Originales M. Rodríguez-Yáñez 1 M. Castellanos 2 T. Sobrino 1 M. Blanco 1 F. Nombela 3 R. Rodríguez-González 1 R. Leira 1 J. Serena 2 A. Dávalos 4 J. Castillo 1 1 Servicio Neurología Laboratorio de Investigación de Neurociencias Clínicas Hospital Clínico Universitario Universidad de Santiago de Compostela Santiago de Compostela Marcadores moleculares asociados a signos precoces de isquemia en tomografía computarizada cerebral 2 Servicio de Neurología Hospital Universitari Dr. Josep Trueta Girona 3 Servicio de Neurología Hospital Universitario de La Princesa Madrid 4 Departamento de Neurociencias Hospital Universitari Germans Trias i Pujol Universitat Autònoma de Barcelona Badalona (Barcelona) Introducción. Durante la isquemia cerebral se ponen en marcha diferentes mecanismos de neuroexcitotoxicidad, neuroinflamación y disrupción de la barrera hematoencefálica (BHE) que conducen al desarrollo de necrosis, edema y transformación hemorrágica. La tomografía computarizada (TC) es el método diagnóstico más empleado en el ictus agudo, siendo útil en la selección de los pacientes para determinados tratamientos. El objetivo de este estudio es identificar los marcadores moleculares de neuroexcitotoxicidad, neuroinflamación y disrupción de la BHE que pueden estar asociados en la fase aguda del ictus con la presencia de signos precoces de isquemia en TC cerebral. Métodos. Se incluyeron prospectivamente 311 pacientes con ictus isquémico de menos de 24 h de evolución desde el inicio de los síntomas. Se establecieron tres grupos en base al tiempo desde el inicio de los síntomas hasta la llegada al hospital: 6 h, entre 6 y 12 h y >12 h. Se realizó una TC cerebral al ingreso para evaluar la presencia de signos precoces mediante la escala Alberta Stroke Program Early CT Score (ASPECTS). En el momento del ingreso se obtuvieron muestras de sangre para la determinación de marcadores moleculares de neuroexcitotoxicidad (glutamato), neuroinflamación (interleucina [IL]-6) y disrupción de la BHE (metaloproteasa [MMP]-9). Resultados. Los pacientes con una puntuación en la escala ASPECTS 7 mostraron un peor pronóstico funcional precoz y tardío. Los niveles de glutamato >134,4 µm (OR: 9,7; IC 95%: 4,2-22,5; p<0,001), IL-6>15,5 pg/ml (OR: 4,4; IC 95%: 2,1-9,4; p<0,001) y MMP-9 > 87,2 ng/ml (OR: 18,4; IC 95%: 7,2-47,1; p<0,001) se asociaron con una puntuación en la escala ASPECTS 7. En el modelo de regresión logística sólo el glutamato > 134,4 µm en las primeras 6 h (OR: 13,2; IC 95%: 5,4-31,3; p<0,001), la IL-6 >15,5 pg/ml entre las 6 y 12 h (OR: 10,5; IC 95%: 4,1-26,7; p<0,001) y la Correspondencia: José Castillo Servicio de Neurología Hospital Clínico Universitario Travesa da Choupana, s/n 15706 Santiago de Compostela Correo electrónico: mecasti@usc.es Recibido el 20-6-07 Aceptado el 21-6-07 MMP-9 > 87,2 ng/ml después de las 12 h (OR: 24,2; IC 95%: 4,8-50,2; p < 0,001) se asociaron de manera independiente con una puntuación en la escala ASPECTS 7. Conclusiones. La puntuación en la escala ASPECTS puede considerarse como un marcador subrogado del deterioro neurológico precoz y volumen del infarto, y está asociado con marcadores moleculares de neuroexcitotoxicidad, neuroinflamación y disrupción de la BHE. Palabras clave: Ictus isquémico. Marcadores moleculares. Glutamato. Interleucina-6. Metaloproteasa-9. Signos precoces. Tomografía computarizada. Molecular markers are associated with early computed tomography ischemic changes Introduction. During brain