19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: 2 231 770 1 Int. Cl. 7 : C12N 1/77 C12N 1/87 C12N 1/31 C12N 1/21 // (C12N 1/21 C12R 1:16) 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: 941770.9 86 Fecha de presentación: 07.02.1994 87 Número de publicación de la solicitud: 06134 87 Fecha de publicación de la solicitud: 21.09.1994 4 Título: Nuevos plásmidos para la producción de proteína CRM y toxina diftérica. Prioridad: 0.03.1993 US 27283 73 Titular/es: Wyeth Holdings Corporation Five Giralda Farms Madison, New Jersey 079, US 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: 16.0.0 72 Inventor/es: Metcalf, Benjamin J. 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: 16.0.0 74 Agente: Gómez-Acebo y Duque de Estrada, Ignacio ES 2 231 770 T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 28036 Madrid
DESCRIPCIÓN Nuevos plásmidos para la producción de proteína CRM y toxina diftérica. 1 2 3 La presente invención trata de un procedimiento para producir toxina diftérica o proteína CRM, que es reactiva cruzada con la toxina diftérica, un plásmido para expresar la toxina diftérica o la proteína CRM que es reactiva cruzada con la toxina diftérica en un hospedador, y un microorganismo de la especie Corynebacterium diphteria, cepa C7, que es transformado mediante dicho plásmido. Antecedentes La proteína CRM197 es una forma no tóxica de la toxina diftérica, pero es inmunológicamente indistinguible de la toxina diftérica. La CRM197 es producida por C. diphteriae infectada por el fago no toxigénico β197 tox creado mediante mutagénesis con nitrosoguanidina del corinefago β toxigénico (Uchida, T., y col., 1971, Nature New Biology 233: 8-11). La proteína CRM197 tiene el mismo peso molecular que la toxina diftérica, pero se diferencia de ésta en un cambio simple de bases (de guanidina a adenina) en el gen estructural. Este cambio simple de bases provoca la sustitución de un aminoácido (ácido glutámico por glicina) en la proteína madura, y elimina las propiedades tóxicas de la toxina diftérica. La proteína CRM197 es un vehículo seguro y eficaz para los sacáridos dependientes de los linfocitos T, y actualmente se usa en la vacuna conjugada de Haemophilus influenzae de tipo b con el oligosacárido CRM197 (HibTiter TM ; Lederle Praxis Biologicals, Rochester, NY). La producción de cantidades significativas de la proteína CRM197 para su uso en vacunas se ha visto obstaculizada debido a la baja abundancia de la proteína. Se han desarrollado técnicas para estimular la producción de proteínas CRM usando lisógenos dobles (Rappuoli, R., 1983, Applied Env. Microbio. 46: -64; patente de EE.UU. 4.92.792 concedida a R. Rappuoli; y Rappuoli, R., 1983, J. Bacteriol. 13: 12-12) del corinefago no toxigénico β197. Rappuoli informa sobre rendimientos de CRM197 a partir de lisógenos dobles de hasta tres veces mayores que de lisógenos simples. Los niveles de producción de CRM197 mediante lisógenos simples son adecuados pero económicamente poco satisfactorios para la producción de vacunas que utilizan la proteína CRM197. La introducción de lisógenos múltiples del corinefago β en Corynebacterium diphteriae es un procedimiento de cribado laborioso para identificar las cepas que pueden sobreproducir la proteína CRM197, la toxina diftérica u otras proteínas CRM que sean reactivas cruzadas con la toxina diftérica. Además, este procedimiento está limitado en su capacidad de manipular la expresión de la proteína usando técnicas recombinantes estándar. Sería por tanto beneficioso desarrollar un procedimiento que pueda producir cantidades significativas de toxina diftérica y proteínas CRM mediante el incremento del número de copias de genes sin el uso del corinefago β, o mediante el incremento de los niveles de producción de estas proteínas a partir de cepas lisogénicas para el corinefago β. Resumen de la invención 4 0 6 La invención corresponde a un nuevo procedimiento y sistema de plásmido para manipular e introducir el gen que codifica para la CRM197, la toxina diftérica y otras proteínas CRM procedentes del gen de la toxina diftérica, así como a los microorganismos transformados por estos medios. Se describe un plásmido de ADN particularmente