Análisis laboratorial dentro de los programas de prevención de la mamitis y la mejora de la calidad de la leche.

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2 Análisis laboratorial dentro de los programas de prevención de la mamitis y la mejora de la calidad de la leche. Nueva estrategía de diagnóstico por PCR: Ventajas del diagnóstico de mamitis por PCR a tiempo real frente al cultivo bacteriano A. Jubert 1 y M. Lázaro 2. 1Director Técnico del Laboratorio Interprofesional Lechero de Cataluña (ALLIC). 2Responsable del Departamento de Diagnostico Veterinario del Laboratorio Interprofesional Lechero de Cataluña (ALLIC). INTRODUCCIÓN La implantación de los Programas de Prevención de la mamitis y la Mejora de la calidad de la leche por parte de los veterinarios son de vital importancia para mejorar la rentabilidad de las explotaciones, el bienestar animal y poder dar mejores garantías de que los alimentos se están produciendo de una forma segura y sostenible (Pamela Ruegg, 2011). La mamitis o inflamación de la glándula mamaria, principalmente producida por bacterias, reduce la producción de leche, aumenta la cantidad de leche descartada y aumenta el sacrificio prematuro, así como los costes de producción (Fetrow, J. 2000). Además, se ha demostrado que la mamitis clínica como la subclínica reducen la eficiencia reproductiva (Barker et al., 1998, Santos et al., 2004, y Schrick, 2001). Las leches mamíticas también son un problema para la industria láctea ya que se deteriora la calidad de la leche pudiendo afectar sobre todo la producción de quesos, yogures y demás derivados lácteos. Para controlar la mamitis, es importante establecer un programa de control mediante la prevención de nuevas infecciones y la eliminación de las infecciones existentes. En esta línea, el departamento de diagnóstico veterinario del Laboratorio Interprofesional Lechero de Cataluña ha desarrollado una nueva estrategia de análisis para la detección e identificación del agente causal de la mamitis por métodos moleculares: diagnóstico de mamitis por PCR a tiempo real: técnica altamente sensible, especifica, rápida y versátil. Para demostrar internamente la validez de la técnica, se realizó un estudio comparativo con muestras de leche de vaca de tanque procedentes de explotaciones lecheras de Cataluña, mediante el kit PathoProof TM (kit de diagnóstico de los principales patógenos causantes de mamitis por la técnica de PCR a tiempo real) y el cultivo bacteriano. Los resultados indicaron una buena correla- 2 PRODUCCIÓN ANIMAL Marzo-A bril 2012 N.º 271

3 Análisis laboratorial dentro de los programas de prevención de la mamitis... ción entre ambos análisis y sugirieron que la PCR tenía mayor sensibilidad que el cultivo. ANÁLISIS LABORATO- RIAL DENTRO DE LOS PROGRAMAS DE PREVENCIÓN DE MAMITIS y LA MEJORA DE LA CALIDAD DE LA LECHE: NUEVA ESTRA- TEGIA DE DIAGNÓSTI- CO POR PCR En el departamento de diagnóstico veterinario del Laboratorio Interprofesional Lechero de Cataluña (ALLIC) analizamos muestras de leche individual de mamitis clínica y subclínica, de tanque, pooles de muestras procedentes de animales que se van a incorporar en la explotación antes de ser adquiridos (compra o movimientos de animales), de vacas recién paridas, de vacas antes del periodo de secado y de muestras para el control de patios. Nuestro objetivo es la prevención, el control de la mamitis y la mejora de la calidad de la leche. El laboratorio (ALLIC) tras una larga experiencia en la técnica de cultivo de leche para la detección e identificación del agente causal de la mamitis (clínica o subclínica), inicia una nueva estrategia de análisis mediante la técnica de la PCR a tiempo real ofreciendo así un mejor servicio tanto a veterinarios como a ganaderos. La técnica de identificación de patógenos por PCR a tiempo real se basa en la detección de una secuencia específica de nucleótidos del ADN (gen diana) para cada patógeno, y la amplificación exponencial por medio de la enzima