ischemia, neurotoxicity, neuroinflammation and blood-brain barrier (BBB) disruption mechanisms are involved, leading to necrosis, edema and hemorrhagic transformation. Cranial computed tomography (CT) is the most widely used method in the diagnosis of acute stroke, and its early performance may help in the selection of patients for certain treatments. Our objective is to identify molecular markers of neuroexcitotoxicity, neuroinflammation and BBB disruption in the acute phase of stroke that might be associated with early ischemic CT signs. Methods. 311 patients with ischemic stroke within the first 24 h from symptoms onset were prospectively included. We established tres groups based on the time between symptom onset and hospital arrival: 6 h, between 6 and 12 h and >12 h. Cranial CT was performed at admission to evaluate early ischemic signs according to the Alberta Stroke Program Early CT Score (ASPECTS). Blood samples were taken at admission for the determination of molecular markers of neuroexcitotoxicity (glutamate), neuroinflammation (interleukin [IL]-6) and BBB disruption (metalloproteinase [MMP]-9). Results. Patients with ASPECTS score 7 showed a worse early and late prognosis. Glutamate > 134.4 µm (OR: 9.7; CI 95%: 4.2-22.5; p<0.001), IL-6>15.5 pg/ml 220 50
(OR: 4.4; CI 95%: 2.1-9.4; p<0.001) and MMP-9 > 87.2 ng/ml (OR: 18.4; CI 95%: 7.2-47.1; p<0.001) were associated with ASPECTS score 7. In the logistic regression model, only glutamate >134.4 µm/l in the first 6 h (OR: 13.2; CI95%: 5.4-31.3; p<0.001), IL-6>15.5 pg/ml from 6 to 12 h (OR: 10.5; CI 95 %: 4.1-26.7; p < 0.001) and MMP-9 >87.2 ng/ml after 12 h (OR: 24.2; CI 95%: 4.8-50.2; p < 0.001) were independently associated with ASPECTS score 7. Conclusions. The ASPECTS score may be considered as a surrogate marker of early neurological deterioration and final infarct volume, and associated with molecular markers of neuroexcitotoxicity, neuroinflammation and BBB disruption. Key words: Ischemic stroke. Molecular markers. Glutamate. Interleukin-6. Metalloproteinase-9. Early sings. Computed tomography. INTRODUCCIÓN La lesión cerebral que se produce tras la isquemia aparece de manera precoz y se desarrolla gradualmente 1,2. Si la isquemia persiste se produce necrosis del parénquima cerebral, con el desarrollo de edema y transformación hemorrágica. Estos cambios ocurren de manera progresiva, y se producen por mecanismos de neuroexcitotoxicidad, neuroinflamación y disrupción de la barrera hematoencefálica (BHE) 3. Los nuevos tratamientos trombolíticos y neuroprotectores que se emplean durante la fase aguda del ictus han demostrado su utilidad en grupos seleccionados de pacientes, mientras que en otros se observa una falta de eficacia y un incremento en la morbilidad 4-7. Es necesario, por tanto, seleccionar adecuadamente a los pacientes que se pueden beneficiar de dichos tratamientos. La tomografía computarizada (TC) es el método diagnóstico más empleado en la fase aguda del ictus, y su realización precoz puede ayudarnos a la correcta selección de los pacientes para determinados tratamientos 8-11. La identificación de los procesos bioquímicos que están implicados en los cambios isquémicos precoces que se observan en la TC pueden ser de utilidad en la selección de pacientes para actitudes terapéuticas, conocer las complicaciones derivadas de los tratamientos e identificar nuevas dianas terapéuticas. El objetivo de este estudio es identificar posibles marcadores de neuroexcitotoxicidad, neuroinflamación y