Título de la presentación en un máximo de dos líneas Aspectos técnicos de la Tinciones y de la Técnica de IFD para diagnóstico de Pneumocystis jirovecii. María Paz Aylwin Valentina Salas Sección Parasitología 2013
Introducción La pneumonía por Pneumocystis (PCP) es una enfermedad grave causada por el hongo Pneumocystis jirovecii. PCP es una de las infecciones oportunistas más frecuentes y graves en personas con sistemas inmunitarios debilitados, en particular las personas con VIH / SIDA, aunque, actualmente, este grupo de pacientes son menos propensos a contraer PCP, esta entidad sigue siendo un importante problema de salud pública. Guzmán et al., 2007; Hauser et al., 2011; CDC, 2013
Diagnóstico de Pneumocystis en el laboratorio: a) Muestra: El lavado broncoalveolar es la muestra recomendada a procesar, aumenta la sensibilidad diagnóstica al compararla con otro tipo de muestras respiratorias, tales como el esputo inducido. Puede que sea necesario para obtener la muestra mediante biopsia transbronquial o biopsia pulmonar abierta, estas técnicas de diagnóstico son más sensibles y específicos, pero también son más invasivas. Wang et al, 2007. CDC, 2013
Diagnóstico de Pneumocystis en el laboratorio: b) Técnicas de diagnóstico: Microscopía: Se basa en la visualización del hongo con la ayuda de coloraciones especiales, las más utilizadas son: Óptica Azul de Toluidina (menor tiempo de procesamiento y menor costo) Metenamina Argéntica Giemsa Fluorescencia Inmunofluorescencia directa (reconocida como la de mayor sensibilidad, mejor método microscópico). Otras técnicas: Actualmente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) también se utiliza para detectar el ADN de P. jirovecii en muestras clínicas. Rodiño et al., 2011; CDC, 2013
Tinción Azul de Toluidina O: Fundamento Tinción que permite visualizar sólo formas quística del hongo Rodiño et al., 2011
Azul de toluidina O positivo: Observación de formas quísticas de P. jirovecii con apariencia de gránulos de tonalidad azul-lila, de 5 µm de diámetro aprox. Agrupación en forma de panal Rodiño et al., 2011
Causas no detección con azul de toluidina O: Defectos del reactivo utilizado. Necesidad de controlar periódicamente la calidad de las coloraciones preparadas en el laboratorio. Preparación de reactivo de sulfatación crítico calidad de ácido acético glacial Poca carga de P. jirovecii en la muestra Infecciones mixtas (otros patógenos enmascaran el hongo). Rodiño et al., 2011
Control de Calidad Interno Uso de muestras Positivas De rutina Comerciales Cada vez que se procesa una muestra Con cambios de reactivo Evaluación de la lectura Comparación entre lectores Se sugiere graficar desempeño en el tiempo.
Ejemplo Inmunofluorescencia Indirecta para Enfermedad de Chagas
Inmunofluorescencia Directa Fundamento Anticuerpos monoclonales contra antígenos de superficie de Pneumocystis detectan no solo formas quísticas, sino también tróficas y de esporozoítos.