preferible, denominado ppx 311, que combina el gen para la CRM197 a partir del betafago no toxigénico y del plásmido png2-22. El nuevo sistema de plásmido es capaz de transformar cepas de Corynebacterium diphteriae en cepas que son capaces de expresar altos niveles de la proteína CRM197 sin el uso de lisógenos múltiples. La invención proporciona un medio elegante para incrementar la expresión de la proteína CRM197, la toxina diftérica y otras proteínas CRM procedentes del gen de la toxina diftérica. La expresión del gen también puede ser manipulada aumentando la fuerza del promotor o eliminando el promotor de la regulación del hierro. En las realizaciones preferibles, el sistema de plásmido puede usarse para expresar otras proteínas como fusiones genéticas con la CRM197, la toxina diftérica u otras proteínas CRM procedentes del gen de la toxina diftérica. Puede usarse la secuencia reguladora y de procesado de la CRM197, la toxina diftérica u otras proteínas CRM del gen de la difteria para expresar proteínas foráneas en Corynebacterium sps. Breve descripción de los dibujos La Fig. 1 es un plásmido de ADN recombinante, denominado ppx 311, que contiene el gen para la CRM197, un sitio de clonación múltiple procedente del vector de clonación de E. coli puc 18, que contiene el marcador de la resistencia al cloranfenicol (CmR) y un origen de replicación procedente del plásmido png2-22 (Serwold-Davis, T. M. y col., 1990, FEM Microbiol. Lett. 66: 119-124). La Fig. 2 es un gel de SDS-PAGE al 12% que muestra la producción de la CRM197 (61,8 kilodalton) a partir de diferentes cepas de C. diphteriae C7. Carril A: estándares de alto peso molecular (BRL, 0-14,3 kilodalton); Carril B: lisógeno sencillo C7 (β197) tox ; Carril C: lisógeno doble C7 (β197) tox ; Carril D: C7 (-) tox no lisogénico con ppx 311, crecido sin cloranfenicol (Cm2) (2 µg/ml); Carril E: C7 (-) tox no lisogénico con ppx 311, crecido con cloranfenicol (2 µg/ml); Carril F: lisógeno simple C7 (β197) tox con ppx 311 crecido sin cloranfenicol (2 µg/ml); Carril G: lisógeno simple C7 (β197) tox crecido con cloranfenicol (2 µg/ml). 2
La Fig. 3 muestra la estabilidad del plásmido ppx 311 en C. diphteriae C7 (β197) tox usando la resistencia a cloranfenicol como un indicador de la retención del plásmido sin selección de antibiótico. 1 2 3 4 0 6 Descripción detallada de la invención La invención corresponde a un nuevo procedimiento y sistema de plásmido para producir la toxina diftérica, la CRM197, y otras proteínas CRM procedentes del gen de la toxina diftérica, en cantidades que son suficientes para su uso en vacunas u otro uso que requiera cantidades manipulables adecuadas de estas proteínas. El sistema de plásmido proporciona un medio eficaz para introducir e incrementar el número de copias del gen de la toxina diftérica o del gen de la CRM en Corynebacterium sps. El plásmido tiene su propio episoma independiente con sus propias funciones de replicación, permitiendo así que el plásmido introduzca copias adicionales del gen de la toxina diftérica o de la CRM en cepas hospedadoras que no son capaces de dicha integración o que no han sido previamente infectadas por el fago β197 tox. Por ejemplo, los niveles de la proteína CRM197 producida por Corynebacterium sps., portadora del plásmido de esta invención, son comparables, si no mejores, a los rendimientos de la proteína CRM197 expresada por lisógenos múltiples de C. diphteriae que han sido infectadas con el corinefago β197 tox. Los plásmidos de altos niveles de producción de esta invención comprenden un gen que codifica para la toxina diftérica o para la proteína CRM, incluyendo su secuencia de señalización promotora y reguladora; un origen de replicación de Corynebacterium tal que el plásmido resultante pueda ser introducido en Corynebacterium sps.; y un marcador seleccionable que está opcionalmente unido a un sitio de clonación múltiple. Este plásmido se usa para transformar microorganismos de la especie Corynebacterium, y particularmente Corynebacterium diphteriae, en condiciones suficientes como para facilitar la expresión de la toxina diftérica o del gen CRM. Las condiciones de crecimiento adecuadas son fácilmente apreciables por el