GANGLIO CENTINELA Y CANCER DE MAMA Papel del Patólogo

GANGLIO CENTINELA Y CANCER DE MAMA Papel del Patólogo Francesc Tresserra Servicio de Anatomía Patológica y Citología Comité de Ginecología Oncológica y Mastología HOSPITAL UNIVERSITARIO QUIRON DEXEUS

DETECCION DE METASTASIS AUTOR TECNICA TINCION DETECCION OBSERVACIONES Saphir 1948 Secciones seriadas H&E 10/30 (33%) Pickren 1961 Secciones seriadas. H&E 21/97 (22%) Intervalo 12 Fisher 1978 Secciones seriadas. Intervalo 5 H&E 19/78 (24%) 53% Subcapsulares 47% Parenquimatosas Wilkinson 1982 Revisión láminas Secciones seriadas H&E 89/525 (17%) 20% en la revisión 80% en la re-seccion Wells 1984 Rutina IH (3Ac) 7/45 (16%) Sobre todo en lobulillares Bussolati 1986 Rutina HE 5/50 (10%) Sobre todo en lobulillares IH (3Ac) 12/59 (20%) Trojani 1987 Rutina IH (5Ac) 21/150 (14%) Sobre todo en lobulillares Bryne 1987 Re-tinción IH (1Ac) 4/40 (10%) Elson 1993 Secciones seriadas. Intervalo 5 H&E 20/97 (21%) 9% no se vieron con H&E IH (2Ac) Nasser 1993 5 Secciones, una cada 150 H&E IH 50/159 (31%) 56% en H&E y IH 44% Sólo en IH McGuckin 1996 4 Secciones, una cada una cada 100 IH 53/208 (25%) 53% Subcapsulares 25% parenquimatosas 23% ambas (Dowlatshahi y col., 1997)

CLASIFICACION Celulas Tumorales Aisladas Grupo de células de no más de 0.2 mm, o menos de 200 cel. Micrometástasis entre 0.2 y 2mm, o más de 200 cel. Metástasis mayor de 2 mm

CELULAS TUMORALES AISLADAS HEMATOXILINA-EOSINA INMUNOHISTOQUIMICA

CLASIFICACION pn0: No metástasis PN1/mic: Metástasis / Micrometástasis pn0 (i-): No metástasis pn0 (i+): CTA pn0 (mol-): No metástasis pn0 (mol+): CTA Estudios Morfológicos (H&E, IHQ...) Estudios no Morfológicos (PCR, citometría de flujo,...) CTA: Células Tumorales Aisladas. (gc) si es el ganglio centinela

GANGLIO CENTINELA: PRINCIPIO... Las células que se desprenden del tumor primario, llegan y colonizan el primer ganglio que recibe la linfa del área mamaria afectada. Si el ganglio centinela puede identificarse y el examen histopatológico no demuestra la presencia de células neoplásicas, el resto de los ganglios linfáticos axilares estarán libres de metástasis... (Galimberti y col., 1998)

ECOGRAFIA AXILAR FORMA HILIO CORTICAL P < 0.001 Sens.: 84% (70-93) Esp.: 84% (76-90) VPP: 68% (54-79) VPN: 93% (86-97) Efic.: 85% (77-90)

Houssami N. Cancer Biol Med 2014;11:69 ECOGRAFIA AXILAR + PAAF Metanálisis 21 estudios con 4.313 pacientes. Ecografía sólo: Sensibilidad: 61.4% (51.2-79.4) Especificidad: 80% (76.9-89.0) Ecografía y PAAF: Sensibilidad: 79.4% (68.3-88.9) Especificidad: 100% (100-100)

ESTUDIO ANATOMOPATOLOGICO BISECCION DEL GANGLIO EXAMEN EN FRESCO

ESTUDIO ANATOMOPATOLOGICO MACROSCOPIA: NEGATIVA: Estudio definitivo. POSITIVA: Corte por congelación.

ESTUDIO ANATOMOPATOLOGICO INCLUSION EN PARAFINA CORTE URGENTE CON HEMATO- XILINA EOSINA

ESTUDIO ANATOMOPATOLOGICO H&E H&E IH H&E H&E IH H&E H&E IH H&E H&E 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 IH H&E H&E IH H&E H&E IH H&E H&E H&E 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

ESTUDIO ANATOMOPATOLOGICO IH IH IH IH Cont Res 3 6 9 12 15 18 AE1/AE3 CAM 5.5 KL1 EMA HMFG-1/2 E29 CEA BC2/BC3 3E1.2 CK19

ESTUDIO ANATOMOPATOLOGICO N. CASOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 % láminas + 29 100 1 67 1 14 1 38 1 33 1 23 1 14 1 28 1 5 2 24 2 19 1 14 3 10 2 5 2 5 3 5 52 Ganglios Centinela Positivos. Hematoxilina-eosina IHQ

