PRÁCTICAS AMPLIACIÓN DE MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICAS AMPLIACIÓN DE MICROBIOLOGÍA Día 1º.- EXPLICACIÓN GENERAL. TRANSFORMACIONES: E. coli, Streptomyces Día 2º.- INOCULAR MINIPREPS (8:45 de la mañana). OBTENCIÓN DE PLÁSMIDO ( MINIPREPS, Lisis alcalina) DIGESTIÓN CON ENZIMAS (PstI). PREPARAR GEL AGAROSA (1%). CORRER GEL AGAROSA Día 3º.- PREPARAR GELES DE POLIACRILAMIDA. PRECIPITAR PROTEÍNA DEL SOBRENADANTE. CORRER GELES DE PROTEÍNA. TEÑIR Y TRANSFERIR A MEMBRANA Día 4º.- REVELAR "WESTERN" "RUEGOS Y PREGUNTAS" 1

TRANSFORMACION DE E. coli Y Streptomyces lividans Mediante el proceso de transformación podemos introducir DNA en una determinada cepa bacteriana. En Escherichia coli se puede inducir un estado de competencia (la capacidad de adquirir DNA exógeno) mediante un tratamiento químico que modifica las propiedades de la membrana plasmática y la pared celular. En Streptomyces, en cambio, no se conoce una forma natural o artificial de inducir el estado de competencia, por lo que se precisa eliminar la pared celular mediante tratamiento con lisozima y fomentar la fusión de los protoplastos formados añadiendo un agente fusionante como el polietilenglicol (PEG). En nuestro caso emplearemos una mezcla de dos plásmidos (phjl401 y pprt4) que son capaces de transformar ambas especies, ya que poseen elementos de replicación funcionales en ambos organismos (son plásmidos bifuncionales o plásmidos lanzadera). Además confieren fenotipos perfectamente distinguibles: en el caso de E.coli, las colonias portadoras de phjl401 serán azules y las portadoras de pprt4 serán blancas en presencia de X-gal; en Streptomyces, los clones portadores de pprt4 son cpaces de hidrolizar un polisacárido vegetal, el xilano, mientras que los portadores del plásmido phjl401 no pueden llevar a cabo esta hidrólisis. TRANSFORMACION DE E. coli 1.-A 25µl de células competentes de E.coli DH5a añadir 2µl de DNA, mezclar suavemente y mantener en hielo 20 minutos. 2.-Transferir a un baño a 42 C durante 2 minutos. 3.-Poner de nuevo en hielo durante 2 minutos. 4.-Añadir 0.5 ml de medio LB. 5.-Incubar a 37 C durante ~45-1 hora en agitación. 6.-Sembrar 25 y 50µl en placas de LBAmpicilina (con IPTG y X-Gal). TRANSFORMACION DE Streptomyces 1.-Usar 0.5 ml de protoplastos (en solución P+1mg/ml lisozima). 2.-Centrifugar 7 minutos a 3500 rpm. Eliminar sobrenadante casi por completo. Resuspender los protoplastos en la pequeña cantidad de líquido restante. 3.-Añadir 0.5 ml de solución P, mezclar y centrifugar de nuevo (7 min. a 3500 rpm). Eliminar el sobrenadante casi por completo. Resuspender los protoplastos en la pequeña cantidad de líquido restante. 4.-Añadir 5µl de DNA deseado. Mezclar. 5.-Añadir 200 µl de PEG (25% en medio P). Mezclar. 6.-Dejar 2'. 7.-Añadir 0.5ml de solución P y mezclar. 8.-Sembrar 200µl en una placa de medio R5Xilano y el resto (~500 µl) en la otra. 9.-Incubar 28 C. Después de 12-24 horas de incubación, añadir la cobertera de tioestreptona (0.5 ml de agua con 650µg de tioestreptona para una concentración final de 25µg/ml en la placa). 2