experto en la materia, dependiendo del organismo hospedador. Por ejemplo, para una óptima producción de la CRM197, la toxina diftérica u otra proteína CRM a partir de Corynebacterium sps., es necesario mantener el microorganismo en un medio bajo en hierro o sin hierro. El plásmido contiene un gen que codifica para la toxina diftérica o la proteína CRM, procedente del gen de la toxina diftérica. Algunos ejemplos de proteínas CRM, es decir, Materiales Reactivos Cruzados, que son inmunológicamente reactivas cruzadas con la toxina diftérica, que pueden usarse en el plásmido constructo de esta invención, incluyen, pero no se limitan a, CRM197, CRM4, CRM, CRM228 y CRM176. El gen que codifica para la proteína CRM197 procede de la toxina diftérica (TD), de cuya secuencia informaron Greenfield y col., (Greenfield, L., y col., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 80: 683-687). La diferencia entre el gen de la TD y el gen de la CRM197 es un cambio simple de bases en el gen estructural. Las secuencias de nucleótidos de algunos de los genes CRM han sido detalladas por Uchida, T., y col., (J. Biol. Chem., 248: 3838-3844, 197). El gen CRM completo, incluyendo su secuencia de señalización reguladora, puede producirse mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Pueden usarse otras técnicas de amplificación o técnicas sintéticas para producir el gen CRM197 u otros genes CRM. La secuencia de señalización reguladora del gen que codifica para la toxina diftérica y la proteína CRM permite que la proteína sea secretada al medio. Así, la proteína secretada puede ser recuperada del medio y purificada usando técnicas conocidas, tales como precipitación salina y columna de cromatografía. El sitio de clonación múltiple procede preferiblemente del puc 18, pero pueden usarse sitios de clonación múltiple procedentes de otras fuentes, por ejemplo, pbluescript u otros sitios de clonación múltiple sintéticos. Alternativamente, el sitio de clonación múltiple puede ser eliminado en conjunto sin interferir la operabilidad del plásmido. En cualquier caso, se ha incorporado un marcador seleccionable al plásmido. Puede usarse cualquier marcador de resistencia a antibióticos como marcador seleccionable, tales como, pero no limitados a, ampicilina, eritromicina, cloranfenicol, kanamicina. Primero se ensaya la susceptibilidad de la corynebacteria al antibiótico elegido. Es preferible el cloranfenicol si las proteínas expresadas están destinadas a uso humano, dado que el cloranfenicol ha sido aprobado para tal propósito por el Organismo para el Control de Alimentos y Medicamentos. Pueden usarse otros procedimientos de selección de plásmidos, tales como resistencia a los metales pesados o requerimientos nutricionales, como alternativas a los marcadores de resistencia a antibióticos. Los orígenes de replicación útiles en la construcción de los plásmidos de alta producción de esta invención son los procedentes de Corynebacterium sps. El origen de replicación elegido para ppx 311 procede de Corynebacterium diphteriae. Véase la sección de ejemplos. Pueden usarse otros orígenes de replicación de corynebacterias. En una realización preferible, se consigue un alto nivel de expresión de la proteína CRM197 usando un nuevo plásmido de ADN recombinante, denominado ppx311, capaz de transformar cepas de C. diphteriae C7 en cepas que producen altos niveles de la proteína CRM197. El plásmido ppx 311, mostrado en la Fig. 1, contiene el gen CRM197 procedente de la toxina diftérica (Greenfield, L., y col., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 80: 683-687). La porción remanente del plásmido procede del plásmido parental png2-22, en el que se ha insertado el gen CRM197. El plásmido ppx 311 se produce mediante una primera amplificación del gen CRM197 de C. diphteriae mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Entonces se clona el gen CRM197 en un plásmido de C. diphteriae que contiene un marcador seleccionable, tal como png2 (Schiller, J., y col., 1980, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18: 814-821) y png2-22 (Serwold-Davis, T. M., y col., 1990, FEM Microbiol. Lett., 66: 119-124). Ambos 3