Hematoxilina-Eosina Lámina 1 Lámina 3 Lámina 5

IHQ Lámina 8 Lámina 9 Lámina 10 Lámina 13 Lámina 12

Lámina 12 Lámina 11

ESTUDIO ANATOMOPATOLOGICO 320 GANGLIOS CENTINELAS EN 190 PACIENTES (5 años) (31 de la cadena mamaria interna). 90 CON METASTASIS (28%) (8 de la cadena mamaria interna). 63 Metástasis 2 mm (70%). 31 Células tumorales aisladas. 32 Micrometástasis. 27 Metástasis (30%) ( : 8.6 9 mm; 2.2 15 mm). Incidencia de metástasis 2 mm en pacientes con ganglio centinela 63/90 (70%) Incidencia de micrometástasis en 4 años sin ganglio centinela: 8.5%

ESTUDIO ANATOMOPATOLOGICO GNC - GNC + Total GC - 65 1 66 (51%) GC + 51 13 64 (49%) Total 116 (89%) 14 (11%) 130 GC: Ganglio Centinela. GNC: Ganglio No Centinela 130 casos de los 190 con linfadenectomía axilar.

* Se incluyen 8 casos de CTA sin linfadenectomía. ESTUDIO ANATOMOPATOLOGICO 72 PACIENTES CON GANGLIO CENTINELA POSITIVO 59* pacientes en las que el (los) ganglio centinela fue el único metastásico (82%) y 44 de ellos fueron metástasis 2 mm (24 células tumorales aisladas). 13 pacientes en las que el número de ganglios positivos además del centinela osciló entre 1 y 6. 116 Pacientes con metástasis ganglionares (3 años). 28 pacientes con un solo ganglio metastásico (24%) (p < 0.001).

ESTUDIO ANATOMOPATOLOGICO En 13 casos había más ganglios afectados y en 9 de ellos cambió la estadificación 3 pn1mi cambió a pn1a 1 pn1mi cambió a pn2a 5 pn1a cambió a pn2a Un caso de pn0(i-)gc resulto pn1a

ESTUDIO ANATOMOPATOLOGICO CUANTOS CORTES SON NECESARIOS? 2 separados 40 m y con IH. 1 congelación y 5 cortes definitivos (2º y 5º con IH). 6-8 cortes con H&E (IH no de rutina). Múltiples de 5µm a intervalos de 0.5 mm. 1 congelación, 2 con H&E y 6-8 con IH, además 1 fragmento para RT-PCR. 1 corte con HE. Múltiples secciones e IH?. 242 292 264 286 182 132 6 95-97 98-00 01-03 04-06 07-09 10-12 13-14 (sentinel lymph node[title]) AND breast[title]) AND ("1998"[Date - Publication] : "2000"[Date - Publication])

ESTUDIO ANATOMOPATOLOGICO

ESTUDIO ANATOMOPATOLOGICO CORTES ESCALONADOS ENTRE 70 Y 140 MICRAS H&E H&E IH H&E H&E CT 1 2 3 4 5 6

ESTUDIO ANATOMOPATOLOGICO NEGATIVO CTA MICROMETASTASIS METASTASIS TOTAL LARGO 169 (67%) 30 (12%) 27 (11%) 24 (10%) 250 CORTO 47 (72%) 5 (8%) 7 (11%) 6 (9%) 65 TOTAL 216 (68%) 35 (11%) 34 (11%) 30 (10%) 315 NEGATIVO/POSITIVO P= 0,466 CTA/NO CTA P= 0,324 MICROMETASTASIS/NO MICROMETASTASIS P= 0,994 METASTASIS/NO METASTASIS P= 0,928 Goodman S. Arch Pathol Lab Med 2014;138:57. Incrementar el intervalo de sección de 50 a 290micras puede hacer que se pierdan el 17.7% de las micrometástasis. Aunque teniendo en cuenta la supervivencia a 5 y 10 años, las micrometástasis no detectadas con H&E parecen no tener significado pronóstico.

ESTUDIO ANATOMOPATOLOGICO Tras curva de aprendizaje CORTES ESCALONADOS ENTRE 70 Y 140 MICRAS H&E IH H&E 1 2 3

EXAMEN INTRAOPERATORIO Estudio citológico. Impronta. Raspado. Sensibilidad: 52-61% Valor predictivo negativo: 70-80%

EXAMEN INTRAOPERATORIO Estudio mediante cortes por congelación. Sensibilidad: 64-94% Valor predictivo negativo: 76-97%

EXAMEN INTRAOPERATORIO Estudio inmunohistoquimico intraoperatorio. Imagen cedida por la Dra. L. Bernet.