SOLUCIONES Solución P (en g/l).- TES 5,73 Sacarosa 10,3 Cl2Mg.6H2O 2,03 K2SO4 0,5 CaCl2.2H2O 3,68 Elementos traza 2 ml Llevar a ph 7,2 con NaOH Esterilizar en autoclave Antes de usar añadir 5 ml de KH2PO4 1% PEG 25% en solución P.- 1g de PEG (Polietilenglicol 1000) estéril 3ml de solución P Medio R5Xilano.- Para 2 litros: Sacarosa 206 g K2SO4 0,5 g MgCl2.6H2O 20,24g Glucosa 20 g Xilano (de avena) 10 g Casaminoacidos (Difco) 0,2 g Extracto de levadura 10 g Elementos traza 4 ml TES 11,46g H2O hasta 2 litros Ajustar a ph 7,2 con NaOH 5N Añadir 30 g de agar cada uno.esterilizar. Antes de usar, añadir en condiciones esteriles: KH2PO4 (1%) 10ml CaCl2.2H2O (3,68%=0,25M) 80ml L-Prolina (20%) 30ml Medio LB (g/l).- Bactotriptona 10 Extracto de levadura 0,5 NaCl 10 Para LB sólido se añaden 20 g de agar Esterilizar en autoclave. OBTENCION DE DNA PLASMíDICO DE E. coli ("MINIPREPS"): LISIS ALCALINA Desde colonias de E.coli DH5a transformadas con plásmidos que confieren resistencia a Ampicilina. 1.-Picar con palillo estéril una colonia aislada e inocular 1ml de medio 2xYT(+Ampicilina 100µg/ml). Incubar a 37 C en agitación. El crecimiento durante 5 horas suele ser suficiente. 2.-Centrifugar 2-3 minutos (13000rpm). Eliminar el sobrenadante lo mejor posible. 3.-Resuspender las células en 200µl de solución 1 (resuspensión). 4.-Añadir 200µl de solución 2 (lisis). Mezclar por inversión. 5.-Añadir 200µl de solución 3 (precipitación). Mezclar por inversión varias veces. Poner en hielo durante 5 minutos. 6.-Centrifugar durante 5 minutos (13000rpm) a temperatura ambiente. 7.-Transferir el sobrenadante (~600µl), con cuidado, a un tubo nuevo que ya contenga 380µl de isopropanol. Mezclar. 8.-Centrifugar durante 10 minutos (13000rpm). Eliminar el sobrenadante por completo ( Ojo con el precipitado!). 9.-Añadir 400µl de Etanol 80% (nuevo). Mezclar. Centrifugar de nuevo durante 3-5 minutos. Eliminar el sobrenadante por completo ( Ojo con el precipitado!). Secar durante unos 5 minutos (idealmente en estufa a 50 C; 37 puede ser suficiente). 10.-Resuspender y disolver en 80µl de TE. Emplear 10µl para digestion con enzimas de restricción en un volumen final de 30µl. SOLUCIONES Medio 2xYT (para 1l).- Bactotriptona, 10 g; Extracto de levadura, 10 g; NaCl, 5 g. Esterilizar en autoclave. Solución 1.- Tris.HCl 50 mm, EDTA 10 mm, ph 7,5. Solución 2.- NaOH 0,2N, SDS 1%. Solución 3.- Acetato Potásico 3M, ph 4,8. Isopropanol 100%, Etanol 80% TE.- Tris.HCl 10 mm, EDTA 1 mm, ph 7,5. 3

DIGESTIóN CON ENZIMAS DE RESTRICCIóN PROCEDIMIENTO 1.- En un eppendorf añadir: 10 µl de DNA plamídico. 20 µl de mezcla de digestión: Contiene Tampón de enzima (10x, comercial): TrisHCl 10 mm MgCl2 10 mm KCl 100 mm BSA 0,1 mg/ml Enzima: PstI, 0,5 µl Sol. Stock: 8 U/ µl H2O estéril 2.- Incubar 2 horas a 37 C. 3.- Añadir a la mezcla 3 µl de tampón de carga de electroforesis: Contiene TrisHCl/EDTA Azul de Bromofenol Glicerol ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA PROCEDIMIENTO 1.-Montar el gel: Solución de agarosa al 1% en TAE (Tris-Acetato 40 mm/edta 4 mm) con Bromuro de Etidio (0,5 µg/ml) 2.-Cargar las muestras en los pocillos junto a marcadores de tamaño conocido. 3.-Desarrollar la electroforesis a aprox. 80 volts. 4.- Observar mediante transiluminador de luz ultravioleta 4