polimerasa de la secuencia determinada (reacción en cadena de la polimerasa (PCR)). De esta manera el gen diana se amplifica (copia) múltiples veces obteniéndose un número de cadenas de ADN idénticas que pueden ser detectadas ópticamente. La técnica a tiempo real mide los niveles de amplificación del ADN a medida que esta va ocurriendo, mediante la incorporación de sondas marcadas con moléculas fluorescentes. La medición de la amplificación se realiza con un instrumento óptico (fluorómetro). La cantidad de fluorescencia emitida es directamente proporcional al número de copias de ADN específico en la reacción, y por ello, la técnica permite la cuantificación del ADN amplificado o, indirectamente, el número de bacterias presentes en la muestra original. El kit comercial de diagnóstico utilizado, basado en la identificación de dianas genéticas, de los principales patógenos de mamitis mediante la técnica de PCR a tiempo real, ha sido el PathoProof TM (Finnzymes Diagnostics) (ver tabla 1). Validación de la técnica Los kits PathoProof TM, han sido ampliamente validados con muestras de leche de mamitis clínicas, subclínicas y con muestras de tanque. En todas las validaciones y parámetros determinados (especificidad, sensibilidad) se han encontrado excelentes resultados. Citamos algunas de estas validaciones: Validación de la Especificidad y sensibilidad analítica del ensayo PathoProof TM,: Koskinen M.T.et al.(2009): ensayaron 454 muestras de mamitis clínica bovina con el kit Patho- Proof TM Mastitis Complete-12 y encontraron que presentaba una sensibilidad y especificidad del 100%; Friendchip et al., 2010, analizaron 230 muestras de control lechero y encontraron una sensibilidad diagnóstica del 94,1% y una especificidad diagnóstica del 94,8%. Validaciones con muestras de leche de mamitis clínicas negativas en cultivo: Taponen y colaboradores (2009): realizaron un estudio con muestras de mamitis clínicas que habían dado resultados negativos en cultivos bacterianos. Ensayaron, con el kit de PCR PathoProof TM, 79 muestras de leche de mamitis clínica, que fueron negativas a cultivo y de estas 79 muestras, el 43% fueron positivas por PCR. El número de copias bacterianas en estas muestras positivas fue del orden de 103 a 107copias de genoma por mililitro de leche, cantidad suficiente de bacterias para haber sido detectadas en cultivo. De ello se concluye que la técnica de PCR es una herramienta más sensible y por lo tanto más útil para el diagnóstico bacteriológico de tales muestras. Los cultivos negativos en muestras donde los síntomas clínicos son evidentes son un problema para los laboratorios, los ganaderos y veterinarios. Las razones de la negatividad de las muestras de leche de mamitis clínica en cultivo no están claras, pero podría deberse a un número insuficiente de bacterias en la muestra de leche, a la presencia de inhibidores de crecimiento en la leche o a que estas bacterias, aunque presentes, no sean viables en los medios de laboratorio (Vacunek, 2010). Internamente el laboratorio ALLIC realizó un estudio comparativo con muestras Marzo-A bril 2012 N.º 271 PRODUCCIÓN ANIMAL 3

4 Tabla 1: Kits de diagnóstico leche de vaca de tanque de explotaciones lecheras de Cataluña, del kit PathoProof TM Mastitis Major 3 y el cultivo bacteriano. Sistemática y métodos Cultivo bacteriano: Para Streptococcus spp y S. agalactiae se emplea el medio Edwards que permite diferenciar los streptococos en función de su reacción frente a la esculina y su capacidad hemolítica. Para Staphylococcus coagulasa negativo y Staphylococcus aureus se utiliza el medio Baird-Parker con RPF que permite visualizar la prueba de la coagulasa in situ. Los Staph. coagulasa positivos son confirmados con la prueba de manitol en anaerobiosis. Para Mycoplasma bovis utilizamos el medio PPLO con incubación en anaerobiosis durante 7-10 días. Esta técnica es larga, poco precisa y se necesita experiencia por parte del personal del laboratorio. PCR a tiempo real: Se utiliza