TRABAJO PRÁCTICO Nº 5: ÁCIDOS NUCLEICOS DOCENTES: Dr. Andrés Ciochinni, Dra. Gabriela Niemirowicz. DESCRIPCIÓN DE LOS MÉTODOS A UTILIZAR Purificación de ácido desoxiribonucleico (ADN). El ADN es un polímero de nucleótidos, altamente hidrofílico y con carga neta negativa debido a la presencia de un grupo fosfato en cada monómero. Por esta razón su solubilidad en solventes polares es muy alta. En este TP usaremos esta propiedad para separar ADN bacteriano, en conjunto con un surfactante, el CTAB, el cuál en presencia de altas concentraciones de sal es capaz de unirse a polisacáridos removiéndolos de la solución. Por otra parte, el agregado de solventes orgánicos (ej. cloroformo) produce la partición de las diferentes moléculas en base a su afinidad por los distintos solventes y ayuda a remover los complejos formados entre CTAB, polisacáridos y proteínas. Precipitación de ácidos nucleicos Este método se basa nuevamente en la solubilidad diferencial del ADN. Una muestra de ADN en solución acuosa precipita al agregársele cationes (para neutralizar las cargas negativas que posee) y alcohol. El alcohol disminuye la constante dieléctrica del solvente acuoso, provocando una disminución en la solubilidad del ADN, que en presencia de altas concentraciones de sales, precipita. Este método es ampliamente utilizado como una forma de concentrar ADN. Se utilizan dos tipos de alcohol en este método. El etanol y el isopropanol. La diferencia entre ambos es la capacidad de disminuir la constante dieléctrica. Mientras que el isopropanol posee una mayor capacidad y por lo tanto es posible usar menor volumen (solo 0,7 volúmenes, contra 2,5 volúmenes de etanol), tiene la desventaja de precipitar más sales y por lo tanto rinde un ADN de menor pureza que el etanol. La elección se basa en el volumen manejable, prefiriéndose el etanol siempre que sea posible debido a la mejor calidad del ADN obtenido. Electroforesis en geles de agarosa. Detección de ácidos nucleicos La electroforesis es una técnica muy utilizada para separar moléculas de acuerdo a su diferente movilidad en un campo eléctrico. Básicamente la velocidad con la que se mueve un electrolito es proporcional a la relación carga/masa.
Es de gran utilidad en la separación de proteínas y ácidos nucleicos, debido a que ambas macromoléculas poseen carga neta. En el caso que nos ocupa, el ADN tiene como ya hemos señalado, una fuerte carga negativa, por lo que si se lo somete a un campo eléctrico, migra hacia el ánodo. Sin embargo, la relación carga/masa se mantiene constante, pues cada unidad monomérica que se agrega aporta la misma carga y masa, sin modificar así la relación. Con el objetivo de separar moléculas de ADN de distinto tamaño, es necesario introducir en el medio móvil, una malla que impida la difusión libre de las moléculas. De este modo, los fragmentos de ADN de mayor tamaño, serán efectivamente retenidos en relación a aquéllos más pequeños, consiguiendo así resolver una mezcla heterogénea de fragmentos de acuerdo sólo al tamaño de los mismos. Para visualizar el ADN utilizamos un compuesto aromático, el bromuro de etidio, que intercalándose entre las bases nitrogenadas de los pares de nucleótidos, produce una concentración alta localizada en forma proporcional a la masa de ADN presente en cada banda. De esta manera, cuando iluminamos el gel con luz UV, ésta excita las moléculas de colorante emitiendo luz visible. Dado que el colorante se ha concentrado en las bandas que contienen ADN, el fondo de luz en el resto del gel es despreciable, y el método es de gran sensibilidad. Cuantificación de ácidos nucleicos. Existen dos métodos para cuantificar ácidos nucleicos. 1) Estimación a partir de la intensidad de fluorescencia emitida por bromuro de etidio, como se describió anteriormente. 2) Medición espectrofotométrica de la cantidad de irradiación ultravioleta absorbida por las bases purínicas y pirimidinicas. El primero se utiliza cuando la concentración de ácidos nucleicos es muy baja o cuando la muestra presenta cantidades significativas de impurezas mientras que el segundo requiere que la muestra esté pura (sin proteínas, fenol, agarosa, u otros acidos nucleicos que puedan interferir con el mismo). El método espectrofotométrico aprovecha la capacidad de absorción a la luz UV que presentan las bases purínicas y pirimidinicas presentes tanto en el ADN como en el ARN. Las purinas y pirimidinas son estructuras que presentan dobles enlaces conjugados, esta característica permite que los ácidos nucleicos presenten una fuerte absorción a longitudes de onda cercanas a los 260 nm. En el trabajo práctico aprovecharemos esta característica para estimar la concentración de ADN bacteriano purificado. Objetivos: TRABAJO PRÁCTICO Extracción de ADN bacteriano a partir de un cultivo de Escherichia coli utilizando el método de partición diferencial en solventes orgánicos.