ANALISIS DE LAS PROTEINAS DEL SOBRENADANTE DE CULTIVO DE LOS TRANSFORMANTES OBTENIDOS Los transformantes de S. lividans portadores de los plásmidos phjl401 o pprt4 fueron cultivados en medio líquido (YES+ Xilano 0,5%+ tioestreptona 5µg/ml) durante 3 días. Los correspondientes sobrenadantes de cultivo se obtuvieron por centrifugación a 10.000 rpm durante 30 minutos (para eliminar las células) y posteriormente fueron clarificados por filtración a través de membranas de fibra de vidrio. Estos sobrenadantes contienen las proteínas secretadas al medio de cultivo, entre ellas el producto de expresión del gen xysa (la xilanasa Xys1). Para analizar estos sobrenadantes mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes ("SDS-PAGE") es preciso primero concentrar el contenido para que la cantidad de proteína presente pueda ser detectada con la tinción que se usará posteriormente (Coomasie R-250). Para ello se precipitarán con ácido tricloroacético(10% final). Luego, las proteínas precipitadas se disolverán en un pequeño volumen de solución de carga para electroforesis desnaturalizante, se cargarán en geles de poliacrilamida (15%) y se separarán mediante aplicación de un campo eléctrico de intensidad constante (30 ma). Tras ello, los geles se teñirán para ver las proteínas separadas, o bien se transferirán a un soporte sólido (membrana de PVDF, Immobilon ) para su posterior análisis mediante anticuerpos policlonales obtenidos frente a Xys1 ("Western Blot"). ELECTROFORÉSIS DESNATURALIZANTE DE PROTEINAS (SDS-PAGE) INTRODUCCION Toda molécula cargada situada en un campo eléctrico se desplazará hacia uno u otro electrodo en función de su densidad de carga (relación entre carga y masa). Las proteínas son moléculas cargadas y por tanto, susceptibles de desplazarse en un campo eléctrico. En este apartado revisaremos brevemente el método de separación de proteínas en gel de poliacrilamida. Un gel de poliacrilamida es un soporte sólido en el que se aplica una muestra problema (en nuestro caso sobrenadante de cultivo) más o menos compleja y en el que quedan separadas en bandas discretas las proteínas que la constituyen. En este caso consideraremos únicamente separaciones en una dimensión del gel, y bajo condiciones desnaturalizantes. COMPOSICION DEL GEL Un gel de poliacrilamidase forma como consecuencia de la polimerización de monómeros de acrilamida (ACRI) en cadenas largas unidas entre sí, constituyendo una red por medio de unidades de bisacrilamida (BIS). Ambos componentes son reactivos de alto grado de pureza que, en condiciones controladas, permiten obtener un polímero sintético de estructura reproducible. El gel es químicamente inerte, estable en un amplio rango de ph, temperatura y fuerza iónica y, además, transparente. La polimerización se inicia por la adición del persulfato amónico (APS) y se desarrolla más rápidamente al incluir TEMED en la mezcla. En función del peso molecular de las proteínas que se analizarán, es posible preparar geles con diferentes porcentajes de ACRI y/o BIS. Al incrementar el porcentaje de ACRI (siendo constante el porcentaje de BIS) se obtienen geles con tamaño de poro cada vez menor, por lo que, a modo de ejemplo, se separaría bien una proteína de 300 kda en un gel del 7.5 %, y una de 3 kda en un gel del 20 ó 25 %. CONDICIONES DESNATURALIZANTES La muestra de proteína se desnaturaliza al calentarla a 100 C en presencia de un agente desnaturalizante (SDS, dodecil 5

sulfato sódico, detergente iónico) y de un reductor de grupos disulfuro (DTT, ditiotreitol). En estas condiciones las proteínas quedan disociadas en los monómeros que las forman. Además, todas las proteínas quedan cargadas negativamente, de forma que la densidad de carga es prácticamente idéntica en todas ellas: en estas condiciones, al separarse en un campo eléctrico, migrarán en función de su masa. Se puede determinar el peso molecular (PM) de cada polipéptido refiriéndolo a la movilidad de otros de masa molecular conocida, que serán separados en idénticas condiciones (marcadores de peso molecular). SISTEMAS CONTÍNUOS Y DISCONTÍNUOS Si en una electroforesis la muestra, el gel y los electrodos tienen el mismo tampón o buffer, se denomina sistema de buffer continuo y la muestra se aplica directamente en un gel de características homogéneas que funciona como gel de separación. En un sistema de buffer discontinuola composición de las soluciones tamponadoras o su ph (y en general ambos) es diferente en los distintos componentes del sistema. La ventaja del segundo método es que permite trabajar con volúmenes de muestra mayores y concentraciones de proteína muy bajas, para así obtener geles de alto grado de resolución. Esto es debido a que las proteínas son "empaquetadas" en zonas estrechas durante su migración a través de un gel de tamaño de poro grande (gel de empaquetamiento) antes de separarse en un gel de tamaño de poro menor (gel de separación). Además de los diferentes porcentajes de ACRI de ambos geles, son factores fundamentales la composición de los tampones y su ph (ver composición). ELECTROFORÉSIS La electroforesis se desarrolla en buffer Tris-Glicina-SDS (ver composición). Con este tampón se rellenan los reservorios del ánodo y del cátodo. A continuación se aplica una corriente constante de 30 ma/gel hasta 5 minutos después de que el frente azul salga de la base del gel. MARCADORES DE PESO MOLECULAR Se emplearán marcadores de bajo peso molecular: 97.4, 66.2, 45, 31, 21.5 y 14.4 kda. TINCION DEL GEL Una vez finalizada la electroforesis pueden utilizarse distintos métodos de tinción para revelar las proteínas. Un aspecto común a todos ellos es fijar las proteínas al gel para evitar que difundan durante su manipulación. En nuestro caso, se utiliza una solución de azul de Coomassie R-250 (0.25% en metanol:acético:agua [5:1:4]), que fija y tiñe en un solo paso. El resultado final es un gel completamente teñido que tiene que ser lavado con la misma solución pero sin colorante, para quitar el exceso de éste, de modo que el fondo del gel sea transparente y aparezcan teñidas únicamente las bandas de proteína. La sensibilidad de esta tinción no es muy alta y permite detectar bandas que contengan alrededor de 0.2-0.5mg. 6

INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS Las proteínas son moléculas antigénicas susceptibles de ser reconocidas por anticuerpos concretos. Este reconocimiento es específico y con mayor o menor afinidad dependiendo de la naturaleza tanto del antígeno como del anticuerpo. Al ser específicos, los anticuerpos permiten detectar de manera selectiva los antígenos (proteínas) contra los que se ha producido. En este principio se basa la inmunodetección: las proteínas de una determinada muestra (sobrenadantes de cultivo en nuestro caso) se separan en SDS- PAGE y, seguidamente, son transferidas a un soporte sólido (membrana de Immobilon TM ) para que el anticuerpo deseado detecte selectivamente las proteínas contra las que se produjo. De esta manera, la presencia de la proteína estudiada puede ser seguida cualesquiera que sean las condiciones de cultivo. TRANSFERENCIA A MEMBRANA DE IMMOBILON Con el fin de que las proteínas queden expuestas y, que dispongamos de un soporte manejable para las posteriores manipulaciones, la muestra separada en el SDS-PAGE es transferida sobre una membrana de Immobilon TM empleando un campo eléctrico semejante al de la electroforesis. INMUNODETECCIÓN Tras un bloqueo para evitar el reconocimiento inespecífico, se permite que el anticuerpo deseado localice sus antígenos correspondientes sobre la membrana transferida. Los anticuerpos no unidos son retirados mediante lavados. Para saber dónde se ha producido la unión antígeno-anticuerpo, se incuba con un segundo anticuerpo capaz de reconocer al primero, y que lleva unida fosfatasa alcalina. De nuevo, los anticuerpos libres son lavados. Las bandas antigénicas se hacen visibles cuando la fosfatasa alcalina conjugada al segundo anticuerpo hidroliza un compuesto incoloro (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phospate, BCIP); lo que, a su vez, provoca la precipitación de un segundo sustrato (Nitro Blue Tetrazolium, NBT) que se observa como una mancha de color violáceo en esa localización. PROCEDIMIENTO PREPARACION DE LA MUESTRA 1.- A 500 µl de sobrenadante de cultivo ( =vector, = pprt4) añadir 55 µl de TCA 100%, mezclar y poner en hielo durante 15 minutos. 2.- Centrifugar durante 15 minutos a 13.000 rpm y eliminar el sobrenadante por completo. Añadir 500 µl de solución diluida de TCA (0,2%), mezclar y centrifugar de nuevo durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante por completo. 3.- Resuspender el precipitado en 50 µl de solución de carga de electroforesis, agitando en vortex. Centrifugar durante 1 minuto para llevar todo al fondo del tubo. DESARROLLO DE LA ELECTROFORÉSIS 1.- Hervir las muestras durante 10 minutos. No olvidar los marcadores de PM y preteñidos!. Centrifugar 2 minutos (13.000 rpm). 2.- Ajustar si es necesario el ph de la muestra con NaOH 0,2N (1, 2, 3 µl... hasta que el color de la solución sea azul intenso= ph básico). 3.- Cargar 10 µl por carril (tanto para los geles que serán teñidos como para los que serán transferidos) en los geles previamente ensamblados. 4.- Rellenar los reservorios del ánodo y del cátodo con tampón de carrera, y desarrollar la electroforesis a 30 ma por gel hasta 5 7