disrupción de la BHE que pueden estar asociados a la presencia de signos precoces de isquemia en la TC cerebral. mas hasta su ingreso en el hospital, entre enero y diciembre de 2003. Se excluyeron 13 pacientes que fallecieron antes de la realización de la segunda TC cerebral, 24 pacientes incluidos en ensayos clínicos, 3 pacientes que rechazaron la inclusión en el estudio, 2 pacientes en los que no se confirmó el ictus isquémico, 7 pacientes tratados con aminas vasoactivas, 5 pacientes con enfermedades sistémicas graves, 8 pacientes con demencia o enfermedades psiquiátricas previas y 2 pacientes con enfermedades cardiovasculares inestables. Finalmente se analizaron 247 pacientes. Se establecieron tres grupos en función del tiempo transcurrido desde el inicio de los síntomas hasta la llegada al hospital: 6 h, entre 6 y 12 h y >12 h. En el momento del ingreso en el servicio de urgencias se recogieron datos acerca de los antecedentes previos de factores de riesgo vascular, temperatura, presión arterial media y gravedad del ictus. Asimismo se obtuvieron muestras de sangre para la determinación de glucosa, fibrinógeno, recuento de leucocitos y análisis de los marcadores moleculares. Las muestras de plasma fueron centrifugadas a 3.000 g durante 5 min y congeladas a 80 o C para la posterior determinación de marcadores moleculares de neuroexcitotoxicidad (glutamato), neuroinflamación (interleucina [IL]-6) y disrupción de la BHE (metaloproteasa [MMP]-9). Los niveles de IL-6 fueron evaluados mediante kits comercializados de análisis cuantitativo de inmunoabsorción ligado a enzimas (Quantikine; R & D Systems, Minneapolis, MN). La misma técnica fue empleada para la determinación de la MMP-9, mediante kits obtenidos de Biotrack, Amersham Pharmacia, UK. La determinación de glutamato fue realizada mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) utilizando el equipo Finnigan Spectra SYSTEM LC, siguiendo la metodología previamente descrita por nuestro grupo 12. En el momento del ingreso se realizó una TC cerebral para evaluar la presencia de leucoaraiosis y signos precoces de isquemia mediante la escala Alberta Stroke Program Early CT Score (ASPECTS) 10. La media de tiempo transcurrido entre la extracción de la muestra sanguínea y la realización de la TC cerebral fue de 37±24 min. Entre el cuarto y séptimo día se realizó una segunda TC cerebral para evaluar el tamaño del infarto y la presencia de transformación hemorrágica. El volumen del infarto fue calculado mediante la fórmula 0,5 a b c, en donde a y b son los diámetros mayores en sentido perpendicular y c el número de cortes de 10 mm en los que aparece el infarto. La evaluación de ambas TC cerebrales fue realizada por un neurorradiólogo ciego a los datos clínicos y moleculares. El subtipo etiológico del ictus fue clasificado de acuerdo con los criterios TOAST (Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment) 13 en aterotrombótico, cardioembólico, lacunar e indeterminado. La gravedad del ictus fue evaluada PACIENTES Y MÉTODOS mediante la Escala Canadiense (EC) en el momento del ingreso en el servicio de urgencias y a las 48±6 h 14. El deterioro 51 Realizamos un estudio prospectivo en el que incluimos de manera consecutiva 311 pacientes con ictus isquémico de menos de 24 h de evolución desde el inicio de los síntoción neurológico precoz (DNP) se definió como la disminu- en 1 punto o más en la EC entre el ingreso y las 48 h, de acuerdo con estudios previos 15, y el mal pronóstico fun- 221