OSNA (One Step Acid Nucleic Amplification) RT-LAMP (reverse-transcrition loop-mediated isothermal amplification) Amplificación del mrna de la CK-19. Aplicable al diagnóstico intraoperatorio. Estudio de la totalidad del ganglio. No permite establecer la ubicación de la metástasis. No permite evaluar la morfología de la lesión.

OSNA (One Step Acid Nucleic Amplification) Expresión de citoqueratina 19: Un 2-3% de tumores la expresan débilmente. Alta proporción de tumores grado III que no la expresan. Alta proporción de triples negativos que no la expresan. Alta proporción de pacientes jóvenes que no la expresan.

OSNA: RESULTADOS POSITIVO: Nº de copias >250/μl. Micrometástasis (+): Nº de copias >250/μl y < 5000/μl. Macrometástasis (++): Nº de copias > 5000/μl. NEGATIVO (-): Nº de copias <250/μl. CTA: Nº de copias >100/μl y < 250/μl. Negativo: Nº de copias <100/μl.

Jimbo K.The Breast 2013;22:1194. OSNA: RESULTADOS Concordancia OSNA vs. Corte Congelado: 88.2%. Concordancia OSNA vs. Corte Definitivo: 88.6%

Bernet L. Rev Senologia Patol Mam 2010;23:3-7. OSNA: RESULTADOS Discordancias atribuibles a sesgo de localización. Falso positivo verdadero debido a una inclusión epitelial benigna.

OSNA: RESULTADOS 18 discordancias. 3 Falsos negativos. 15 Falsos positivos. 7 por defecto de muestreo. Sensibilidad 95.3% Especificidad 97.1%. Visser M. Int J Cancer 2008;122: 2562.

Jimbo K.The Breast 2013;22:1194. OSNA: RESULTADOS Las discordancias entre OSNA con la histología convencional son debidas a un defecto de muestreo o a la baja expresión de ck19 que ocurre en un 2-3% de tumores. El OSNA detecta más metástasis que la histología en tumores no infiltrantes, grado histológico 1, o sin invasión LV.

Ohi Y. Br J Cancer 2012. Doi: 10.1038/bjc.2012.387 (N=742) OSNA: RESULTADOS En un 40-60% de casos el ganglio centinela es el único afectado. Modelos de predicción de afectación axilar. El número de copias de CK19 mrna estudiadas en todo el ganglio centinela, puede predecir la afectación de los ganglios no centinela.

Ohi Y. Br J Cancer 2012. Doi: 10.1038/bjc.2012.387 (N=742) OSNA: RESULTADOS OSNA +: 19.3%(11/57) de GNC positivos. Un 7% con 4 o más ganglios afectados. OSNA ++: 53.4% (39/73) de GNC positivos. Un 27.4% con 4 o más ganglios afectados. El número de copias de CK19 mrna y la afectación linfovascular se correlacionan con la afectación de GNC y en que esta sea de 4 ganglios o más.

Deambrogio C. J Clin Pathol 2014;67:702. OSNA: RESULTADOS Cut-off de 7.700 copias de ck19 mrna para identificación de pacientes con indicación de linfadenectomía axilar. Recomendación SESPM (Consenso valencia 2013): entre 10.000 y 15.000 copias de ck19 mrna

OSNA HISTOLOGIA OSNA General Complejo y subjetivo. Detección de otras lesiones (linfoma ) Solo útil en estadificación Morfología Detectable Indetectable Cuantificación En función de la dimensión En función del número de copias Estadificación Según tamaño del TNM Aproximación semicuantitativa Muestreo Nivel de secciones Examen en su totalidad Protocolo Variable Estandarizado Tiempo 1 o más días 30 60 minutos Cserni G. J Clin Pathol 2012;65:193.

Johnson L. 2013;62:481. SPIO: Superparamagnetic Iron Oxide Depósitos de hierro en: Macrófagos (57%) Libre (23%) No depósitos (20%) Localización Senos linfáticos. Subcapsular. Parénquima. Sólo en el parénquima sano, no en la metástasis. Los depósitos no afectan a la interpretación histológica.

AFECTACION GANGLIONAR Múltiples focos separados: se considera el de mayor tamaño. Múltiples focos con escasa separación: Se considera como un solo foco si la distancia entre ellos es inferior al diámetro del menor.

AFECTACION GANGLIONAR Células tumorales aisladas o en nidos, localizadas dentro de los vasos o senos, se clasifican según su diámetro en CTA, micrometástasis o macrometástasis.

AFECTACION GANGLIONAR La cápsula forma parte del ganglio y su afectación además de la extensión extracapsular debe considerarse en la medida.

AFECTACION GANGLIONAR Grupos de células en el parénquima ganglionar y no en el seno subcapsular o espacios vasculares, aunque midan menos de 0.2 mm, deben considerarse micrometástasis.