el kit PathoProof TM Mastitis Major 3 que permite analizar simultáneamente la presencia de los microrganismos patógenos Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae y Mycoplasma bovis. Realizamos ambos métodos (cultivo bacteriano/pcr) en leche de vaca correspondiente a tanque de explotaciones de bovino. Se utiliza el kit PathoProof TM Mastitis Major 3 que permite analizar simultáneamente la presencia de los microrganismos patógenos Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae y Mycoplasma bovis. Realizamos ambos métodos (cultivo bacteriano/pcr) en leche de vaca correspondiente a tanque de explotaciones de bovino. Los resultados de los cultivos se han expresado en unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml), mientras que los resultados de la PCR se han expresado en cuatro categorías en función del número de ciclos de replicación (Ct): negativo (-), ligeramente positivo (+), moderadamente positivo (++) o muy positivo (+++). Resultados: Resultados para Streptococcus agalactiae De un total de 64 muestras de leche de tanque analizadas por cultivo (medio Edwards) y por PCR se encontraron 22 muestras positivas a PCR frente a 13 de cultivo. Se realizó un seguimiento analítico de la leche de tanque de las explotaciones correspondientes a estas 9 muestras positivas al PCR y negativas al cultivo, confirmándose el resultado al identificar los animales positivos mediante el cultivo de la leche de cuarterón. Resultados para Staphylococcus aureus De un total de 92 muestras de leche de tanque analizadas por cultivo (medio Baird-Parker con RPF) y por PCR se encontraron 44 muestras positivas a PCR frente a 46 de cultivo. Los resultados del cultivo de estas dos muestras positivas correspondían a un bajo nivel de colonias (50 ufc/ml). El histórico de resultados del cultivo de tanque de ambas explotaciones nos mostraba que éstas explotaciones eran positivas a S. aureus de una manera intermitente. Resultados para Mycoplasma bovis De un total de 50 muestras de leche de tanque analizadas por cultivo (medio PPLO) y por PCR se encontraron 8 muestras positivas a PCR frente a 4 de cultivo. Los resultados negativos de cultivo pueden ser debidos a a que el método es poco preciso y que en muestras de tanque, donde el nivel de contaminación es muy elevado, es difícil la identificación de M. bovis. A partir de los datos obtenidos, observamos que en los tres patógenos los resultados han sido satisfactorios e indicaron una buena correlación entre ambos análisis. y 4 PRODUCCIÓN ANIMAL Marzo-A bril 2012 N.º 271

5 Análisis laboratorial dentro de los programas de prevención de la mamitis... El principal inconveniente sería el coste: reactivos, material fungible (puntas de pipeta, eppendorf, ) y equipamiento. sugirieron que la PCR tenía mayor sensibilidad que el cultivo. No obstante, el números de muestras todavía no es representativo para poder realizar un tratamiento estadístico de los datos. Ventajas e inconvenientes del diagnóstico de mamitis por PCR a tiempo real frente al cultivo bacteriano. Son muchas las ventajas de la técnica de PCR en comparación con la técnica de cultivo bacteriano estándar. Cabe destacar: la rapidez (resultados en 4-5 horas), la mayor sensibilidad (límite de detección más bajo) y elevada especificidad (sólo detecta el microorganismo diana). Además, los resultados son objetivos y no dependen de la experiencia del usuario. La técnica permite la cuantificación del ADN extraído y, por lo tanto, los resultados son, además de cualitativos, cuantitativos. Manejo de muestras: la técnica es aplicable a diferentes tipos de leche: leche de cuarterón, de tanque, con conservante, congelada y leche con antimicrobianos. Facilidades en el envío de las muestras: Las muestras pueden ser enviadas sin refrigeración, preservadas con bronopol. La técnica de PCR detecta el ADN de bacterias vivas o muertas. Se podría argumentar que, si estas bacterias están dañadas o muertas, no van a provocar mamitis. Esto podría ser