Facultad de Medicina Genética 1 er Curso SECCIÓN I - INTRODUCCIÓN Tema 1. TÉCNICAS BÁSICAS DE GENÉTICA MOLECULAR Facultad de Medicina Genética 1 er Curso TEMA 1 TÉCNICAS BÁSICAS DE GENÉTICA MOLECULAR 1.1 Tecnología del ADN recombinante. 1.2 Enzimas de restricción. 1.3 Hibridación de ácidos nucleicos. PCR. Secuenciación del ADN. 1
1.1 Tecnología del ADN recombinante Apartados Clonación de ADN Vectores de clonación Vectores de expresión Fago lambda ( ) Cósmidos Aplicaciones de la clonación de ADN EcoRI EcoRI Tecnología del ADN recombinante Clonación de ADN Tet r EcoRI Strep r /Sulf r ADN Ligasa EcoRI Diagrama esquemático del primer experimento de clonación por Boyer y Cohen EcoRI EcoRI Transformar bacterias Tet r /Strep r 2
Tecnología del ADN recombinante Vectores de clonación Plásmido pbr322, donde se aprecian: (a) (b) (c) Sitios de restricción Genes de resistencia a antibióticos origen de replicación Tecnología del ADN recombinante Vectores de clonación Clonación de ADN foráneo mediante los extremos cohesivos del sitio PstI de pbr322. Notar que el ADN foráneo rompe el gen de resistencia a ampicilina Tet r /Amp s 3
Tecnología del ADN recombinante Vectores de clonación puc18 puc19 Estructura del plásmido puc18/19, mostrando detalles De los sitios de clonación multiple (Polilinkers) Los MCSs mantienen la pauta de lectura del gen de la -galactosidasa Tecnología del ADN recombinante Vectores de expresión MCS 4
Tecnología del ADN recombinante Vectores de expresión lacz reporter en un embrión de ratón de 11.5 días GFP reporter en ratones adultos Tecnología del ADN recombinante Fago lambda ( ) Bacteriófagos: virus que infectan bacterias. Constan de un genoma de ác. nucleicos dentro de una envoltura proteica de protección llamada cápside. Ciclos de infección. Ha sido adaptado para usarlo como vector de clonación. Ventaja: el tamaño de los Ventaja: el tamaño de los fragmentos que pueden clonarse es mayor que en los plásmidos (10-20kb) 5
Tecnología del ADN recombinante Cósmidos Estos vectores combinan características de plásmidos - sitio de clonación multiple y resitencia a antibióticos- así como de fagos secuencias cos, responsables del empaquetamiento del fago en la cápside-. Pueden clonarse 40-50kb. YAC Tecnología del ADN recombinante YAC YAC: Yeast Artificial Chromosome Cromosoma artificial de levadura Pueden clonarse 300kb-1Mb. 6
Tecnología del ADN recombinante Aplicaciones Importantes contribuciones a muchas áreas de investigación: identificación de genes implicados en enfermedades construcción de mapas genómicos producción de proteínas recombinantes creación de organismos modificados genéticamente. Objetivos Clonación de ADN 1.1 Tecnología del ADN recombinante (I) Esta técnica permite aislar y copiar secuencias de ADN individuales a partir de mezclas complejas permitiendo el análisis detallado y la manipulación. El ADN a clonar se recombina con un vector y se introduce en las células huésped donde se copia. El vector recombinante se purifica de cultivos de células huésped y el ADN clonado puede recuperarse para su análisis. Vectores de clonación Vectores de expresión Son moléculas de ADN circular pequeñas encontradas en bacterias y que se usan como vectores de clonación. Los plásmidos se purifican fácilmente y confieren resistencia a antibióticos al huésped permitiendo la fácil identificación de recombinantes. Otro sistema de selección consiste en la ruptura del gen lacz por inserción de ADN extraño. Se han desarrollado muchos vectores que permiten la expresión de genes dentro de insertos clonados mediante transcripción regulada por un fuerte promotor en el vector. En algunos casos, p. ej. utilizando vectores de expresión T7, una gran proporción de la proteína total en las células E.coli puede consistir en el producto deseado. Fago lambda ( ) El bacteriófago, que infecta E. coli, ha sido adaptado como un vector de clonación. La porción central se reemplaza con ADN ajeno. El ADN recombinante del fago se empaqueta in vitro en cápsides que infectan E. coli produciendo áreas claras en las placas de agar. Se utilizan para construir librerías genómicas 7