cional como una puntuación en la Escala de Rankin modificada (mrs) >2 puntos a los 3 meses. Tabla 1 Características basales Análisis estadístico Los resultados para variables categóricas se expresan como porcentajes. Las variables continuas son expresadas como la media (desviación estándar) o mediana (cuartiles) y fueron comparadas mediante la t de Student o el test de Mann-Whitney, dependiendo de si la distribución fuese normal o no. Las proporciones se compararon mediante el test de chi cuadrado. La puntuación en la escala ASPECTS se categorizó en 7 y >7, según estudios previos 11, ya que este punto de corte presenta la mayor sensibilidad y especificidad para predecir el mal pronóstico funcional a los 3 meses, siendo los pacientes con puntuación 7 los que presentan peor pronóstico. Se realizó un modelo de regresión logística para evaluar las variables que se asociaron con el volumen del infarto y con la puntuación en la escala ASPECTS 7. Se consideraron como significativos aquellos valores de p < 0,05. Los análisis estadísticos se realizaron mediante el paquete informático SPSS 12.0 para Windows XP. RESULTADOS En la TC de ingreso 66 pacientes (26,7%) presentaron una puntuación en la escala ASPECTS 7 (el 25% de los pacientes dentro de las primeras 6 h tras el ictus, el 38,2% entre las 6 y las 12 h y el 36,8% después de las 12 h). En el análisis univariante encontramos que los pacientes con una puntuación en la escala ASPECTS 7 presentaban mayor temperatura, niveles de glucosa y fibrinógeno y menor puntuación en la EC al ingreso comparado con los pacientes con ASPECTS >7 (tabla 1). Los pacientes con ASPECTS 7 mostraron además un peor pronóstico a corto y largo plazo, definido como un mayor porcentaje de deterioro neurológico precoz, transformación hemorrágica, mal pronóstico a los 3 meses y mayor volumen del infarto (tabla 2). Los niveles basales de glutamato, IL-6 y MMP-9 fueron mayores en los pacientes con una puntuación en la escala ASPECTS 7 (tabla 1). El punto de corte que mejor discrimina la puntuación 7 en la escala ASPECTS fue de 134,3 µm para el glutamato (sensibilidad, 75%; especificidad, 78%; área bajo la curva, 0,779; p<0,0001), 15,5 pg/ml para la IL-6 (sensibilidad 80 %; especificidad, 68 %; área bajo la curva, 0,818; p<0,0001) y 87,2 ng/ml para la MMP-9 (sensibilidad, 86%; especificidad 75%; área bajo la curva, 0,866; p<0,0001). En el modelo de regresión logística encontramos que los niveles basales de glutamato >134,4 µm, IL-6 >15,5 pg/ml y MMP-9 >87,2 ng/ml se asociaban de manera independiente con una puntuación en la escala ASPECTS 7. Esta asociación se mantenía independiente tras ajustar por las variables seleccionadas en el modelo univariante (tabla 3). ASPECTS > 7 ASPECTS 7 (n = 171) (n = 76) Edad (años) 70,5 (7,9) 70,4 (8,3) 0,609 Hombres (%) 61,4 60,5 0,503 Antecedentes de hipertensión (%) 43,3 35,5 0,158 Antecedentes de dislipidemia (%) 16,4 14,5 0,432 Antedecentes de diabetes (%) 16,4 11,8 0,236 Consumo de tabaco (%) 15,8 13,2 0,372 Antecedentes de fibrilación auricular (%) 35,7 44,7 0,113 Temperatura al ingreso ( o C) 36,8 37,6 <0,0001 (36,4, 37,4) (37,1, 38,2) Presión arterial media (mmhg) 110 110 0,168 (93, 125) (90, 120) Glucosa al ingreso (mg/dl) 134 220 <0,0001 (112, 189) (171, 262) Leucocitos al ingreso ( 10 3 /ml) 7,3 7,5 0,264 (6,2, 8,5) (6,5, 9) Glóbulos rojos al ingreso ( 10 6 /ml) 4,6 (0,4) 4,7 (0,7) 0,138 Fibrinógeno al ingreso (mg/dl) 365 474 <0,0001 (353, 489) (374, 626) EC al ingreso 6,5 4 <0,0001 (3,5, 8) (3, 