plásmidos disfrutan de un amplio intervalo de hospedadores y son capaces de replicarse con un bajo número de copias (- copias/célula) en todas las coryneformas ensayadas hasta ahora. 1 2 3 4 0 6 El plásmido parental png2 es un plásmido natural de C. diphteriae que originalmente se aisló de cepas clínicas resistentes a eritromicina. El origen de replicación del png2 está contenido en un fragmento de 2,6 kb EcoRI-ClaI. Este origen de replicación se ha usado para crear un vector de resistencia al cloranfenicol, denominado png2-22 (Serwold-Davis y col., Ibid.) y pcm 2.6 (Schmit, 1991, Infect. Immun. 9: 1899-1904). Entonces la cepa C7 de C. diphteriae es transformada con el plásmido ppx 311 resultante mediante electroporación, permitiendo así que la bacteria produzca CRM197 sin la presencia del fago β197 tox. Pueden usarse otras técnicas de transformación, tales como los medios físicos y químicos conocidos (Serwold-Davis y col., Ibid.). Esta técnica de electrotransformación con ppx 311 también se realiza usando el lisógeno simple (β197) tox de C. diphteriae C7 para incrementar el nivel de producción de la proteína CRM197. Los niveles de proteína CRM197 expresada por los transformantes son comparados con los niveles de expresión del lisógeno simple (β197) tox de C. diphteriae C7, ATCC nº 328, y del lisógeno doble (β197) tox M1 de C. diphteriae C7, ATCC nº 392, que no porta el plásmido ppx 311. Se observa que cuando el plásmido ppx 311 es transfectado a una cepa C7 de C. diphteriae, los transformantes son capaces de expresar la CRM197 a unos niveles que son equivalentes a las cepas de lisógeno doble de C. diphteriae. En otras realizaciones de la invención, el nuevo vector plásmido es modificado para crear una serie de vectores plásmidos con diversas capacidades. Por ejemplo, puede usarse una mutagénesis dirigida para reparar el cambio simple de bases de CRM197, de forma que el nuevo plásmido expresaría la toxina diftérica. Pueden realizarse otros cambios en la secuencia del gen CRM197 clonada para expresar otras proteínas CRM de toxina diftérica conocidas, tales como CRM4, CRM, CRM228 y CRM176 (Uchida, T., y col., 1973, J. Biol. Chem. 248: 3838-3844). Usando técnicas de ADN recombinante pueden hacerse cambios en las secuencias reguladoras o procesadoras de la toxina diftérica de la CRM197, o pueden usarse otros genes de la toxina diftérica o de CRM clonados de forma similar para incrementar adicionalmente la producción de estas proteínas. Por ejemplo, la región del promotor tox puede modificarse para liberar al promotor de la regulación del hierro. En otra realización, el sistema de vector plásmido puede ser modificado para introducir sitios de clonación de enzimas de restricción en el amino terminal del gen CRM197 o en una toxina diftérica clonada de forma similar o en el gen CRM. La clonación de las secuencias de ADN a partir de otras proteínas en los sitios de clonación permitiría entonces que el vector plásmido coexpresara otras proteínas recombinantes o antígenos como fusiones amino terminales con la proteína CRM197 o con una toxina diftérica clonada de forma similar o en la proteína CRM, todas bajo la dirección del promotor tox y de la secuencia de señalización. Además, o alternativamente, pueden insertarse sitios de clonación en la porción carboxilo terminal de la CRM197, de la toxina diftérica o de CRM clonadas de forma similar, para expresar otras proteínas como fusiones de carboxilos terminales. Debido a la presencia de la secuencia de señalización reguladora de la CRM197, la proteína de fusión resultante sería secretada en el medio de cultivo. Alternativamente, sólo necesitaría usarse la secuencia de señalización reguladora de la CRM197 como un medio para expresar las formas secretadas de otras proteínas en el medio de cultivo. Las proteínas y los antígenos adecuados útiles en la producción del plásmido de la invención incluyen antígenos particulados, tales como los procedentes de bacterias, virus, parásitos u hongos, y microcomponentes de células y de antígenos solubles, tales como proteínas, péptidos, hormonas y glucoproteínas. Los antígenos de particular interés son los antígenos víricos, fúngicos, parásitos o bacterianos, los antígenos relacionados con la autoinmunidad