Inmunoflurescencia positivo: Observación formas de color verde manzana con morfología característica de P. jirovecii: estructuras redondas, 5-8 µm de dm. Solas o típicamente agrupadas, con pared celular nítida, algunas presentan fluorescencia principalmente en la periferia y otras en forma homogénea. Formas tróficas miden 1-5 µm, tienen núcleo redondeado y citoplasma de contorno irregular. Matriz interquística antigénica fluorescente que rodea las formas quísticas y tróficas. El quiste puede contener hasta ocho esporozoitos en forma de media luna o pleomórficos, de1-2 µm dm, y tienden a agruparse en masas dentro de la matriz extracelular. Rodiño et al., 2011, Merifluor
Imunofluorescencia Directa Diagnóstico Pneumocystis jirovecii Kits comerciales disponibles 1. Light Diagnostics Pneumocystis carinii DFA KIT (MILLIPORE). Fundamento de la prueba: Anticuerpos monoclonales anti- Pneumocystis carinni conjugados con FITC, reaccionan con antígenos de formas quísticas o trofozoítos presentes en la muestra del tracto respiratorio (LBA, esputo o muestras de biopsia tejido pulmonar). Complejo Ag-Ac se evidencia utilizando luz ultravioleta, la cual al iluminar al FITC, permite visualizarle con fluorescencia color verde manzana. Resultado Positivo: Fluorescencia verde manzana asociada indicada asociada a morfología característica : Quistes Matriz interquística Trofozoítos
Imunofluorescencia Directa Diagnóstico Pneumocystis jirovecii Kits comerciales disponibles 1. Merifluor Pneumocystis KIT (MERIDIAN). Fundamento de la prueba: Anticuerpos monoclonales anti-pneumocystis carinni conjugados con FITC, reaccionan con antígenos de formas quísticas o trofozoítos presentes en la muestra del tracto respiratorio (LBA, esputo o muestras de biopsia tejido pulmonar). Complejo Ag-Ac se evidencia utilizando luz ultravioleta, la cual al iluminar al FITC, permite visualizarle con fluorescencia color verde manzana. Material de background se diferencia al teñirse color naranja-rojizo. Resultado Positivo: Fluorescencia verde manzana asociada indicada asociada a morfología característica : Quistes Matriz interquística Trofozoítos
Puntos Críticos Técnica Inmunofluorescencia Directa Tiempo de procesamiento máximo de cada muestra: TIPO DE MUESTRA CONDICION MANTENIMIENTO TIEMPO MAX. PROCESAMIENTO LB /LBA EI TEJIDO Sin preservar Hasta 1 mes a 4 C Fijada en lámina con acetona Teñir dentro de 8 horas o congelar a -20 C hasta un mes. Digerido y no digerido 1 día a 4 C Digerido y congelado Fijada en lámina con acetona No fijada 1-2 meses Teñir dentro de 8 horas o congelar a -20 C hasta un mes. Congelar inmediatamente o fijar en acetona. Merifluor
Recolección y preparación muestra previo al test. Aumentar posibilidad de hallazgo mediante concentración de muestras: -LB y LBA: Método de centrifugación: 1.800 g x 10 min. (pellet resuspendido en 0,5 ml de sobrenadante) y Cytospin de Shandon: 900 rpm x 5 min. (< cantidad de muestra, < tiempo). -Esputo inducido: tratamiento previo DTT -Evitar uso de muestras tratadas con formaldehído, paraformaldehído o etanol (disminución o pérdida de inmunofluorescencia) Procedimiento del test: -Fijación de muestras: Light Diagnostics Pneumocystis carinii MILLIPORE: Extensiones secadas al aire libre a Tº ambiente, fijadas en metanol por 2 minutos, deben teñirse inmediatamente o guardarse a -20ºC con secante. MERIFLUOR Pneumocystis MERIDIAN: Extensiones secadas al aire libre, fijadas con dos gotas de acetona, deben ser analizadas en un término de 8 horas. - Tiempo incubación reactivo de detección, lavado cuidadoso de láminas, evitar secado de muestras post-lavado.
Interpretación de resultados: Lectura inmediata, operador dependiente: fluorescencia y morfología característica Pneumocystis jirovecii. Lectura tardía: máx. 48 hr post procedimiento, conservar láminas en oscuridad, 2-8 C. Control de Calidad: Light Diagnostics Pneumocystis carinii MILLIPORE MERIFLUOR Pneumocystis MERIDIAN INDICACIONES - Control positivo y negativo de muestras de origen humano, en cada análisis. -Control positivo de muestra origen humano, verificar funcionamiento del kit. - Evaluar visualmente componentes del kit (grumos, contaminación).
Recomendaciones para Título de la presentación en un tratamiento de NO máximo de dos líneas conformidades relacionadas con resultados insatisfactorios Alan Oyarce F. Encargado de Calidad Sección Parasitología
Que hacer frente a un resultado insatisfactorio en el control de calidad externo PEEC? Consideraciones El programa PEEC no tiene fines punitivos. Un mal resultado es una oportunidad para la mejora de los procesos. Permite comparar sus resultados con laboratorios similares. Permite monitorizar sus resultados en el tiempo y detectar tendencias. Bajo un SGC todo resultado insatisfactorio debe ser tratado como una no conformidad.
Cómo se trata una NO CONFORMIDAD? Levantamiento de la No Conformidad. Análisis de implicancia. Acción inmediata. Investigación de causas. Acción correctiva. Seguimiento y evaluación de la eficacia. Cierre de la no conformidad.