6) Leucoaraiosis en TC de ingreso (%) 27,5 17,1 0,053 Subtipo de ictus 0,178 Aterotrombótico (%) 39,8 36,8 Cardioembólico (%) 32,2 44,7 Lacunar (%) 19,3 10,5 Indeterminado (%) 8,8 7,9 Glutamato al ingreso (µm) 105,7 192,6 <0,0001 (88,8, 128,3) (133,5, 248,7) IL-6 al ingreso (pg/ml) 12,6 23,9 <0,0001 (7,9, 16,7) (16,9, 47,0) MMP-9 al ingreso (ng/ml) 47,2 164,2 <0,0001 (29,1, 89,1) (116,6, 302,6) IL-6: interleucina-6; MMP-9: metaloproteasa-9; ASPECTS: Alberta Stroke Program Early CT Score; TC: tomografía computarizada; EC: Escala Canadiense; MMP: metaloproteasa. 222 52 p
Tabla 2 Características pronósticas ASPECTS > 7 ASPECTS 7 (n = 171) (n = 76) Deterioro neurológico precoz (%) 16,4 80,3 <0,0001 Transformación hemorrágica (%) 10,5 38,2 <0,0001 Volumen del infarto (ml) 12 (5, 24) 46 (19, 84) <0,0001 Mal pronóstico a 3 meses (%) 32,7 57,9 <0,0001 ASPECTS: Alberta Stroke Program Early CT Score. p Niveles de glutamato (µm) 400 300 200 100 0 70 60 6 h >6 y 12 h >12 h Tiempo desde el inicio de los síntomas La asociación entre la puntuación en la escala ASPECTS 7 y los niveles de los biomarcadores presentaba una relación temporal, encontrándose que la asociación más fuerte en las primeras 6 h fue con el glutamato, entre 6 y 12 h con la IL-6 y después de las 12 h con la MMP-9 (fig. 1 y tabla 4). DISCUSIÓN Niveles de IL-6 (pg/ml) 50 40 30 20 10 0 En este estudio hemos encontrado una asociación temporal entre los marcadores moleculares de daño cerebral y la presencia de signos precoces en la TC cerebral medidos mediante la escala ASPECTS. Estas asociaciones fueron superiores para los marcadores de excitotoxicidad dentro las primeras 6 h tras el ictus, de neuroinflamación entre las 6 y 12 h y de disrupción de la BHE después de las 12 h. Estudios previos han demostrado que los niveles elevados de glutamato 16, IL-6 17,18 y MMP-9 19,20 se asocian con la presencia de deterioro neurológico precoz, mayor volumen de infarto y peor pronóstico funcional. En este estudio y en Niveles de MMP-9 (µg/ml) 400 300 200 100 6 h >6 y 12 h >12 h Tiempo desde el inicio de los síntomas Tabla 3 Odds ratio (OR) de los marcadores moleculares para predecir una puntuación en la escala ASPECTS 7, crudas y tras ajuste por variables significativas OR cruda OR ajustada* p Glutamato > 134,4 µm 10,5 (5,6, 19,7) 9,7 (4,2, 22,5) < 0,0001 IL-6 > 15,5 pg/ml 8,6 (4,5, 16,4) 4,4 (2,1, 9,4) < 0,0001 MMP-9 > 87,2 ng/ml 19,1 (9,1, 40,3) 18,4 (7,2, 47,1) < 0,0001 * Ajustada por temperatura, glucosa, fibrinógeno y puntuación en la escala canadiense al ingreso; IL-6: interleucina-6: MMP-9: metaloproteasa-9; ASPECTS: Alberta Stroke Program Early CT Score. Early CT Score. 53 223 0 6 h >6 y 12 h >12 h Tiempo desde el inicio de los síntomas ASPECTS > 7 7 Figura 1 Asociación entre los marcadores moleculares y la puntuación en la escala ASPECTS en función del tiempo. Las cajas muestran los valores de la mediana (línea horizontal dentro de la caja), cuartiles (bordes de la caja) y los valores máximos y mínimos (líneas al final de la caja) de los niveles de glutamato, IL-6 y MMP-9. IL-6: interleucina-6; MMP-9: metaloproteasa-9. ASPECTS: Alberta Stroke Program