1.1 Tecnología del ADN recombinante (y II) Objetivos Cósmidos Son similares a los plásmidos, pero contienen secuencias cos de fago posibilitando empaquetarse en cápsides. Los cósmidos infectan E. coli y se replican. Pueden acoger ADNs largos de 40-50kpb. Aplicaciones de la clonación de ADN Esta técnica ha hecho importantes contribuciones a muchas áreas de investigación en biología.: identificación de genes implicados en enfermedades; construcción de mapas genómicos; producción de proteínas recombinantes, creación de organismos modificados genéticamente. 1.2 Enzimas de restricción Apartados Endonucleasas Secuencias de reconocimiento Extremos cohesivos Electroforesis en gel de agarosa Mapas de restricción 8
Enzimas de restricción Endonucleasas Las endonucleasas de restricción se identificaron en los años 60-70. Fue el paso clave para poder clonar ADN. Los sistemas de restricción-modificación se dan en muchas bacterias, constituyendo un mecanismo de defensa contra la introducción de ADN extraño. Consta de dos componentes: - endonucleasa de restricción reconoce una secuencia corta simétrica de ADN y corta el ADN en cada hebra en un sitio específico dentro de esa secuencia. - metilasa añade un grupo metil a una base C o A dentro de la misma secuencia de reconocimiento en el ADN celular. Esta modificación convierte al ADN en resistente a la degradación por endonucleasas Secuencias de reconocimiento Los enzimas reconocen una secuencia palindrómica entre 4-8 pb, dando lugar a fragmentos de restricción de doble cadena con extremos salientes en 5 /3 o romos Extremos cohesivos Los extremos con salientes son cohesivos, de modo que pueden ligarse diferentes ADNs si presentan los mismos extremos Secuencias de reconocimiento Enzimas de restricción y Extremos cohesivos caccgtggaattcacgaacaa gtggcaccttaagtgcttgtt EcoRI acaacgagaattcctttatc tgttgctcttaaggaaatag EcoRI caccgtgg OH gtggcaccttaa P P AATTCacgaacaa HO Gtgcttgtt acaacgag OH tgttgctcttaa P P AATTCctttatc HO Ggaaatag ligasa + ATP caccgtggaattcctttatc gtggcaccttaaggaaatag ligasa + ATP acaacgagaattcacgaacaa tgttgctcttaagtgcttgtt 9
Enzimas de restricción Extremos romos caccgtgg gtggcaccttaa AATTCacgaacaa Gtgcttgtt DNA pol + dntps caccgtggaatt AATTCacgaacaa gtggcaccttaa TTAAGtgcttgtt ligasa + ATP caccgtggaattaattcacgaacaa gtggcaccttaattaagtgcttgtt Enzimas de restricción Secuencias de reconocimiento De Sphaerotilus species 10
Enzimas de restricción Electroforesis en gel de agarosa Enzimas de restricción Electroforesis en gel de agarosa 11
Enzimas de restricción Electroforesis en gel de agarosa - La agarosa es un polisacárido derivado de algas marinas, que forma un gel sólido cuando se disuelve en soluciones acuosas a concentraciones entre 0.5 y 2% (w/v). Aplicando un campo eléctrico al gel en una solución conductora de electricidad, los fragmentos de ADN migran a través del gel hacia el electrodo positivo, dependiendo del tamaño y forma. + ElADNsetiñeconbromuro de etidio y se visualiza por luz UV como una banda naranja. Enzimas de restricción Electroforesis en gel de agarosa - + 10 8 6 4 3 2 1.5 1.4 1.0 0.7 0.5 0.7 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.05 3% 0.6% 10 8 6 4 3 2 1.5 1.4 1.0 0.7 0.5 12
Enzimas de restricción Mapas de restricción Enzimas de restricción Mapas de restricción 13
