PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE MUESTRAS FRESCAS DE TEJIDO DE AVES PARA ESTUDIOS GENÉTICOS La mejor fuente de tejido fresco para la realización de estudios genéticos son los músculos. En el caso de aves la más comúnmente utilizada (y la más fácil de obtener) es el músculo pectoral. Por supuesto, muestras de este tejido solamente pueden extraerse de animales muertos, y por lo tanto se extraen en el caso de colectas de material en la que se sacrifican los ejemplares capturados, ante muertes accidentales de aves en el trabajo de campo, y en caso de encontrar aves muertas recientemente que todavía pueden ser una buena fuente de tejido fresco. En el caso de estudios de captura y liberación de aves, en cambio, se pueden tomar muestras de sangre, que también permiten realizar estudios genéticos. El tejido muscular que puede obtenerse a partir de animales muertos es más útil porque es una mejor fuente de ADN y porque en ese caso además se puede obtener un voucher (piel de estudio, esqueleto), que es sumamente importante para poder analizar cuestiones relacionadas con el ejemplar a partir del cual se obtuvo el tejido. Sin embargo, las muestras de sangre también son útiles, especialmente si se pueden sacar fotos de los ejemplares capturados. Pasos a seguir para la obtención de muestras de músculo pectoral a) En caso de contar con la posibilidad de guardar el material en un freezer de manera inmediata (menos de unas pocas horas) 2- Guardar en una bolsa en el freezer el ejemplar completo, sin abrirlo ni obtener las muestras, que serán obtenidas directamente en el MACN. Esto permite disminuir el tiempo invertido en el campo en la obtención de muestras y facilita la correcta conservación del ejemplar para la preparación de la piel de estudio. 3- Anotar en un papel que se debe guardar junto con el ejemplar el número o código del mismo (que obviamente debe ser único y no repetirse entre ejemplares). Lo más recomendable es utilizar las iniciales del colector y un número (que será creciente a partir del primer ejemplar colectado). Es recomendable escribir también el número o código en lápiz negro en una etiqueta, que puede pegarse a la pata del ejemplar o del lado de adentro de la bolsa. Además se debe anotar la siguiente información sobre el ejemplar en una planilla: especie (en caso de que se la pueda identificar), fecha y hora de colecta, localidad (idealmente con las coordenadas geográficas obtenidas a través de un GPS), colector, número identificatorio (o nombre) de las fotos del ejemplar y el tiempo transcurrido entre que el ejemplar fue colectado y guardado en el freezer. 4- Contactar a la División de Ornitología del MACN. E-mails: dlijtmaer@macn.gov.ar, NOTA: Seguir este procedimiento únicamente si el freezer es confiable y no está sujeto a cortes de energía eléctrica o eventos que puedan llevar a que se descongele el ejemplar. En caso de que existan dudas al respecto, seguir el procedimiento siguiente (b). 1
b) En caso de contar con la posibilidad de guardar el material en un freezer, pero no de manera inmediata (luego de varias horas) 2- Realizar la extracción de la muestra de músculo pectoral. Utilizar guantes de látex descartables (no es necesario que sean estériles, se utilizan los de examinación). Para extraer la muestra se debe realizar un corte ventral de unos pocos centímetros a la altura del esternón con un bisturí. De ser posible, es recomendable mojar un poco las plumas de la zona y correrlas hacia los costados antes de abrirlo, para facilitar el trabajo y evitar que las mismas se manchen con sangre. A ambos lados del esternón se encuentra el músculo pectoral, y se puede obtener una muestra del mismo fácilmente luego de realizar el corte ventral y separar la piel y el músculo (se puede obtener la muestra con el mismo bisturí, o con la ayuda de una pequeña pinza en caso de disponer de la misma). La cantidad de músculo que se pueda obtener dependerá de la especie, pero lo ideal es guardar la mayor cantidad posible (es decir, todo el tejido que entre dentro del tubo en el que se guardará, ver punto siguiente). IMPORTANTE: si se sacan muestras de más de un ejemplar, no es necesario cambiar la hoja de bisturí entre ejemplares, pero es importante esterilizarla, para lo cual simplemente se la debe limpiar lo mejor posible con alcohol, y luego mojarla un poco en alcohol y prenderla fuego con un encendedor durante 2 ó 3 segundos. 