Tabla 4 Modelo de regresión logística por grupos en relación con el tiempo desde el inicio de los síntomas. Variable dependiente: ASPECTS 7 a En conclusión, podemos decir que la puntuación en la escala ASPECTS puede ser considerada como un marcador subrogado de deterioro neurológico precoz y volumen final del infarto, y está asociado con marcadores moleculares de neuroexcitotoxicidad, neuroinflamación y disrupción de la BHE. 6 h (n = 127) 6-12 h (n = 68) >12 h (n = 52) BIBLIOGRAFÍA OR OR OR 1. Pulsinelli W. Pathophysiology of acute ischemic stroke. Lancet Glutamato > 134,4 µm 13,2 (5,4, 31,3) b 2,8 (0,9, 84,4) e 1,01 (0,7, 1,3) g 1992;339:533-6. IL-6 > 15,5 pg/ml 4,1 (1,5, 61,2) c 10,5 (4,1, 26,7) b 12,1 (1,06, 21,93) h 2. Cipolla MJ, McCall AL, Lessov N, Porter JM, Montos H. Reperfusion MMP-9 > 87,2 ng/ml 2,9 (0,8, 72,7) d 2,5 (1,1, 6,1) f 24,2 (4,8, 50,2) b decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke a Ajustado por temperatura, glucosa, fibrinógeno y puntuación en la escala 1997;28:176-80. canadiense al ingreso; b p < 0,001; c p = 0,060; d p = 0,068; e p = 0,076; 3. Castillo J, Rodríguez I. Biochemical changes and inflammatory p = 0,040; g p = 0,040; h p = 0,032; OR: odds ratio; IL-6: interleucina-6: MMP-9: metaloproteasa-9; ASPECTS: Alberta Stroke Program Early CT response as markers for brain ischaemia: molecular markers of Score. diagnostic utility and prognosis in human clinical practice. Cerebrovasc Dis 2004;17(Suppl. 1):7-18. 4. Dávalos A, Castillo J, Álvarez-Sabín J, Secades JJ, Mercadal J, López estudios previos se ha encontrado una asociación entre la presencia de una puntuación en la escala ASPECTS 7 y un mayor volumen del infarto, mayor frecuencia de transformación hemorrágica tras el uso de tratamiento trombolítico y peor pronóstico funcional a corto y largo plazo 11,21-24. La presencia de signos precoces de isquemia durante las primeras horas tras el ictus indican el desarrollo de edema citotóxico y consecuentemente de un daño cerebral irreversible 25. Por otro lado, la presencia de estos hallazgos sugiere que la puntuación en la escala ASPECTS está subrogada a los marcadores moleculares de neuroexcitotoxicidad, neuroinflamación y disrupción de la BHE, lo cual también se ha asociado con el daño cerebral en el ictus isquémico. S, et al. Oral citicoline in acute ischemic stroke. Stroke 2002; 33:2850-7. 5. Hacke W, Kaste M, Fieschi C, von Kummer R, Davalos A, Meier D, et al. Randomised double-blind placebo-controlled trial of thrombolytic therapy with intravenous alteplase in acute ischemic stroke (ECASS II). Lancet 1998;352:1245-51. 6. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke r-tpa Stroke Study Group. Tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke. N Eng J Med 1995;333:1581-7. 7. 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El análisis de los marcadores de neuroexcitotoxicidad, neuroinflamación y disrupción de la BHE puede incrementar la sensibilidad y especificidad de la escala ASPECTS en la predicción del volumen del infarto, deterioro neurológico precoz y pronóstico funcional a los 3 meses, y puede ser de utilidad en la selección de pacientes para tratamientos recanalizadores en aquellos centros en los que no se dispone de resonancia magnética para el manejo del ictus en fase aguda. PECTS) for assessing CT scans in patients with acute stroke. AJNR 2001;22:1534-42. 11. Barber PA, Demchuk AM, Zhang J, Buchan AM, for the ASPECTS Study Group. Validity and reliability of quantitative computed tomography score in predicting outcome of hyperacute stroke before thrombolytic therapy. Lancet 2000;355:1670-4. 12. Castillo J, Dávalos A, Naviero J, Noya M. Neuroexcitatory amino acids and their relation to infarct size and neurological deficit in ischemic stroke. Stroke 1996;27:1060-5. 13. 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