ANÁLISIS DE IMPLICANCIA Estimar la magnitud del resultado insatisfactorio. Analizar resultados históricos. Comparar mis resultados con otros laboratorios. Verificar que la evaluación sea adecuada al fin pretendido. Verificar si el mal desempeño pudo haber afectado a muestras de rutina.
ACCIÓN INMEDIATA Destinado a corregir el problema pero no la causa raíz. Debe estar de acuerdo al análisis de implicancia realizado. Si es posible repetir el ensayo, si el resultado es satisfactorio se podría considerar un error puntual. En esta etapa se puede tomar la decisión de suspender temporalmente el desarrollo de la técnica hasta asegurar los resultados.
INVESTIGACION DE CAUSAS Objetivo: detectar la causa raíz. La conservación y manipulación de la muestra fue la indicada? El análisis se realizó de acuerdo al procedimiento?. El informe y transcripción de datos (ambas partes) fue el correcto? El personal esta correctamente capacitado y evaluada su competencia? Reactivos, insumos y equipos están en óptimas condiciones?
ACCIÓN CORRECTIVA Objetivo: eliminar la causa raiz y evitar su recurrencia. Ejemplos: Solicitar una actualización del personal en el diagnóstico de la metodología. Modificación de los procedimientos en el desarrollo de la metodología. Incorporar un nuevo control de calidad interno en la técnica. Realizar pruebas de concordancia interlector en la interpretación de los resultados. Etc.
SEGUIMIENTO Y EVALUACIÓN DE LA EFICACIA Objetivo: Evaluar la efectividad de la acción correctiva. Ej: Resultado satisfactorio en la próxima evaluación. De acuerdo a que tan eficaz fue la medida correctiva realizada evaluar la posibilidad de dar por cerrada la no conformidad.
Título Situación de y la Proyecciones presentación del en un máximo de dos líneas Subprograma PEEC Pneumocystis jirovecii M a Isabel Jercic Sección Parasitología 2013
Antecedentes Este programa comenzó en 1994 Hasta 1997 se efectuaron 2 evaluaciones a los 15 laboratorios pertenecientes solo a Servicios de Salud. En el año 2000 se modificó el número de láminas enviadas a los participantes aumentando a 5 en cada evaluación.
Antecedentes A partir del año 2002 las muestras enviadas son analizadas por un tercer método diagnóstico Inmunofluorescencia directa con anticuerpos monoclonales. Se envía una alícuota de lavado por participante. En el año 2005 se disminuyó a 1 evaluación por año por falta de material de control.
Metodología Pneumocystis jirovecii 1 ANUALES LBA* HUMANO 5 LÁMINAS O TUBOS *LBA: Lavado broncoalveolar PULMON RATA
Sobre encomienda Tubo porta láminas 5 Láminas con frotis de la muestra
Criterios de Evaluación Informe correcto: 100 puntos Puntaje descontado Informe con resultado erróneo por cada muestra: 20 puntos Puntaje Final Se suman los resultados de los puntajes obtenidos para cada una de las 5 muestras. Puntaje Final = Σ n i Donde n i = puntaje por cada muestra
Criterios de Aceptabilidad El puntaje mínimo de aceptabilidad con este método corresponde a 80 puntos y el máximo a 100 puntos. Serán considerados resultados: Satisfactorio: los que obtengan un puntaje mayor o igual 80 puntos. Insatisfactorio: los que obtengan un puntaje menor a 80 puntos.
CÓDIGOS NO INFORMA Código Fundamento 10 Sin reactivo 20 Sin profesional 30 Otro (especificar) CÓDIGOS DE RESULTADOS Código Tinción 01 Negativo 02 Positivo CÓDIGOS DE TINCIÓN Código Tinción 51 Azul de toluidina O 52 Metenamina argéntica Inmunofluorescencia directa, 53 especificar marca reactivo comercial 54 Otro especificar
Recomendaciones Recomendamos a los participantes que el material de control se debe procesar como una muestra de paciente. Conservar las láminas teñidas o muestras hasta recibir el informe de resultados de cada evaluación, ya que este es el único medio de verificación frente a diferencias entre el informe recibido y lo observado por los participantes.
