METODOLOGÍAS UTILIZADAS EN INVESTIGACIÓN BÁSICA Y APLICADA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

METODOLOGÍAS UTILIZADAS EN INVESTIGACIÓN BÁSICA Y APLICADA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Centro de de Microscopía Electrónica Facultad de de Ciencias Médicas Universidad Nacional de de Córdoba

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Es un técnica in vitro que se utiliza para la síntesis enzimática de un fragmento de ADN específico en pocas horas. El fragmento puede representar una parte de una mezcla compleja de ADNs, por ejemplo un exón de un gen específico. PCR

MUESTRAS

AISLAMIENTO-PURIFICACIÓN

REACTIVOS Muestra (Template DNA) Esta Esta contiene la la región del del fragmento a ser ser amplificado Par Par de de primers (oligonucleótidos) determinan el el comienzo y el el final de de la la región a ser ser amplificada dntp s (deoxinucleótidos trifosfato) moléculas a partir de de las las cuales la la polimerasa construye el el nuevo fragmento de de ADN DNA Polimerasa (Usualmente Taq) PCR

ETAPAS DE LA REACCION Desnaturalización (95 o C) separación de las cadenas de ADN Annealling (56-70 o C) unión de los primers a la molécula de ADN Extensión (72 o C) se produce mediante el agregado de dntps 1 ciclo PCR

ETAPAS DE LA REACCION Desnaturalización

ETAPAS DE LA REACCION Annealling (56-70 C)

ETAPAS DE LA REACCION Extensión

ETAPAS DE LA REACCION

ANALISIS Corrida electroforetica Gel Gel de de agarosa, revelado con EtBr Comprobar la la formación de de producto Determinar la la aparición de de mas de de una banda en en la la misma reacción Verificar el el peso molecular (PM) del del producto formado Mediante un un marcador de de PM PM PCR

VISUALIZACION DE RESULTADOS VISUALIZACION DE RESULTADOS PCR

EQUIPAMIENTO Unidad de electroforesis Micropipetas Tubos Tips con filtro Reactivos Equipo para documentación digital TERMOCICLADOR TRANSILUMINADOR PCR

REAL TIME PCR Incorpora un módulo que permite detectar el producto de PCR (Amplicon) en el momento de su amplificación No requiere de corrida electroforética en geles Rápido screening del producto sin necesidad de geles Es un método cuantitativo que permite correlacionar la cantidad de producto de partida con el producto formado en la etapa exponencial de la reacción. REAL TIME PCR

Detección del Amplicon (SYBR) REAL TIME PCR

Detección del Amplicon (Taqman) 5 3 5 Forward Primer Polimerización R TaqMan Probe Q Reverse Primer 5 3 5 REAL TIME PCR

Detección del Amplicon (Taqman) 5 3 5 Forward Primer Desplazamiento R Q Reverse Primer 5 3 5 REAL TIME PCR

Detección del Amplicon (Taqman) 5 3 5 R Hidrólisis Q 5 3 5 REAL TIME PCR

Detección del Amplicon (Taqman) 5 3 5 Polimerización n Completa R Q 5 3 5 REAL TIME PCR

Resultados REAL TIME PCR

PCR PCR en tiempo real Cualitativo Cuantitativo

OPTIMIZACION Diseño de de primers parámetros para el el diseño, alineación de de secuencia, formación de de estructuras secundarias Temperatura de de annealing esta determinada por por los los primers Concentración de de Cl Cl 2 Mg 2 Mg Tiempos en en cada paso de de la la reacción Cantidad de de muestra y cantidad de de polimerasa a utilizar PCR

CONSIDERACIONES Una Una pequeña cantidad de de ADN ADN es es suficiente Contaminaciones puede puede ser ser a través través de de pipetas, saliva, saliva, manos, manos, ropa, ropa, lugar lugar comunitario de de trabajo trabajo Tamaño del del producto en en general general el el tamaño varia varia entre entre 200-1000 pb pb Falta Falta de de amplificación debido debido a ADN ADN impuro impuro o falta falta del del mismo, mismo, primers que que no no son son óptimos o reactivos ineficientes Amplificación no no especifica puede puede deberse a diseño diseño no no óptimo óptimo de de los los primers, o a una una temperatura de de annelling demasiado baja baja PCR

TIPOS DE PCR SSCP-PCR (single strand conformational polymorphims PCR) Se Se utiliza para detectar mutaciones RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) Permite ver expresión de de genes Real Time-PCR (PCR en en tiempo real) Permite ver en en tiempo real la la acumulación de de producto PCR

APLICACIONES Detección de mutaciones Screening de enfermedades hereditarias (desordenes genéticos heredados) Diagnostico de enfermedades infecciosas Clonación de genes Perfil genético utilizando microsatélites Medicina forense Estudio de especies Test de paternidad Producción de gran cantidad de ADN para secuenciación, o de secuencias especificas de ADN o ARN para utilizar como sonda PCR

DETECCION DE MUTACIONES 641bp Región a amplificar 300bp 941bp Región a amplificar