o los antígenos relacionados con tumores. Los antígenos pueden obtenerse a partir de fuentes naturales, o pueden producirse mediante la tecnología del ADN recombinante o mediante otros medios artificiales. Entre los antígenos bacterianos de interés están los relacionados con los patógenos bacterianos humanos, incluyendo, pero no limitándose a, por ejemplo, Haemophylus influenzae, Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoiae, Streptococcus pyogenes, Branhamella catarrhalis, Vibrio cholerae, Neisseria gonorrhoeae, Bordetella pertusis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae y Clostridium tetani, tipables y no tipables. Algunos antígenos bacterianos específicos incluyen las proteínas de la superficie bacteriana y la membrana externa (por ejemplo, de Haemophylus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae o Branhamella catarrhalis) y proteínas de la superficie bacteriana (por ejemplo, la proteína M de Streptococcus pyogenes o la proteína de superficie de 37 kilodalton de Streptococcus pneumoniae). Los antígenos víricos procedentes de virus patógenos incluyen, pero no se limitan a, el virus de la inmunodeficiencia humana (tipos I y II), el virus de la leucemia de los linfocitos T humano (tipos I, II y III), el virus sincitial respiratorio, de la hepatitis A, de la hepatitis B, de la hepatitis C, el virus de la hepatitis no A no B, el virus del herpes simple (tipos I y II), citomegalovirus, el virus de la gripe, el virus de la paragripe, poliovirus, rotavirus, coronavirus, el virus de la rubéola, el virus del sarampión, de la varicela, el virus de Epstein-Barr, adenovirus, papilomavirus y el virus de la fiebre amarilla. Muchos antígenos víricos específicos de estos virus patógenos incluyen la proteína F (especialmente los antígenos que contienen el péptido F 283-31, descrito en el documento WO89/0293, titulado Respiratory Syncitial Virus: Bacines and Diagnostic Assays, de Paradiso, P. y col.) y las proteínas N y G del virus sincitial respiratorio (VSR), los 4
polipéptidos VP4 (anteriormente conocido como VP3), VP6 y VP7 de rotavirus, las glucoproteínas de la cubierta del virus de la inmunodeficiencia humana, los antígenos de superficie y de presuperficie del virus de la hepatitis B y las glucoproteínas B y D del herpes. Los antígenos fúngicos pueden ser los procedentes de hongos, incluyendo, pero no limitándose a, Candida sps. (especialmente albicans), Cryptococcus sps. (especialmente neoformans), Blastomyces sps. (por ejemplo, dermatitidis), Histoplasma sps. (especialmente capsulatum), Coccidriodes sps. (especialmente immitis), Paracoccidriodes sps. (especialmente brasiliensis) y Aspergillus sps.. Algunos ejemplos de antígenos parásitos incluyen, pero no se limitan a, Plasmodim sps., Eimeria sps., Schistosoma sps., Tripanosoma sps., Babesia sps., Leishmania sps., Cryptosporidia sps., Toxoplasma sps. y Pneumocystis sps. La invención se ilustrará adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes. 1 Ejemplo 1 Constructos Cepas bacterianas 2 3 4 0 Se usa E. coli DHα (BRL, Gaithesburg, MD) para todos los procedimientos de clonación. Se usan las cepas no toxigénicas y no lisógenas de C. diphteriae C7 (-) tox, lisógenos simples no toxigénicos de C. diphteriae C7 (β197) tox, ATCC nº 328, tanto como hospedadores de plásmidos como controles en los estudios de expresión de la proteína CRM197. Se usa como control el lisógeno doble no toxigénico de C. diphteriae C7 (β197) tox, ATCC nº 392 en los experimentos de expresión de la proteína CRM197. Medios y condiciones de cultivo Se hace crecer rutinariamente E. coli DHα en medio agar de caldo superóptimo (CSO) y en CSO líquido a 37ºC (Sambrook, J. y col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Se cultivan rutinariamente cepas de C. diphteriae C7 en agar y líquido SOC (Sambrook, J. y col., Ibid.). Se usa medio agar osmótico ET (Best, G. R. Y M. L. Britz, 1986, Appl. Microbiol. Biotech., 23: 288-293) para cultivar en placa las células electroporadas. Se usa medio CY sin hierro (Rappuoli, R., y col., 1983, J. Bacteriol., 13: 12) para los experimentos que implican la expresión de la CRM197. Se añade cloranfenicol, a 34 µg/ml para la cepa de