3- Se deben guardar 2 muestras de tejido, una congelada sin ningún agregado, y la otra con etanol 96% (el alcohol que se compra en cualquier farmacia). Se guarda cada una en un microtubo separado, uno sin ningún agregado y el otro con el etanol. Ambos tubos deben estar rotulados con el número o código del ejemplar a partir del cual se extrajo el tejido (es decir que será el mismo en ambos casos). Obviamente el número o código debe ser único y no repetirse entre ejemplares. Lo más recomendable es utilizar las iniciales del colector y un número (que será creciente a partir del primer ejemplar colectado). Cada tubo se debe rotular con una etiqueta pegada al costado del mismo, en la cual debe estar escrito el número o código en LÁPIZ NEGRO (es la única manera de asegurarse de que el rótulo no se borrará por efecto del alcohol o el frío prolongado del freezer). Aún cuando las etiquetas sean autoadhesivas, se las debe pegar al tubo con cinta adhesiva transparente y asegurarse de que la cinta de toda la vuelta al tubo hasta estar pegada sobre sí misma (es la única manera de asegurarse de que la etiqueta no se despegará con el tiempo, o como resultado del efecto del alcohol o el frío prolongado). Es recomendable escribir alcohol en la etiqueta del tubo que lleva la muestra en alcohol, para asegurarse de que no se generen confusiones entre muestras. 4- Guardar el ejemplar en una bolsa. Se recomienda ponerle un poco de algodón sobre la parte abierta, para disminuir el riesgo de que se manche el plumaje con sangre. A veces se envuelve el ejemplar con papel (de diario), para mantener las plumas más protegidas y mantener el algodón en su posición. Anotar en un papel el número o código del ejemplar y guardarlo junto con el mismo (debe coincidir con el de los microtubos). Es recomendable escribir también el número o código en lápiz negro en una etiqueta, que puede pegarse a la pata del ejemplar o del lado de adentro de la bolsa. Además se debe anotar la siguiente información sobre el ejemplar en una planilla: especie (en caso de que se la pueda identificar), fecha y hora de colecta, localidad (idealmente con las coordenadas geográficas obtenidas a través de un GPS), colector, número identificatorio (o nombre) de las fotos del ejemplar, y tiempo transcurrido entre que el ejemplar fue colectado y guardado en el freezer. 2
5- Lo antes posible, guardar tanto el ejemplar como los microtubos en el freezer. Hasta guardar las muestras y el ejemplar en el freezer, se los debe mantener lo más frescos posible. Lo ideal es tener una pequeña heladerita (de plástico o telgopor), con hielo (idealmente seco, de no ser posible húmedo) o con enfriadores congelados. De no ser esto posible se debe tratar de mantener el ejemplar y los tubos a la sombra. Debe pasar el menor tiempo posible hasta guardar el material en el freezer. 6- Contactar a la División de Ornitología del MACN. E-mails: dlijtmaer@macn.gov.ar, NOTA: En caso de no contar con la posibilidad de guardar el material en un freezer de manera inmediata, pero disponer de un tanque o termo de nitrógeno líquido en el campo, por favor contactar a la División de Ornitología del MACN para recibir instrucciones de la manera adecuada de proceder. E-mails: dlijtmaer@macn.gov.ar, ptubaro@macn.gov.ar. Teléfonos: (011)4982-6595/4791/8797, internos 186/187. c) En caso de no contar con un freezer en el que se pueda guardar el material antes de transcurridas 24 horas IMPORTANTE: en este caso las fotografías son muy importantes porque serán la mejor conexión de las muestras de tejido con el ejemplar a partir del cual fueron obtenidas (voucher electrónico o e-voucher). Esto se debe a que no será posible mantener el ejemplar fresco como para preparar una piel de estudio (puede prepararse un esqueleto, pero las fotografías resultan muy útiles para la identificación de la especie si no hay piel de estudio, ver abajo). 