minutos después de que el frente llegue al borde inferior. 5.- Desmontar los soportes y poner los geles bien a teñir en solución de Coomasie R-250, o bien a lavar en buffer de transferencia, para posteriormente transferirlo a membrana Immobilon (ver más adelante). 6.- Desteñir el fondo de los geles teñidos en la misma solución anterior (sin colorante). 7.- Observar bandas de proteína y secar los geles entre láminas de celofán. TRANSFERENCIA A MEMBRANA IMMOBILON 1.- Mojar la membrana en metanol (10") y sumergirla en buffer de transferencia. Lavar los geles (apartado 5 anterior) en buffer de transferencia durante 5 minutos. Ensamblar los componentes de la transferencia según Figura 1. Evitar las burbujas de aire entre las diversas capas del sistema. Recordar poner el gel hacia la cara hidrofóbica de la membrana. 2.- Llenar la cubeta con buffer de transferencia. Introducir el bloque de refrigeración pasiva (Bio-Ice). Aplicar corriente eléctrica (250 ma) durante 1 hora. 3.- Desmontar el conjunto y poner la membrana en H2O destilada unos minutos. Secarla entre papel de filtro. Al día siguiente se procederá a la detección con anticuerpos anti-xys1. FIGURA 1 soporte rojo o blanco + soporte negro - esponja filtros(2) membrana gel filtros(2) esponja 8

INMUNODETECCION 1.- Rehumedecer la membrana con metanol (10"). 2.- Bloquear con 25 ml de 1% seroalbúmina bovina (BSA) en TBST (ver soluciones) durante 10 minutos. 3.- Reemplazar la solución anterior por una dilución (1:50.000) del anticuerpo policlonal anti-xys1 en TBST (50 ml), e incubar en agitación durante 15 minutos. 4.- Retirar el primer anticuerpo y hacer 3 lavados (2 minutos cada uno) con TBST. 5.- Incubar con el segundo anticuerpo (anti-fc rabbit; 1:7500 en TBST, 50 ml) durante 15 minutos en agitación. 6.- Realizar 3 nuevos lavados (2 minutos cada uno) con TBST. 7.- Hacer 2 últimos lavados con TBS (para retirar el Tween 20). 8.- Revelar con la solución de revelado (5 ml), agitando hasta que aparezcan bandas violáceas. 9.- Detener la reacción de color sumergiendo la membrana en H2O destilada. 10.- Secar la membrana entre papel de filtro. SOLUCIONES MEDIO YES: Extracto de levadura 1%; glucosa 1%; ph 7.2. TAMPON DE CARGA (4X) - Tris HCl 250 mm ph 6.8 - DTT 50 mm - SDS 8 % - Glicerol 40 % - Azul de Bromofenol 0.05% COMPOSICION DE LOS GELES (para 2 geles) Gel de separación Gel de empaquetamiento ACRI:BIS 30:0.8 5.0 ml 0.65 ml TrisHCl (1.5M ph 8.8) 2.5 ml (0.5M ph 6.8) 1.25 ml Agua destilada 2.5 ml 3.10 ml --------- ----------- TOTAL 10 ml 5 ml Estas soluciones se proporcionarán ya mezcladas A las soluciones anteriores, añadir: SDS 10 % 100 ml 50 ml APS 10 % 50 ml 25 ml TEMED 5 ml 5 ml BUFFER DE CARRERA: 3g de Tris-base, 14.4 g de glicina y 1 g de SDS en 1 l de agua destilada. SOLUCIONES PARA TINCION DE GELES: 0,25% Azul de Coomasie R-250 en Metanol:Acético:Agua (5:1:4). La solución para desteñir es la misma pero sin el colorante. BUFFER DE TRANSFERENCIA: 20mM CAPS; 10% metanol; ph11. TBST: 10mM Tris-HCl, ph 8.0; 150mM NaCl; 0.05% Tween 20. TBS: 10mM Tris-HCl, ph 8.0; 150mM NaCl. BUFFER FOSFATASA ALCALINA: 100mM Tris-HCl, ph 9.5; 100mM NaCl; 5mM MgCl2. SOLUCION DE REVELADO: 5 ml buffer fosfatasa alcalina conteniendo 33 µl NBT (50 mg/ml en 70% dimetilformamida) y 41 µl de BCIP (20 mg/ml en agua). 9

10