E. coli DHα, y a 2 µg/ml para la cepa de C. diphteriae, que contienen el plásmido pps 311. Clonación del gen CRM197 El gen CRM197 es clonado mediante la amplificación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de la secuencia del gen a partir del ADN del lisógeno simple de C. diphteriae C7 (β197) tox usando cebadores oligonucleótidos, según la secuencia publicada de la toxina diftérica (Greenfield, L., y col., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 80: 683-687). Los cebadores están diseñados de forma que un cebador crearía un sitio de restricción SalI/HincII al comienzo del gen funcional, y el otro haría un sitio XbaI después del codón de terminación del gen, del gen estructural. Estos cebadores o unos similares se usan para amplificar y clonar el gen CRM197, el gen de la toxina diftérica o cualquier gen CRM similar al gen de la toxina diftérica codificado por el corinefago β. Los productos de la PCR del CRM197 se digieren con HincII y XbaI y se unen al png2-22 digerido con SmaI/XbaI, un vector de resistencia al cloranfenicol con un amplio intervalo de hospedadores, con la capacidad de replicarse tanto en Escherichia coli como en Corynebacterium sps.. La unión se usa para transformar E. coli DHα, y las colonias recombinantes son cribadas mediante un análisis de restricción para buscar la presencia del gen CRM197. Un aislado, el ppx 311, es secuenciado usando cebadores imbricados para comprobar la existencia de cualquier cambio en el gen CRM197. Los cebadores oligonucleótidos usados en la PCR y la secuenciación son sintetizados en el sintetizador de ADN Applied Biosystems 380B. La PCR se realiza con un ciclador térmico de ADN Perkin-Elmer Cetus. La secuenciación se realiza usando un secuenciador Applied Biosystems 373A. El plásmido resultante (ppx 311) es transferido mediante electroporación en la cepa no toxigénica y no lisogénica C. diphteriae C7(-) tox y en la cepa no toxigénica C. diphteriae C7(β 197 ) tox, ATCC nº 328. Electroporación de C. diphteriae C7 6 Se transforma C. diphteriae C7 con el ADN del plásmido ppx 311 mediante electroporación, usando un protocolo desarrollado para la transformación de Corynebacterium glutamicum y Brevibacterium lactofermentum (Hayes, J. A. Y M. L. Britz, 1989, FEMS Microbiol. Lett. 61: 329-334), excepto porque se usó medio SOC complementado con Tween 80 al 0,2%. Para la electroporación se usan un BTX Transfector 0 con Power Plus y un Optimizor Graphic Pulse Analyzer, y cubetas de 1 mm. La presencia del plásmido ppx 311 en las cepas transformadas de C. diphteriae C7 se comprueba mediante el rescate del plásmido y un análisis de restricción.
Ejemplo 2 Expresión 1 2 Estudios de la expresión cuantitativa de CRM 197 Se realiza una comparación de la producción de CRM197 haciendo crecer cepas de C. diphteriae C7 en condiciones similares y comparando la cantidad de CRM197 en el sobrenadante del cultivo. En una comparación cuantitativa de las cepas, se diluyen 4 ml de cultivos dejados hasta el día siguiente hasta una DO 0 =0,1 en medio CY sin hierro (volumen final de ml en un matraz Erlenmeyer de ml) y se hacen crecer en agitación durante horas a 37ºC. Las cepas que contienen el ppx 311 se hacen crecer con y sin selección por antibiótico (2 µg/ml de cloranfenicol). Tras la incubación, los cultivos se centrifugan para eliminar las células, y se analizan µl de los sobrenadantes de los cultivos en un gel SDS-PAGE al 12%. El gel se tiñe con coomassie, y la comparación cuantitativa se realiza usando un densitómetro de barrido por transmitancia/reflectancia Bio-Rad modelo 1, con un paquete de análisis Hoefer Scientific GS 370. Se realiza una comparación entre las propiedades antigénicas de la proteína CRM197 recombinante y la proteína CRM197 lisogénica β197 tox mediante inmunotransferencia del gel y sondeo con anticuerpos monoclonales contra CRM197. La CRM197 producida por ppx 311 es antigénicamente idéntica a la CRM197 producida por las cepas lisogénicas. Experimentos de estabilidad del plásmido ppx 311 Se estudió la estabilidad del plásmido ppx 311 usando el mantenimiento de la resistencia al cloranfenicol como indicador de la retención del plásmido sin selección antibiótica. Los cultivos