correcto en el caso de algunas mamitis ambientales, pero el hecho de tener ADN específico de patógenos de mamitis contagiosa, aunque la bacteria no crezca en cultivo, puede recobrar su virulencia o pueden estar retenidas en el tejido de la ubre y crear problemas en un futuro próximo (Vacunek, 2010). ANALíTICAS DE CONTROL DE LECHE DE TANqUE EN EL ALLIC: MAMITIS E HIGIENE Actualmente, el Laboratorio Interprofesional Lechero de Cataluña está aplicando de una manera sistemática la técnica de PCR para la prevención y detección de agentes causantes de mamitis contagiosa: Mycoplasma bovis, Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae. (nota: próximamente con el nuevo kit PathoProof TM Mastitis Major 4 tambien S. uberis). El análisis de PCR se está utilizando como una herramienta de screening de contagiosos y control de bioseguridad de las granjas. Las medidas de bioseguridad son básicas, antes de la introducción de animales en una granja y, en el caso de las mamitis, deben de centrarse en el diagnóstico de los microorganismos contagiosos, en particular S. aureus, S. agalactiae y Mycoplasma bovis. Por ello se están analizando de una manera sistemática las muestras correspondientes al tanque y pooles de muestras de la leche procedente de la compra de animales, de las vacas recién paridas, de las vacas antes del periodo de secado, de muestras para el control de patios y pooles de muestras de vacas con recuento de células somáticas (RCS) altos. - La Analítica SISTEMÁTICA de la leche del tanque: nos Marzo-A bril 2012 N.º 271 PRODUCCIÓN ANIMAL 5

6 Tabla 2: Parámetros y técnica para el análisis sistemático de la leche de vaca de tanque en el ALLIC y baja eliminación del patógeno, es necesario realizar el análisis de la leche de todas las vacas inmediatamente después del parto ya que es, en el tiempo de lactancia, el periodo de mayor probabilidad de eliminación de M. bovis (G.A. Contreras, 2011). permite mantener bajo control la explotación ganadera y observar su evolución (vigilancia de patógenos). Desde que el parámetro M. bovis se esta realizando de forma rutinaria en la leche de tanque por PCR, nos ha permitido detectar explotaciones positivas. Anteriormente dado que el cultivo era largo, laborioso y poco preciso, este parámetro no se podía realizar de una manera sistemática. A nivel de tanque, también se analizan de manera sistemática los siguientes parámetros bacteriológicos (ver tabla 2): SPC (Recuento de mesófilos), LPC (Recuento de termodúricos), Recuento de coliformes (CC) y no coliformes, Recuento de Prototheca spp. y levaduras mediante la técnica de cultivo clásica descrita anteriormente. Con la evaluación de la tendencia de los resultados, el veterinario de calidad de leche podrá investigar posibles problemas relacionados con la calidad bacteriológica. de la leche. El cultivo de la leche de tanque refleja cambios (buenos o malos) en el manejo y, por lo tanto, es una herramienta de seguimiento de los cambios. Una comparación entre los valores de los recuentos de diagnóstico (SPC, LPC, CC y RCS) nos puede dar pistas valiosas en cuanto a la probable fuente del problema (Reinemann, 1999). - La Analítica de la leche de animales que se van a incorporar en la explotación antes de ser adquiridos (analítica antes de la compra o movimiento de animales): este punto es de vital importancia para asegurarnos que los animales que introduzcamos en nuestra explotación presenten las condiciones óptimas y evitemos así que se produzca un contagio entre los animales sanos. La mayor sensibilidad y rapidez en el diagnóstico por PCR puede evitar la compra de un animal con infecciones latentes en la ubre. - La Analítica de la leche de las vacas recién paridas: al igual que en el caso anterior, las recién paridas pueden ser portadoras de microorganismo contagiosos que, durante el periodo de secado, no se han acabado de erradicar. Asegurar el estado de las recién paridas nos evita problemas posteriores en la granja. Se puede considerar