UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MICROBIOLOGIA VETERINARIA PRÁCTICA DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS OBJETIVO: Analizar el comportamiento metabólico e interpretar las diferentes pruebas bioquímicas que se utilizan en microbiología. INTRODUCCIÓN: La principal finalidad de la identificación bacteriana es poder proponer un efectivo tratamiento antibiótico, por tal razón es importante caracterizar muy bien el agente infeccioso causante de enfermedad en las diferentes especies de interés veterinario, para lo cual nos valemos de diferentes pruebas (ver tabla). El tipo de pruebas mas orientativas desde el punto de vista diagnóstico es el de las pruebas bioquímicas, que permiten discriminar un grupo bacteriano de otro y adicionalmente permiten identificar un microorganismo en particular. Para tener unos resultados 100% confiables se debe asegurar que el cultivo al que se le haga identificación por diferentes pruebas bioquímicas no esté contaminado, es decir que el cultivo esté puro. Las colonias en el cultivo deben estar aisladas para garantizar un buen inóculo en las diferentes pruebas bioquímicas.
METODOLOGÍA Usted encontrará diferentes estaciones (E1 E12) en las cuales deberá interpretar la respectiva prueba basado en su fundamento bioquímico; se recomienda revisar muy bien este material, ya que estos puntos se evaluarán en el primer parcial: ESTACIÓN 1 - E1: Cuando una bacteria oxida un azúcar por vía oxidativa, se produce peróxido de hidrógeno, el cual es muy tóxico para las bacterias y es eliminado con la producción de la enzima catalasa (H2O2 H2O + ½ O2). Una de las pruebas de rutina para la identificación de bacterias, es la prueba de la catalasa. Usted encontrará 2 cajas de petri (A y B), para evaluar la presencia de catalasa. En una lámina portaobjetos se agrega una colonia de cultivo sobre una gota de peróxido de hidrógeno. La prueba se considera positiva si se forma espuma. Cuál es el resultado de A y de B? ESTACIÓN 2 E2: En esta estación se evalúa la presencia de Citocromo C Oxidasa (Prueba de Oxidasa), la cual es una enzima que oxida el Citocromo C de la cadena transportadora de electrones. Se utiliza el reactivo tetraparafenilendiamina, el cual en estado reducido es incolora y cuando se oxida es de color púrpura ó negra. Usted encontrará cajas de petri con discos (o tiras) para la prueba de oxidasa. Teniendo en cuenta el color de un disco/tira sin inocular Cuáles serían los resultados de A y B? Justifique su respuesta. ESTACIÓN 3 E3: Prueba de SIM: (Sulfuro, Indol, Motilidad). Usted encontrará diferentes tubos con medio SIM, haga la lectura correspondiente, observando motilidad, producción de H 2 S e indol; las lecturas de motilidad y H 2 S deben hacerse antes de efectuar el test para indol, es decir, antes de agregar reactivo de Kovacs. La formación de H 2 S se observa por ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en la totalidad del medio. La motilidad positiva se observa por crecimiento de la bacteria en zonas aledañas al sitio de inoculación. El indol resulta de la degradación del triptófano por la enzima bacteriana triptofanasa; para el test de indol agregue unas 3 gotas de reactivo de Kovacs. La formación de un anillo rojo cereza indica la producción del indol. La formación de un anillo amarillo indica indol negativo. De acuerdo a la lectura Cuál es el resultado de A, B, C Y D?. Cuál es el fundamento de cada uno de estos resultados? ESTACIÓN 4 E4: Existen microorganismos con capacidad de producir hemólisis; este fenómeno se puede evidenciar tras la inoculación del microorganismo en agar sangre. Las bacterias se clasifican de acuerdo a el tipo de hemólisis en alfa: halos verdosos (hemólisis parcial) reducción de la hemoglobina de los glóbulos rojos a metahemoglobina en el medio), beta: halos incoloros (hemólisis total) y gamma: inexistencia de halos (sin hemólisis). Usted encontrará cajas de Petri con medio de cultivo agar sangre con inoculados de muestras clínicas; clasifique el tipo de hemólisis observado en cada uno de los cultivos. Qué tipo de hemólisis observa? ESTACIÓN 5 E5: Prueba de CAMP (Christie, Atkins and Munch-Petersen). Esta prueba se usa para identificar Streptococci Grupo B beta-hemolítico, basado en su producción de factor CAMP, el cual agranda el área de beta-hemólisis producida por Staphylococcus aureus. La prueba de CAMP se utiliza para la identificación presuntiva de S. agalactiae. En esta prueba se observa un efecto sinérgico que se produce al interactuar el factor CAMP producido por cepas de S. Agalactiae con la hemolisina β de Staphylococcus aureus. Ambos son productos extracelulares que difunden en el medio de cultivo para producir dicho efecto en forma de flecha cuando se utilizan placas de agar sangre preparada con eritrocitos ovinos o bovinos. Usted encontrará placas de Petri con la prueba de CAMP. Interprete y justifique su resultado.