2- Realizar la extracción de la muestra de músculo pectoral. Utilizar guantes de látex descartables (no es necesario que sean estériles, se utilizan los de examinación). Para extraer la muestra se debe realizar un corte ventral de unos pocos centímetros a la altura del esternón con un bisturí. De ser posible, es recomendable mojar un poco las plumas de la zona y correrlas hacia los costados antes de abrirlo, para facilitar el trabajo y evitar que las mismas se manchen con sangre. A ambos lados del esternón se encuentra el músculo pectoral, y se puede obtener una muestra del mismo fácilmente luego de realizar el corte ventral y separar la piel y el músculo (se puede obtener la muestra con el mismo bisturí, o con la ayuda de una pequeña pinza en caso de disponer de la misma). La cantidad de músculo que se pueda obtener dependerá de la especie, pero lo ideal es guardar la mayor cantidad posible (es decir, todo el tejido que entre dentro del tubo en el que se guardará, ver punto siguiente). IMPORTANTE: si se sacan muestras de más de un ejemplar, no es necesario cambiar la hoja de bisturí entre ejemplares, pero es importante esterilizarla, para lo cual simplemente se la debe limpiar lo mejor posible con alcohol, y luego mojarla un poco en alcohol y prenderla fuego con un encendedor durante 2 ó 3 segundos. 3- Dado que no será posible mantener el tejido fresco congelado, se debe sacar una única muestra de tejido y guardarla en un microtubo con etanol 96% (el alcohol que se compra en cualquier farmacia). El tubo debe estar rotulado con el número o código del ejemplar a partir del cual se extrajo el tejido. Obviamente el número o código debe ser único y no repetirse entre ejemplares. Lo más recomendable es utilizar las iniciales del colector y un número (que será creciente a partir del primer ejemplar colectado). El tubo se debe rotular con una etiqueta pegada al costado del mismo, en la cual debe estar escrito el número o código en LÁPIZ NEGRO (es la única manera 3
de asegurarse de que el rótulo no se borrará por efecto del alcohol o el frío prolongado del freezer una vez que se depositado en la colección de MACN). Aún cuando las etiquetas sean autoadhesivas, se las debe pegar al tubo con cinta adhesiva transparente y asegurarse de que la cinta de toda la vuelta al tubo hasta estar pegada sobre sí misma (es la única manera de asegurarse de que la etiqueta no se despegará con el tiempo, o como resultado del efecto del alcohol o el frío prolongado al depositarse en el MACN). Es recomendable escribir alcohol en la etiqueta. 4- Debido a que el ejemplar no se congelará y comenzará indefectiblemente el proceso de putrefacción, el mismo no podrá ser utilizado para preparar una piel de estudio. De todas maneras, puede ser utilizado para preparar un esqueleto. Lo recomendable es mantener el ejemplar aireado mientras sea posible (pero lejos del alcance de posibles predadores), y luego guardarlo en una bolsa bien cerrada. Anotar en un papel el número o código del ejemplar y guardarlo junto con el mismo (debe coincidir con el de los microtubos). Es recomendable escribir también el número o código en lápiz negro en una etiqueta, que puede pegarse a la pata del ejemplar o del lado de adentro de la bolsa. Además se debe anotar la siguiente información sobre el ejemplar en una planilla: especie (en caso de que se la pueda identificar), fecha y hora de colecta, localidad (idealmente con las coordenadas geográficas obtenidas a través de un GPS), colector y número identificatorio (o nombre) de las fotos del ejemplar. 5- Si bien no serán congelados, es recomendable que tanto el microtubo con la muestra de tejido como el ejemplar sean mantenidos en un lugar lo más fresco posible (si se cuenta con una heladera lo ideal es guardarlos allí). 