Enzimas de restricción Mapas de restricción 6 kb 11 kb 5 kb 12 kb H 4 kb 5 kb P PstI 9 kb 8 kb 1 kb P H 7 kb H 5 kb 7 kb PstI 5 kb 12 kb HindIII-A 11 kb HindIII-B 6 kb PstI-A 12 kb PstI-B 5 kb P 4 kb 1 kb H P 7 kb 4 kb 5 kb 1 kb 7 kb 5 kb 4 kb 1 kb MAPA FÍSICO DE UN ADN DESCONOCIDO Objetivos Endonucleasas 1.2 Enzimas de restricción Son enzimas bacterianos que cortan (hidrolizan) ADN en determinados fragmentos y de modo reproducible. En la bacteria forman parte del mecanismo de defensa restricción-modificación contra ADN extraño. Son los instrumentos básicos de la clonación génica. Secuencias de reconocimiento Los enzimas de restricción cortan el ADN simétricamente en ambas cadenas en secuencias de reconocimiento palindrómicas, dejando libres un 5 -P y un 3 -OH. Dejan extremos romos o sobresalientes. Extremos cohesivos Los extremos de cadena simple producidos por las enzimas de restricción son cohesivos, ya que pueden volverse a unir por emparejamiento de bases a cualquier otro fragmento con extremos complementarios. Electroforesis en gel de agarosa Los geles de agarosa separan el ADN lineal en base a su tamaño, por migración del ADN a través de su matriz bajo la influencia de un campo eléctrico. Mapas de restricción Mediante restricción con endonucleasas solas o en combinación, se puede construir un diagrama, mapa de restricción, de la molécula indicando los sitios de corte y los tamaños de los fragmentos 14
1.3 Hibridación de ácidos nucleicos. PCR. Secuenciación del ADN Hibridación: id ió proceso por el que dos cadenas de ácidos nucleicos que son complementarias se unen para dar una molécula bicatenaria. La hibridación puede ser ADN-ADN, ADN-ARN. Hibridación de ácidos nucleicos Desnaturalización térmica 15
Hibridación de ácidos nucleicos Renaturalización La renaturalización tiene lugar enfriando la solución de ADN Enfriamiento rápido sólo permite la formación de regiones locales de doble cadena formadas por la unión de regiones cortas complementarias Enfriamiento lento permite la complementariedad completa de las cadenas de ADN, ya que da tiempo a que cada cadena encuentre a la otra La renaturalización de regiones complementarias entre cadenas de ácidos nucleicos diferentes se llama hibridación electroforesis pocillos para Cargar la muestra Fragmentos de ADN Separados por tamaño Gel de agarosa transferencia papel membrana Gel mecha Hibridación de ácidos nucleicos Southern Esta fue la primera técnica analítica basada en la hibridación de ácidos nucleicos, desarrollada por Ed Southern (Oxford). Se utiliza para analizar la estructura de los genes. Pasos: 1 extracción de ADN 2 Digestión con enzimas de restricción 3 Electroforesis 4 Transferencia 5 Hibridación 6 - Autorradiografía hibridación membrana autorradiografía híbridos (emiten radiación) Bandas correspondientes a los fragmentos hibridados Película de rayos X 16
Hibridación de ácidos nucleicos Southern Hibridación de ácidos nucleicos Southern ADN teñido con bromuro de etidio Autorradiografía con una sonda hibridada 17
PCR Apartados Principio Componentes Cómo trabaja Aplicaciones PCR Principio Copiar y amplificar secuencias específicas de ADN miles de millones de veces en una simple reacción enzimática. 18
PCR Componentes Cuatro componentes fundamentales: 1) ADN molde conteniendo la secuencia de ADN a ser amplificada 2) cebadores oligonucleótidos: forward y reverse 3) ADN polimerasa: Taqpolimerasa 4) dntps: datp, dctp, dgtp, dttp PCR Cómo trabaja Ver animación PCR. 19
PCR Aplicaciones Detección de alteraciones genéticas que causan enfermedades. Procesos de clonación del ADN. Secuenciación de ADN. Cualquier procedimiento que requiera mayor cantidad de ADN específico que la que es posible obtener del material de partida. RT-PCR: ADN complementario. Cuantificación de la expresión de un gen: RT-PCR + PCR-Q. ADN complementario PCR Aplicaciones Existe un tipo de virus cuyo genoma está formado únicamente por ARN. Para propagarse ha de transcribirse en sentido contrario: ARN ADN. Son los retrovirus. Posteriormente el ADN se replica y actúa como molde para nuevo ARN vírico. íi La enzima que cataliza la reacción de ARN a ADN se denomina transcriptasa inversa. Esta enzima es importante en biología molecular, porque permite aislar rápidamente las regiones codificantes de un gen. Si extraemos ARNm de un tejido, podemos sintetizar una cadena de ADN complementario (ADNc) mediante la transcriptasa inversa. ADNc es de cadena simple y puede obtenerse doble cadena mediante la PCR. Este ADNc corresponde a los genes que estaban activos cuando se extrajo el tejido. Como el ARNm maduro sólo contiene exones, el ADNc equivale a los genes sin intrones. 20