CAMBIOS POR QTA Fibrosis. Depósitos de mucina. Histiocitos espumosos. Células tumorales detectables por IHQ. Regresión

GC: FALSOS POSITIVOS 4 de 502 (0.8%) casos. Macrófagos con restos de citoqueratina. Células reticulares dendríticas. Células névicas o pigmentadas. Inclusiones epiteliales benignas y epitelio desplazado (punción). Otros: calcificaciones, mucina, silicona Macrófagos CK en macrófagos CK en ret. dendríticas Strien L. Hum Pathol 2012. doi: 10.1016

GC: FALSOS POSITIVOS Células Névicas H&E S-100 Biddle DA. Am J Surg Pathol 2003;27:673.

INCLUSIONES GLANDULARES Congelado Definitivo Actina AE1/AE3 Actina 2º GC Peng Y.Am J Clin Pathol 2008;130:21.

GC: FALSOS NEGATIVOS 7 de 502 (1.4 %) casos. 4 CTA. 3 Mícrometástasis. Sobre todo en carcinoma lobulillar. Strien L. Hum Pathol 2012. doi: 10.1016

CONSENSOS CAP 2000 Consenso Estudio Intraoperatorio Múltiples Secciones Philadelphia 2001 Examen macroscópico. Impronta citológica mejor que cortes por congelación Impronta citológica o cortes por congelación Separación entre Secciones IHQ Si No No Si 3 Niveles No Reino Unido 2005 No recomienda cortes por congelación Si No No Alemania 2005 Examen macroscópico, cortes por congelación no seriados e impronta citológica Si Si (500 mm) No Austria Dos o tres costes por congelación Si Si (200 mm) Si (hasta 4) España (Valencia) 2001 España (Salamanca) 2001 Australia 2001 EWGBSP2006 Murcia 2006 Valencia 2010 Valencia 2013 Impronta citológica y cortes por congelación Impronta citológica y cortes por congelación No recomiendan ni cortes por congelación ni impronta citológica Impronta citológica o cortes por congelación Impronta citológica o cortes por congelación Recomendado OSNA e IHQ. Aceptable congelación y impronta. Aceptable cortes por congelación si el OSNA no esta disponible Si Si Si Si Si (200 mm) Si Si Si Si (primer nivel) Si Si (mínimo 1 mm, No optimo 200 mm) Si Si (200 mm) Si Si Si Si Si Si Si

CONSENSO SESPM VALENCIA 2013 Estudio intraoperatorio: Es aceptable el estudio histopatológico mediante cortes por congelación cuando el análisis con OSNA no sea posible. Secciones a distintos niveles que permitan detectar, por lo menos, metástasis de más de 2 mm. Estudio definitivo: Secciones seriadas (200 micras) teñidas con H&E. Inmunohistoquímica si la H&E es negativa.

PROTOCOLO DE ACTUACION Estudio intraoperatorio: Determinación macroscópica del estado del margen de la lesión. Examen macroscópico del ganglio centinela. Negativo: Estudio definitivo. Positivo: Estudio por congelación. Ganglio de la mamaria interna: Estudio por congelación de la lesión mamaria. Estudio definitivo: Tres láminas, 2 con H&E y una con inmunohistoquímica.

INFORME ANATOMOPATOLOGICO Número de ganglios centinela aislados. Tamaño. Localización. Número de cortes teñidos con H&E y con IH estudiados. Número de cortes teñidos con H&E y con IH que muestran metástasis. Tamaño y tipo de la metástasis (metástasis, micrometástasis, células tumorales aisladas) Resultados del ganglio centinela separados del resultado de otros ganglios no centinela.

INFORME ANATOMOPATOLOGICO Ganglio centinela nº1; protocolo OSNA intraoperatorio: Micrometástasis. Carga tumoral GC1 = 3.000 copias de ARNm-CK19/μl. Ganglio Centinela nº2; protocolo OSNA intraopretaorio: Macrometástasis. Carga tumoral GC2 = 130.000 copias de ARNm-CK19/μl. Carga tumoral total = 133.000 copias de ARNm-CK19/μl. pn1(gc mol, Osna).

CONCLUSIONES La técnica de estudio del GC se relaciona con la tasa de detección de metástasis y el tamaño de las mismas. El GC es con mucha frecuencia el único ganglio afectado. La técnica de OSNA es óptima para el estudio peroperatoio del GC. El número de copias de mrna de la CK19 esta en relación con el tamaño de la metástasis y la carga tumoral con la probabilidad de que haya más ganglios afectados. Los cambios regresivos por quimioterapia solo son evaluables mediante técnicas convencionales. Cualquier técnica de detección tiene falsos negativos (tipos histológicos ) y falsos positivos (inclusiones benignas ). El informe anatomopatológico debe reflejar todos los detalles de la técnica utilizada y los resultados de la misma.

Agradecimientos: Dr. Vicente Peg. Dra. Laia Bernet fratre@dexeus.com