6- Contactar a la División de Ornitología del MACN. E-mails: dlijtmaer@macn.gov.ar, NOTA GENERAL: En caso de que se realicen necropsias de ejemplares que se encuentran muertos, las muestras de tejidos se pueden obtener durante la realización de la necropsia, siguiendo los mismos pasos mencionados en los casos b) o c), dependiendo de la disponibilidad de un freezer. En este caso se pueden también obtener muestras del corazón, que es otra fuente de tejido comúnmente utilizada, dado que de todas maneras el mismo será inspeccionado durante la necropsia. El ejemplar debe ser guardado luego de realizada la necropsia, siguiendo las mismas indicaciones que se mencionaron en los puntos b) o c), dependiendo de la disponibilidad de un freezer. Pasos a seguir para la obtención de muestras de sangre a partir de ejemplares vivos deben incluir un papel con el número o código del ejemplar (ver punto 4) y una regla. IMPORTANTE: en este caso las fotografías son muy importantes porque serán la ÚNICA conexión entre las muestras de tejido y el ejemplar a partir del cual fueron obtenidas (voucher electrónico o e-voucher). 2- Pinchar la vena alar del ejemplar con la aguja de una jeringa. Si se trata de un ave de gran tamaño (rapaces, patos, etc), se puede obtener sangre directamente con la jeringa del lugar en donde comienza a brotar. Si se trata de una especie de pequeño tamaño (por ejemplo passeriformes), el uso de la jeringa generalmente permite obtener una muestra muy pequeña. En ese caso, es recomendable utilizar un capilar con heparina (anticoagulante). El mismo se apoya sobre la pequeña gota de sangre, y la misma sube por capilaridad. 4
3- Luego se pasa la sangre a un microtubo con etanol 96% (el alcohol que se compra en cualquier farmacia). En caso de haber extraído la sangre con la jeringa, simplemente se pasa al tubo apretando el émbolo. En caso de haberlo hecho con un capilar, se debe empujar la sangre hacia el tubo utilizando una perita de goma que se apoya sobre la punta del capilar que no estuvo en contacto con la sangre (también se puede hacer soplando, pero es preferible usar la perita de goma). 4- El tubo debe estar rotulado con un número o código del ejemplar (obviamente el número o código debe ser único y no repetirse entre ejemplares). Lo más recomendable es utilizar las iniciales del colector y un número (que será creciente a partir del primer ejemplar colectado). El tubo se debe rotular con una etiqueta pegada al costado del mismo, en la cual debe estar escrito el número o código en LÁPIZ NEGRO (es la única manera de asegurarse de que el rótulo no se borrará por efecto del alcohol o el frío prolongado del freezer una vez que sea depositado en la colección del MACN). Aún cuando las etiquetas sean autoadhesivas, se las debe pegar al tubo con cinta adhesiva transparente y asegurarse de que la cinta de toda la vuelta al tubo hasta estar pegada sobre sí misma (es la única manera de asegurarse de que la etiqueta no se despegará con el tiempo, o como resultado del efecto del alcohol o el frío prolongado al depositarse en el MACN). Es recomendable escribir sangre en la etiqueta. 5- Se debe anotar la siguiente información sobre el ejemplar en una planilla: especie (en caso de que se la pueda identificar), fecha y hora de colecta de la muestra de sangre, localidad (idealmente con las coordenadas geográficas obtenidas a través de un GPS), colector y número identificatorio (o nombre) de las fotos del ejemplar. 6- Si bien la sangre en alcohol puede mantenerse a temperatura ambiente, en caso de disponer de un freezer (o en su defecto una heladera), lo ideal es colocar el tubo allí. En caso de no disponer de freezer ni heladera, se debe mantener la muestra en un lugar lo más fresco posible. 7- Contactar a la División de Ornitología del MACN. E-mails: dlijtmaer@macn.gov.ar, NOTA GENERAL: en caso de poder guardar muestras de tejido de otros grupos animales (mamíferos, reptiles, anfibios) el MACN también puede recibirlos, ya que la colección de tejidos no es exclusivamente de aves. Los procedimientos son los mismos, con las siguientes excepciones: a) el músculo ideal para obtener el tejido puede ser otro (aquel que sea más accesible), b) se debe sacar sangre de otra vena (depende del caso), y c) en el caso de animales grandes (mamíferos de gran tamaño) lo más probable es que no se pueda guardar el ejemplar. 5