ESTACIÓN 6 E6: Prueba de la ureasa. Esta enzima cataliza la hidrólisis de la urea, dando lugar a dos moléculas de amoniaco y dióxido de carbono. Se usa el medio urea Christensen al cual se le agrega una solución de urea al 20% para conseguir una concentración final del 2%. Se le agrega también el indicador de ph rojo fenol. Si el color del medio es amarillo/naranja (ph neutro), la prueba es negativa y si es rojo fucsia (básico) es positiva. Cuál es el resultado de A y B?. Cuál es el fundamento de cada uno de estos resultados? ESTACIÓN 7 E7: El agar TSI (Triple Sugar Iron), es un medio de cultivo utilizado para caracterizar bioquímicamente a diferentes géneros bacterianos. Correspondientemente las reacciones sobre agar TSI son: Si la bacteria problema fermenta la glucosa, acidificará el medio haciendo virar a amarillo el indicador en el fondo del tubo, mientras que si no es fermentadora de glucosa, el medio permanecerá de color rojo. Si la bacteria problema fermenta lactosa o sacarosa, acidifica el medio en su superficie volviéndolo de color amarillo, mientras que si no lo es, la superficie del medio continuará de color rojo. Si produce ácido sulfhídrico (debido a la reducción de las sales de hierro), se presentará un ennegrecimiento del tubo. La producción de sulfhídrico y el consiguiente ennegrecimiento pueden impedir ver la fermentación de la glucosa (fondo amarillo), pero este hecho implica directamente que la bacteria es fermentadora de glucosa. Si el medio toma el color rojo arriba y abajo del tubo significa que la bacteria no fermenta ninguno de los azúcares del medio de cultivo, por lo tanto utiliza las proteínas como suministro energético, alcalinizando el medio (Color rojo) Si aparece rotura o desplazamiento del medio, significa que la bacteria es productora de gas. Describa los resultados observados en A (sin inocular), B, C, D Y E. Justifique su respuesta. ESTACIÓN 8 E8: El agar Simmons Citrato es un medio de cultivo utilizado para caracterizar bioquímicamente a diferentes géneros bacterianos. Un test positivo es indicado por el desarrollo de un color azul en el medio, indicativo de crecimiento de gérmenes que utilizan el Citrato como única fuente de carbono. En el caso de un test negativo, no hay crecimiento o no hay cambio de color. Cuál es el resultado de A y B?. Cuál es el fundamento de cada uno de estos resultados? ESTACIÓN 9 E9: Prueba de la Lisina descarboxilasa en agar LIA. Realice la lectura correspondiente y observe la producción de lysina descarboxilasa y H 2 S. Si el microorganismo produce la enzima lysina descarboxilasa mostrará una reacción alcalina a través del medio; el fondo del tubo y la parte inclinada permanecerán de color púrpura. Si se observa ennegrecimiento en el medio el microorganismo es H 2 S positivo. La prueba es negativa cuando se observe un color amarillo en el medio. Lys cadaverina + CO2. si se da la reacción provoca un aumento del ph, tornando el medio color violeta (LDC +); color amarillo (LDC -). Cuáles son los resultados observados?. Cuál es el fundamento de cada uno de estos resultados? ESTACIÓN 10 E10: Otra característica importante para la identificación de las enterobacterias, es su capacidad de fermentar el manitol. Se usa en esta prueba el Agar Manitol salado. Este agar permite el crecimiento de un determinado grupo de bacterias mientras que inhibe el crecimiento de otras. Este medio es importante en el laboratorio clínico debido a que es capaz de distinguir los microorganismo patogénicos en un corto periodo de tiempo. Contiene una alta concentración (~7.5%-10%) de sal (NaCl), haciéndolo