ADN complementario PCR Aplicaciones - Utilidad en los microarrays Secuenciación del ADN 21
Secuenciación Secuenciación Método de secuenciación de ADN mediante el protocolo de didesoxi nucleósido trifosfatos (ddntp) (Sanger). base base dntp 3 2 OH H H 3 2 H ddntp dntp 5 base 5 base 3 2 3 2 OH H OH H dntp 22
Secuenciación Basado en la reacción de la ADN polimerasa Cuatro reacciones separadas Cada mezcla de reacción contiene datp, dgtp, dctp y dttp, uno de los cuales está marcado con P 32 Cada reacción también contiene una pequeña cantidad de un didesoxinucleótido: ddatp, ddgtp, ddctp o bien ddttp Secuenciación Método de terminación de cadena La mayoría de las veces, la polimerasa utiliza nucleótidos normales y el ADN se sintetiza con normalidad Ocasionalmente, la polimerasa utiliza un didesoxinucleótido, el cual se añade a la cadena inhibiendo la unión de más nucleótidos en esa cadena La adición ió al azar de dd-nucleótidos deja (idealmente) al menos unas pocas cadenas terminadas en cada posición de nucleótido 23
Secuenciación de ADN por el método de Sanger Secuenciación ADN molde (simple cadena) 3 -G A G T G G T C A T A C T G T A-5 Secuencia ADN sintetizada (codificante) 5 -C T C A C C A G T A T G A C A T-3 - - - A Reacción 1 - - - - - - A +ddatp - - - - - - - - - A 3 - - - - - - - - - - - - A - - - - - - - - - - - - - - A - T Reacción 2 - - - - - - - - T +ddttp - - - - - - - - - - T - - - - - - - - - - - - - - - T Reacción 3 - - - - - - - G +ddgtp - - - - - - - - - - - G C - - C Reacción 4 5 - - - - C +ddctp - - - - - C - - - - - - - - - - - - - C manual automática Secuenciación 24
Secuenciador automático Secuenciación 1.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa: PCR (I) Objetivos Principio La PCR permite copiar y amplificar secuencias específicas de ADN millones de veces en una simple reacción enzimática. Componentes Cuatro componentes fundamentales: ADN molde conteniendo la secuencia de ADN a ser amplificada; 2) cebadores oligonucleótidos; 3) ADN polimerasa; 4) dntps Cómo trabaja El ADN es amplificado en 20-40 ciclos de síntesis de ADN. Cada ciclo tiene tres pasos que se llevan a cabo a diferentes temperaturas: 1) desnaturalización: 90-95ºC; 2) hibridación: 40-60 ºC; 3) extensión: 72ºC. Cada molécula de ADN sintetizada actúa como molde para las siguientes reacciones, de modo que ésta aumenta exponencialmente en los sucesivos ciclos. Aplicaciones Extensivamente para el estudio de genes. Ha contribuido mucho al estudio de enfermedades hereditarias y en la investigación del cáncer. También tiene aplicaciones prácticas como diagnóstico de enfermedades hereditaras, medicina forense y biotecnología. 25
1.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa: PCR (y II) Objetivos Retrovirus Virus cuyo genoma está formado únicamente por ARN. Para propagarse su ARN debe transcribirse en sentido contrario: ARN ADN. Posteriormente el ADN se replica y actúa como molde para nuevo ARN vírico. Transcriptasa inversa Enzima que cataliza la reacción de ARN a ADN. Esta enzima es importante en biología molecular, porque permite aislar rápidamente las regiones codificantes de un gen. ADN complementario ADNc: Se sintetiza mediante la transcriptasa inversa a partir de ARNm extraído de un tejido. Es de cadena simple y puede obtenerse doble cadena mediante la PCR. El ADNc equivale a los genes sin intrones. 26