Análisis de la integridad y características de los ADN cromosómico y viral extraídos, sometidos a manipulaciones enzimáticas y físicas. 1º Parte: Extracción de ADN cromosómico Principio Las bacterias provenientes de un cultivo líquido son lisadas y las proteínas presentes en el extracto son eliminadas mediante la digestión con proteinasa K. La pared celular, polisacáridos y proteínas remanentes presentes en el extracto son removidas mediante una precipitación selectiva empleando CTAB. El ADN de alto peso molecular es recuperado posteriormente del sobrenadante empleando isopropanol. Materiales TE buffer (Tris-HCl 20 mm ph7.6 - EDTA 1mM) 10% dodecil sulfato de sodio (SDS) 20 mg/ml proteinasa K 5 M NaCl Solución CTAB/NaCl (hexadecyltrimethyl ammonium bromide) 24:1 cloroformo/alcohol isoamílico 25:24:1 fenol/cloroformo/alcohol isoamílico Isopropanol Etanol 70% Protocolo 1. Inocular 5 ml de medio de cultivo con la cepa bacteriana de interés. Crecer en las condiciones adecuadas para la misma (ej. Medio adecuado, temperatura) hasta que el cultivo se sature. 2. Centrifugar 1.5 ml del cultivo por espacio de 2 min. Descartar el sobrenadante. 3. Resuspender el pellet en 567 μl de buffer TE. Agregar 30 μl de SDS 10% y 3 μl de proteinasa K (20 mg/ml). Mezclar suavemente por inversión e incubar 1h a 37 C. En este punto la solución se debe volver viscosa por acción del detergente el cual provoca la lisis de la pared bacterina. Alternativamente, se podría emplear lisozima para digerir la pared bacteriana. Sobre que enlaces actúa la lisozima? 4. Agregar 100 μl de 5 M NaCl. Mezclar cuidadosamente por inversión. Este paso es muy importante ya que se puede formar un complejo entre el CTAB y el ADN si la concentración de sal es menor a 0.5 M.
5. Agregar 80 μl de la solución CTAB/NaCl. Mezclar suavemente por inversión e incubar 10 min a 65 C. El CTAB es un surfactante empleado para aislar ADN de tejidos que contienen grandes cantidades de polisacáridos En presencia de altas concentraciones de sal este es capaz de unirse a polisacáridos removiendolos de la solución. 6. Agregar 1 volumen de cloroformo/alcohol isoamílico. Mezclar por inversión y centrifugar 5 min. Esta extracción remueve los complejos formados entre CTAB, polisacáridos y proteínas. 7. Pasar la fase acuosa a un tubo eppendoff nuevo. Agregar 1 volumen fenol/cloroformo/alcohol isoamílico. Mezclar por inversión y centrifugar 5 min. 8. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Agregar 0.6 volumenes de isopropanol par precipitar el ADN. Agitar el tubo hasta que el ADN comience a precipitar (hilo blanco). En este punto es posible pescar con una pipeta Pasteur de vidrio o alternativamente se puede centrifugar el tubo eppendorff. 9. Lavar el ADN con etanol 70%. 10. Disolver el pellet en 50 μl de buffer TE. 11. Una vez en el TE, calentarlo a 55 o C 10 min. y resuspender muy cuidadosamente pipeteando repetidas veces. 12. Algunos grupos sonicarán el ADN resuspendido, con un tip pequeño dando 2 y 4 pulsos a mediana potencia (6) en un sonicador convencional. 2º Parte: Cuantificación del ADN genómico purificado. La cuantificación del ADN bacteriano purificado se llevará acabo mediante el método espectrofotomético. Para ello se efectuarán lecturas a 260 nm y 280 nm contra blanco de TE. Considere que una OD de 1 corresponde a aproximadamente a: - 50 μg/ml de ADN doble cadena. - 40 μg/ml de ADN simple cadena o RNA. Determine la concentración de ácidos nucleicos presentes en su muestra. Calcule el cociente OD 260 /OD 280. Cómo se modifica este resultado de acuerdo a lo visto en la clase de problemas?
