente el flujo de la corriente, M. pyrifera es más propensa al epifitismo porque es aprovechada como sustrato y refugio para organismos bentónicos y como alimento para toda una comunidad (Zimmerman & Kremer, 1986). También la competencia por espacio y por recursos obliga a M. pyrifera a biosintetizar metabolitos que funcionen como defensa ante la colonización de organismos incrustantes y/o para conferir una ventaja competitiva en poblaciones muy densas (Grant-Burges et al., 2003). Estas sustancias o metabolitos con capacidad anti-incrustante pueden aislarse para generar alternativas a los biocidas tóxicos que se utilizan como anti-incrustantes en las pinturas y revestimientos de estructuras navales y de acuacultura para el control y 36

47 prevención del biofouling con tecnologías que respeten al medio ambiente (Grant- Burges et al., 2003). Así ya se ha reportado un gran número de compuestos antiincrustantes que provienen de organismos marinos, desde corales, moluscos, equinodermos, piel de ballena o tiburón y algas, cuya aplicación en pinturas y revestimientos han tenido resultados positivos, sin embargo hace falta determinar la estructura de los compuestos activos, pues es el siguiente paso a la síntesis de moléculas activas en laboratorios (Bhosale et al., 2002; Scardino & de Nys, 2010). 9. Conclusiones El alga parda Macrocystis pyrifera posee actividad antibacteriana y antiincrustante; también puede inhibir y/o promover el crecimiento microalgal. Macrocystis pyrifera es capaz de sintetizar varios compuestos activos contra organismos marinos, terrestres y dulceacuícolas; e inhibe por igual a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Macrocystis pyrifera posee ácidos grasos en fracciones de baja polaridad, que inhiben el crecimiento de Vibrio parahaemolyticus, bacteria implicada en el microepifitismo. 37

48 10. Literatura citada Amsler, ChD (2009) Algal Chemical Ecology. Springer. USA. 311pp. Bakus, GJ & M Kawaguachi (1984) Toxins from marine organisms: Studies on antifouling, EN: Bakus, GJ, NM Targett & B Schulte (1986) Chemical ecology of marine organisms: an overview. Journal of Chemical Ecology. 12(5): Bakus, GJ, NM Targett & B Schulte (1986) Chemical ecology of marine organisms: an overview. Journal of Chemical Ecology. 12(5): Barbosa JP, BG Fleury, BA Da Gama, VL Teixeira & RC Pereira (2007) Natural products as antifoulants in the Brazilian brown alga Dictyota pfaffii (Phaeophyta, Dictyotales). Biochemical Systematics and Ecology. 35: Barrales, HL & ChS Lobban (1975) The comparative ecology of Macrocystis pyrifera, with emphasis on the forest of Chubut, Argentina. The Journal of Ecology. 62(2): Barreiro, R, M Quintela & JM Ruiz (2004) TBT e imposex en Galicia: Los efectos de un disruptor endocrino en poblaciones de gasterópodos marinos. Ecosistemas. 13(003):1-17. Bhakuni, DS & DS Rawat (2005) Bioactive Marine Natural Products. Springer. New Delhi, India. 400pp. 38

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59 11. Anexos Anexo 1. Inhibición del crecimiento de S. aureus con las fracciones CC3 F3, CC3 F4, CC3 F6 y CC3 F7. Anexo 2. Inhibición del crecimiento de V. parahaemolyticus de las fracciones CC4 F2 y CC4 F3. 49