Informe de resultado Desde 1997 hasta 2010 Manual De 2010 a 2012 Formulario electrónico Desde 2013 Portal PEEC
Errores más frecuentes Confusión de elementos Confusión de códigos Falta informar los códigos de método No se respetan las instrucciones
Evaluación N 32 año 2013
Objetivo Evaluar la reproducibilidad de los métodos empleados mediante el envío de: Una misma muestra repetida en 3 critoubos diferentes. La identificación de Pneumocystis jirovecii en muestras preteñidas con Azul de Toluidina O.
Características de las muestras enviadas Las muestras correspondían a Lavado bronqueo alveolar. Las muestras fueron analizadas por Las técnicas de tinción: Metenamina Argéntica (MA) Azul de Toluidina O (AT) Reactivo comercial de Inmunofluorescencia directa con anticuerpos monoclonales específicos (IFD).
144 Lámina sin teñir 145 Lámina sin teñir 146 Lámina sin teñir 147 Lámina teñida 148 Lámina teñida Tinción Resultado IFD Resultado NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO Criotubo con muestra Criotubo con muestra Criotubo con muestra Lámina teñida Lámina teñida NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO
Resultados final de las muestras enviadas Muestra N Tipo Muestras Resultado MA ISP Resultado AT ISP Resultado IFD Reactivo comercial 1 1 LA Negativo Negativo Negativo 2 Lámina 3 Lámina LA Positivo Positivo Positivo LA Negativo Negativo Negativo
CRIOTUBO MUESTRA Nº RESULTADO 144 145 146 147 Lámina 148 Lámina 1 NEGATIVO 1 NEGATIVO 1 NEGATIVO 2 POSITIVO 3 NEGATIVO
Análisis de la evaluación Se incluyeron en este análisis las respuestas recepcionadas en el ISP Número de envíos 19 Número de Respuestas Recibidas 19 (100%) Número de Laboratorios Evaluados 19 (100%) Número de Respuestas Satisfactorias 6 (31,57%)
Comentarios generales La técnica de Azul de Toluidina O fue empleada por el 63 % de los participantes, seis contestaron con la técnica de Inmunofluorescencia Directa 32% y un participante con Metenamina Argéntica 5%. El 32% de las respuestas técnicamente válidas tuvieron un resultado final satisfactorio y de ellos El 50% obtuvieron 100 puntos con todas las muestras informadas correctamente.
Comentarios generales Los resultados obtenidos se consideran bajos y se explican principalmente por: Todos los participantes recibieron la muestra 1 en los Criotubos N 144-145 y 146 para evaluar reproducibilidad y presentaron problemas, informando la misma muestra con diferentes resultados. Lo que se tradujo en una baja en los puntajes finales. Los participantes recibieron 2 láminas preteñidas que se enviaron para evaluar la identificación. Sin embargo, no todos informaron, aludiendo que no realizan de rutina la tinción. En estos casos solo se consideró para el cálculo del puntaje lo informado.
Petición de revisión de resultados 2 participantes solicitaron de resultados Uno acogida porque se comprobó un error de numeración de las láminas No conformidad para SGC Parasitología Otro no acogida por diferencias en la morfología no correspondía a P. jirovecii
Consideración Final Se evaluó eliminar la evaluación, lo que fue descartado por: 6 participantes alcanzaron puntaje satisfactorio 3 obtuvieron 100 puntos EL principal problema fue error en la reproducibilidad 57 observaciones muestra 1 mezclando 26 Positivas 31 Negativas
Desempeño en el tiempo
Envíos/ Respuestas/Satisfactorias 1997-2013 25 20 15 10 Envíos Respuestas Satisfactorias 5 0 1997 1998 1er 2000 2º 2000 1er 2001 2º 2001 1er 2002 2º 2002 1er 2003 2º 2003 1er 2004 2º 2004 1er 2005 2do 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013
Problemas para el ISP Provisión de muestras Paneles Control de homogeneidad
Muestras recibidas en el ISP 2008-2013 PNE POSITIVAS 2008 115 13 2009 119 10 2010 96 6 2011 136 4 2012 101 3 2013 51 4
Propuestas Envío láminas fijadas para IFD. Colaboración para evaluar esta propuesta. Envío de evaluación extra para levantar la No conformidad antes de abril 2014. Colaboración con muestras.