de ppx 311 en C. diphteriae C7 (β 197 ) tox se hacen crecer en caldo SOC complementado con Tween 80 al 0,1%, para evitar la aglomeración celular, durante 18 horas (14-17 generaciones) a 37ºC. Entonces los cultivos se colocan en placas de agar SOC para el recuento de colonias y se diluyen 1/ para la siguiente generación. Las placas de SOC agar se replican en SOC agar con 2 µg/ml de cloranfenicol, y se calcula el porcentaje de colonias que mantienen la resistencia a cloranfenicol. Este procedimiento se repite hasta generaciones. Ejemplo 3 Resultados biológicos 3 4 0 La comparación cuantitativa de la producción de CRM197 a partir de diferentes cepas de C. diphteriae C7 mediante densitometría de los geles teñidos con coomassie (Fig. 2) muestra que las cepas con ppx 311 elaboraron aproximadamente 2 veces tanta CRM197 como el lisógeno simple, y tanto como el lisógeno doble (Tabla 1). En la Fig. 3 se muestra la estabilidad del plásmido ppx 311 a lo largo de sesenta generaciones. TABLA 1 Producción de la CRM197 por cepas de C. diphteriae C7, expresada como el nº de veces mayor que el lisógeno simple (β197) tox nº de veces mayor que el lisógeno simple (β197) tox Lisógeno doble (β197) tox 2,2 ppx 311 (-) tox, sin Cm2 2,8 ppx 311 (-) tox, Cm2 1,9 ppx 311 (β197) tox, sin Cm2 2,0 ppx 311 (β197) tox, Cm2 2,4 Depósito biológico 6 El plásmido ppx 311 se depositó bajo los términos del Tratado de Budapest con la American Type Culture Collection (ATCC), 121 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 82, el 12 de febrero de 1993, y se le ha asignado el Número de Acceso a la ATCC 741. Todas las restricciones sobre la disponibilidad al público del material depositado serán eliminadas irrevocablemente tras la concesión de la patente de esta solicitud. El depósito se mantendrá en un depositario público durante un periodo de al menos años a partir de la fecha de depósito o de la vida aplicable de la patente, o durante un periodo de cinco años tras la fecha de la solicitud más reciente de suministro de una muestra de material biológico, el que sea más largo. El depósito será reemplazado si se volviera inviable o no replicable. Los expertos en la materia reconocerán o serán capaces de determinar, usando nada más que experimentos rutinarios, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descritas específicamente en el presente documento. Se pretende que dichos equivalentes estén englobados en el ámbito de las siguientes reivindicaciones. 6
REIVINDICACIONES 1 2 3 1. Un procedimiento para producir toxina diftérica o proteína CRM que es reactiva cruzada con la toxina diftérica, comprendiendo dicho procedimiento: transformar un microorganismo de la especie Corynebacterium diphteriae, cepa C7, con un plásmido que contiene a) un gen que codifica para la toxina diftérica o la proteína CRM; b) un origen de replicación de Corynebacterium; y c) un marcador seleccionable, y expresar dicha toxina o proteína en condiciones suficientes para la expresión del gen por parte del microorganismo. 2. El procedimiento de la Reivindicación 1, en el que el procedimiento de transformación se realiza mediante electroporación. 3. El procedimiento de la Reivindicación 1, en el que el gen CRM se selecciona del grupo formado por CRM197, CRM4, CRM, CRM228 y CRM176. 4. El procedimiento de la Reivindicación 1, en el que el origen de replicación procede del plásmido de Corynebacterium png2.. Un plásmido para expresar la toxina diftérica o la proteína CRM, que es reactiva cruzada con la toxina diftérica, en un hospedador, que comprende: a) un gen que codifica para la toxina diftérica o la proteína CRM; b) un origen de replicación de Corynebacterium; y c) un marcador seleccionable, opcionalmente unido a un sitio de clonación múltiple. 6. El plásmido de la Reivindicación, en el que el gen que codifica para la proteína está operativamente unido a una secuencia de nucleótidos que codifica para una o más proteínas, péptidos o epítopos del mismo. 7. Plásmido ppx 311, nº de acceso al ATCC 741. 8. Un microorganismo de la especie Corynebacterium diphteriae, cepa C7, que es transformado con el plásmido de la Reivindicación. 4 0 6 7
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