- Por qué efectúa lecturas a 280 nm? Para que se utiliza el cociente OD 260 /OD 280? - Si ud no conociera la relación 1 OD=50 μg/ml, cómo haría para determinar la concentración de ADN en la muestra? - Por qué el ADN doble cadena absorbe menos que el simple cadena? Qué es el efecto hipocrómico? Digestión de ADNde λ. El bacteriófago (fago) λ es un virus de ADN doble cadena capaz de infectar y replicarse en bacterias. En el trabajo práctico realizaremos distintos tratamientos sobre el ADN obtenido a partir de este virus. A- Digestión sitio específica. Concentración Concentración final μl ADN λ. 1 μg/μl 50 ng/μl NEB Buffer 10X 1X H 2 O - - Volumen final - - 100 1. Agregar 0.5 μl de la enzima de restricción BstEII. 2. Mezclar muy bien por agitación, y traer todo el volumen al fondo del tubo mediante una breve centrifugación. 3. Colocar el tubo en un baño equilibrado a la temperatura óptima de digestión con la enzima. Digerir por el lapso de 1 hora. - Cuál es el tamaño del genoma del fagoλ? Utilice las bases de datos del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Número de acceso a GenBank: J02459 o M17233. -Utilice el programa NEB cutter 2 (http://tools.neb.com/nebcutter2/index.php) para predecir cuantos sitios de corte para la enzima BstE II presenta el fago λ. Para ello copie y pegue la secuencia de ADN de λ en este programa o seleccione la opción Lambda del menu de secuencias estándar (esto cargará automáticamente el genoma del fago). Cuántos fragmentos de y de que tamaño debería ver en un gel de agarosa 1%? Y si utilizara las enzimas BamHI y NotI? Qué secuencias reconocen las tres endonucleasas? B- Digestión sitio inespecífica (DNAsa y RNAsa).
1. Preparar 4 eppendorfs conteniendo 5 μg de ADN de λ (500 ng/μl). 2. Diluir 1/100 el stock de DNAsa (5 mg/ml) en 50 mm Tris-HCl ph 7.6, 5 mm MgCl 2. Preparar 100 μl (Dilución 1). 3. A partir de la dilución anterior, preparar una solución 1/10 (Dilución 2) y 1/100 (Dilución 3) utilizando 50 mm TrisHCl ph 7.6, 5 mm MgCl 2. Preparar 100 μl de cada una de ellas. 4. Tomar 10 μl de cada una de las diluciones (1, 2, 3) y agregárselos a 3 de los eppendorfs preparados en el paso 1. 5. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente. Inactivar la DNAsa 20 minutos a 80º C. Sembrar en gel de agarosa 1%. 6. Al cuarto eppendorf agregarle 10 μl de 50 mm TrisHCl ph 7.6, 5 mm MgCl 2 y 1 μl RNAsa (10 mg/ml). 3º Parte: Electroforesis de ADN en geles de agarosa 1. Preparar una solución de agarosa 1% en buffer de electroforesis TBE 1X. Para lograr que se disuelva es necesario hervir la mezcla. 2. Enfriarla hasta 40-45 o C y antes de que gelifique, agregar bromuro de etidio 0.5 μg/ml (usualmente la solución stock está 20000X), agitar suavemente para mezclar sin que aparezcan muchas burbujas y verter en las cubas ya preparadas (con topes y peine). MUCHO CUIDADO CON EL BROMURO DE ETIDIO: ES CANCERIGENO. MANEJARLO CON GUANTES, DEL MISMO MODO QUE TODO LO QUE ESTE EN CONTACTO CON ESA SAL (EL GEL, EL BUFFER DE CORRIDA, LA CUBA). CAMBIARSE LOS GUANTES ANTES DE TOCAR CUALQUIER OTRA COSA LIMPIA!!!!!!!!! 3. Cuando ha gelificado completamente, agregar TBE 1X hasta cubrir todo el gel, extraer con cuidado el peine y los topes de plástico, y terminar de agregar buffer (en caso necesario) como para cubrir los electrodos de la cuba y el gel. 4. Preparar las muestras a sembrar (ADN cromosómico, ídem pero sonicado, ADN plasmídico aportado por los docentes digerido y sin digerir, y marcadores de peso molecular), por agregado de buffer de siembra. Calcular cuánto agregar sabiendo que el buffer de siembra está 6X. Mezclar muy bien.
5. Sembrar no más de 20 μl por calle. Asegurarse la correcta orientación de los electrodos en relación al extremo del gel donde se realizó la siembra. Correr a 8 V/cm. 6. Cuando el frente llega a correr 3/4 partes del gel, cortar la corrida, y observarlo con un transiluminador de luz UV. MUCHO CUIDADO CON LA LUZ UV: PRODUCE DAÑOS IRREVERSIBLES A LA VISTA Y A LA PIEL. NO MIRAR SIN PROTECCION ADECUADA (ANTEOJOS O MASCARAS PARA UV), NO EXPONER LA PIEL INNECESARIAMENTE (USAR GUANTES DE LATEX, Y NO ESTAR DEMASIADO TIEMPO CON LA LUZ UV PRENDIDA)!!!!!!!!!!! Informe: Los alumnos escribirán un informe con los resultados obtenidos, discutiéndolos en base a lo visto en clases teóricas.