selectivo para Staphylococci (y Micrococcaceae) debido a que el nivel de NaCl es inhibitorio para la mayoría de las bacterias. Además contiene manitol y un indicador de ph; rojo de fenol. Si un organismo es capaz de fermentar el manitol, un subproducto ácido es creado que hace que el rojo de fenol cambie a amarillo. Se usa para el aislamiento selectivo de colonias de Staphylococci sospechosas de ser patógenas. Teniendo en cuenta esto, Que características en cuanto a la fermentación del manitol tiene el microorganismo aislado en A y en B?. Justifique su respuesta. ESTACIÓN 11 E11: Prueba de licuefacción de la gelatina: determina la capacidad de un microorganismo para producir enzimas de tipo proteolítico como la gelatinasa, licuándola. Cuál es el resultado de A y B?. Justifique su respuesta. ESTACIÓN 12 E12: Usted encontrará una prueba de coagulasa. Esta proteína es producida por varios microorganismos que permite la conversión del fibrinógeno en fibrina. En el laboratorio, se usa para distinguir entre diferentes especies de Staphylococcus (Staphylococcus aureus generalmente dando un resultado positivo). Entre organismos Gramnegativos, un test positivo de coagulasa puede indicar la presencia de Yersinia spp. Cuál es el resultado de A y B?. Justifique su respuesta. ESTACIÓN 13 E13: Prueba de Deoxirribonucleasa. La deoxirribonucleasa es una enzima extracelular que le permite al organismo utilizar ADN como fuente de nutrientes y de energía. Usted encontrará cajas de Petri con medio de cultivo DNAsa Agar. Este Medio de cultivo es utilizado para la detección de enzimas desoxirribonucleasas, permitiendo diferenciar bacterias que poseen la enzima desoxirribonucleasa de aquellas que no la poseen. La presencia de la enzima, se puede detectar agregando ácido clorhídrico 1N. El ácido desoxirribonucleico hidrolizado presenta transparencia, mientras que el ácido desoxirribonucleico polimerizado, precipita y torna opacidad al medio de cultivo. Positivo: halo claro, transparente alrededor del crecimiento bacteriano. Negativo: el medio se observa opaco. Cuál es el resultado de A y B? Justifique su respuesta. ESTACIÓN 14 E14: Prueba de Bilis-Esculina. El agar Bilis-Esculina es un medio selectivo y diferencial. La presencia de bilis excluye varios grupos de Estreptococci, pero no al género Enterococcus. Algunas especies de este último género son también capaces de hidrolizar esculina para producir un compuesto que reacciona con las sales férricas del medio. Usted encontrará cajas de Petri con el medio de cultivo Bilis Esculina; algunas bacterias crecen rápidamente en este agar e hidrolizan la esculina que en presencia de iones hierro forman un compuesto de color verde oliva hasta negro. Que resultados encuentra en los platos de esta estación? Qué significan los resultados observados? ESTACIÓN 15 E15: En un laboratorio clínico veterinario, le demanda de muestras clínicas es muy alta, lo que significa que a diario es necesario identificar muchos microorganismos, lo cual necesita mucho tiempo por parte de los operarios; en atención a estas necesidades diferentes casas comerciales han desarrollado kits que permiten de una manera mas rápida y eficiente (y costosa) la identificación de un gran número de géneros bacterianos. Usted encontrará un kit comercial (BD BBL CRYSTAL) y uno API; el microorganismo identificado es un microrganismo entérico; encontrará una tabla de colores; identifique la bacteria problema. Usted necesitará lámpara de U.V y un lugar oscuro para interpretar algunos puntos de esta prueba.
BIBLIOGRAFÍA T Stuart Waiker, Me Graw Hill, Mexico-2000-Editores S.A-Microbiología Jawest - Meinick y Edelberg, 16a Edición- México - Manual Moderno Microbiología Médica. Murray Patrick -2a Edición- 1993. Harcourt Brace- Microbiología Médica. 53 Restrepo Angela, Robledo Jaime. 6a Edición - Corporación Para Investigaciones Biológicas. Fundamentos De Medicina- Enfermedades Infecciosas. MATIN, A. (1978): Organic nutrition of chemolithotrophic bacteria. Ann. Rev. Microbiol. 32: 433-468. NEIDLANS, J.B. (1982): Microbial envelope proteins related to iron. Ann Rev. Microbiol. 36: 285-309. SPENCER, M.E., J.R. GUEST (1987): Regulation of citric acid cycle genes in facultative bacteria. Microbiol Sci. 4: 164-168.