ANALISIS DE LA APLICACION 941 bp 641 bp +/+ -/- +/- PCR

Diagnostico de de enfermedades infecciosas RT-PCR

CLONACION DE GENES CLONACION DE GENES PCR

MEDICINA FORENSE MEDICINA FORENSE PCR

TEST DE PATERNIDAD Electroforesis de fragmentos de ADN amplificados por PCR. (1) Padre. (2) Hijo. (3) Madre. El hijo heredó algunos, pero no todos los fragmentos de los padres, lo cual lo hace unico. PCR

METODOLOGÍAS UTILIZADAS EN INVESTIGACIÓN BÁSICA Y APLICADA ELISA (Enzime Linked ImmunoSorbent Assay)

ELISA (Enzime Linked ImmunoSorbent Assay) Enzimo Inmuno Ensayo (EIA) desarrollado para medir pequeñas cantidades de sustancias en diversas muestras. MUESTRAS Suero Plasma Medios de de cultivo Lavado broncoalveolar Homogenatos Células en en cultivo (Spot ELISA) ELISA

ELISA TIPOS DE ELISA ELISA competitivo directo () ELISA Indirecto (Ac) ELISA Sandwich ()

ELISA ELISA COMPETITIVO DIRECTO () Fase Sólida (PVC o PS) Adición de Solución de Antígeno

ELISA ELISA COMPETITIVO DIRECTO () L A V A D O

ELISA ELISA COMPETITIVO DIRECTO () B L O Q U E O PBS-Albúmina 1 %

ELISA ELISA COMPETITIVO DIRECTO () Adición de una dilución conocida de Anticuerpo acoplado a enzima.

ELISA ELISA COMPETITIVO DIRECTO () Adición de sustrato/cromógeno s s s

ELISA ELISA COMPETITIVO DIRECTO () VALORACIÓN p p p

ELISA

ELISA

A C ELISA - Muestras ELISA COMPETITIVO DIRECTO ()

A ELISA ELISA COMPETITIVO DIRECTO ()

A Adición del -Ac de Detección Acoplado a Enzima ELISA ELISA COMPETITIVO DIRECTO ()

ELISA ELISA COMPETITIVO DIRECTO () LAVADO A

ELISA ELISA COMPETITIVO DIRECTO () ADICIÓN DE SUSTRATO/CROMÓGENO s s s A

ELISA ELISA COMPETITIVO DIRECTO () NO OCURRE LA REACCIÓN DE COLOR: COMPETICIÓN 100 % s s s A EXCESO DE ANTÍGENO EN LA MUESTRA

ELISA ELISA COMPETITIVO DIRECTO () C

ELISA ELISA COMPETITIVO DIRECTO () Adición de Anticuerpo de Detección Acoplado a Enzima C

ELISA ELISA COMPETITIVO DIRECTO () LAVADO C

C ELISA COMPETITIVO DIRECTO () ADICIÓN DE SUSTRATO/CROMÓGENO s s s ELISA

ELISA ELISA COMPETITIVO DIRECTO () REACCIÓN DE COLOR : 0 % COMPETICIÓN p p p C AUSENCIA DE ANTÍGENO EN LA MUESTRA

ELISA 0,25 ELISA COMPETITIVO DIRECTO () D.O. 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 20 40 60 80 100 120 Concentración (pg/ml)

ELISA COMPETITIVO DIRECTO () D.O. 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0-4 -3-2 -1 0 1 2 Log 10 conc ELISA

ELISA ELISA INDIRECTO (Ac) Antígeno adosado a la fase sólida

ELISA INDIRECTO (Ac) Anticuerpo primario (muestra) Antígeno adosado a la fase sólida ELISA

ELISA INDIRECTO (Ac) Conjugado antiespecie (Ac 2º acoplado a enzima) Anticuerpo primario (muestra) Antígeno adosado a la fase sólida ELISA

ELISA INDIRECTO (Ac) Sustrato/cromógeno Conjugado antiespecie (Ac 2º acoplado a enzima) Anticuerpo primario (muestra) Antígeno adosado a la fase sólida s s s ELISA

ELISA ELISA INDIRECTO (Ac) 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 20 40 60 80 100 120 LECTURA p p p

ELISA ELISA SANDWICH Anticuerpo de captura adosado a la fase sólida

ELISA ELISA SANDWICH Antígeno (muestra) Anticuerpo de captura adosado a la fase sólida

ELISA ELISA SANDWICH Ac conjugado dirigido contra el de interés Antígeno (muestra) Anticuerpo de captura adosado a la fase sólida

ELISA ELISA SANDWICH Sustrato/cromógeno Ac conjugado dirigido contra el de interés Antígeno (muestra) Anticuerpo de captura adosado a la fase sólida s s s

0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 20 40 60 80 100 120 ELISA SANDWICH ELISA SANDWICH LECTURA p p p ELISA

ELISA Consideraciones - Sensibilidad aprox. 100 % - Especificidad 99.9 % - Lecturas: Positivo, Indeterminado, Negativo. - Proporción de Falsos negativos 1:40000-1:150000 - Falsos Positivos: Multíparas, Politransfundidos.

ELISA Aplicaciones de ELISA - Enfermedades Infecto-Contagiosas - Dosaje de Hormonas - Enfermedades Inflamatorias y Autoinmunitarias - Perfil de Citoquinas en Modelos Experimentales - Factores de Crecimiento - Proteínas de Secreción

Universidad Nacional de Córdoba