que, si no hemos entrado animales nuevos en la granja, las vacas recién paridas estarán en las mismas condiciones que al final de la lactación (antes del periodo de secado). Pero, debido a que las vacas infectadas con M. bovis tienen periodos de alta - Analítica para el control de patios: en caso de granjas con presencia de alguno de los tres microorganismos patógenos anteriormente citados y en las cuales se han separados las vacas positivas de las negativas, el control mediante la analítica con PCR de los patios limpios ayuda asegurar que el manejo de la granja es el correcto hasta eliminar la problemática en la granja. - Analítica de pooles de muestras de vacas con RCS altos (RCS> cel/ml), chequeo de las vacas antes del periodo de secado. - Analítica de muestras de leche de mamitis clínicas negativas en cultivo: cultivos negativos en muestras donde los síntomas clínicos son evidentes. - Analítica de muestras individuales: con los kits PathoProof TM Complete -12 o 16 nos permiten ampliar la cantidad de patógenos detectados. Debemos destacar que el nuevo kit 16 también detecta Prototheca spp. CONCLUSIONES El ensayo por PCR a tiempo real es una buena herramienta para la prevención y detección de patógenos causantes de mamitis. 6 PRODUCCIÓN ANIMAL Marzo-A bril 2012 N.º 271

7 Análisis laboratorial dentro de los programas de prevención de la mamitis... Es importante resaltar la aplicación de la técnica de PCR en las muestras de leche de tanque; en las muestras de leche procedente de las vacas antes de ser adquiridas (compra/movimiento de animales); en el chequeo de las vacas antes del periodo de secado; en la leche de las vacas recién paridas; en la leche con recuentos RCS < cel/ml y en muestras con cultivos negativos. Son muchas las ventajas de la técnica de PCR en comparación con la técnica de cultivo bacteriano estándar. Primero Cabe destacar la rapidez (resultados en 45 horas), la mayor sensibilidad (límite de detección más bajo) y elevada especificidad (sólo detecta el diana). microorganismo Además, los resultados son objetivos y no dependen de la experiencia del usuario. Segundo Hay que considerar que bacterias comunes de mamitis pueden aparecer en grandes cantidades en muestras de mamitis clínica, pero presentan ausencia de crecimiento en la técnica de cultivo convencional. mastitis during early lactation on reproductive performance of Jersey cows. J. Dairy Sci. 81: BIBLIOGRAFíA Vacunek, 2010: Isbene Sanchez, Beatriz Lázaro, Félix Bastida. Ventajas del diagnóstico de mamitis por PCR a tiempo real (PathoProofTM ) frente al cultivo bacteriano. Tierras, 2010 nº170 ( Pamela Ruegg, 2011: A Practical Look at Monitoring Mastitis Control Programs. Congreso Internacional ANEMBE de Medicina Bovina. May 11-13, Avila, Spain. Fetrow, J Mastitis: An economic consideration. in Proceeding 39th Annual Conference National Mastitis Council, Atlanta GA, Feb 1316, pp 3-47 Barker, A. R., F. N. Schrick, M. J. Lewis, H. H. Dowlen, S. P. Oliver Influence of clinical Santos, J. E., R. L. Cerri, M. A. Ballou, G. E. Higginbotham, and J. H. Kirk Effect of timing of first clinical mastitis occurrence on lactational and reproductive performance of Holstein dairy cows. Anim. Repro. Sci. 80: Schrick, F. N., M. E. Hockett, A. M. Saxton, M. J. Lewis, H. H. Dowlen, S. P. Oliver Influence of subclinical mastitis during early lactation on reproductive parameters. J. Dairy Sci. 84: Koskinen M. T. et al. Analytical specificity and sensitivity of a real-time polymerase chain reaction assay for identification of bovine mastitis pathogens. J. Dairy Sci. 2009, 92 (3): Friendchip et al., 2010, NMC annual Meeting Proceedings Taponen y colaboradores (2009) (Journal of Dairy Science, Vol 92, nº6, June 2009), Reinemann D. J., G.A. Mein, D. R. Bray, D. Reidand J. S. Britt, Troubleshooting high bacteria counts in farm milk. Univ. Wisconsin Coop Ext Pub A3705, Madison WI G. Andrés Contreras, 2011: Mycoplasma bovis en el ganado lechero, ALBEITAR, marzo del 2011 nº 143.