Mecanismos moleculares de la neuropatología asociada a scrapie

Mecanismos moleculares de la neuropatología asociada a scrapie Curso Terapia génica 08-09 Inmaculada Martín Burriel Encefalopatías Espongiformes Transmisibles Especie humana: Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ) Kuru Insomnio Familiar Fatal (IFF) Gerstmann-Straussler- Scheinker (GSS) Introducción Especies animales: Encefalopatía Espongiforme Bovina (EEB) Encefalopatía Transmisible del Visón Caquexia Crónica de ciervos (CWD) Scrapie de ovino y caprino 1

Introducción Características EETs Enfermedades neurodegenerativas fatales Origen: Genético: ECJ, IFF, GSS Esporádico: ECJ Infeccioso o transmitido: Kuru, EEB, scrapie, nvecj Agente causal infeccioso PrP (Prion Protein) Introducción PrP C PrP Sc Codificadas por el mismo gen Misma secuencia aminoacídica Diferente conformación Proteína Proteasa-sensible Proteína Proteasa-resistente 2

Características histopatológicas comunes Introducción Acumulación de PrP Sc Espongiosis Vacuolización. Muerte neuronal Muerte neuronal Introducción Muerte Celular Programada (Liberski et al.,2004) Apoptosis (MCP-I) Autofagia (MCP-II) MCP tipo III Se ha observado apoptosis en distintos modelos de EETs in vivo* e in vitro**. Mecanismos moleculares? Relación con las lesiones histopatológicas? Fairbairn et al., (1994)* Giese et al., (1995)* Gray et al., (1999)* Forloni et al., (1993)** Brown et al., (1996)** O Donovan et al., (2001)** 3

Introducción Apoptosis Modificaciones morfológicas características No conlleva inflamación Requiere de la activación de genes específicos Cascadas moleculares de apoptosis BAX 4

Vía mitocondrial Introducción In vitro: Activación por péptidos PrP PrP C homología de secuencia con Bcl-2 PrP C inhibe la apoptosis inducida por Bax In vivo: Bax Bcl-2 (Park et al. 2000) = Bax = Bcl-2 (Siso et al., 2002) Tg enfermedad priónica Bax muerte neuronal (Chiesa et al., 2005) Bax EEB = muerte n. (Coulpier et al., 2006) www.sgul.ac.uk Qué ocurre en scrapie? Introducción Prototipo de enfermedad priónica de origen infeccioso Hay cambios en la regulación de Bax o Bcl-2? Están relacionados con las lesiones de EETs? Están implicados otros miembros de la familia de Bcl-2? Bcl-x(L): neuroprotector in vitro en enfermedades priónicas (Sakudo et al., 2003) 5

Animales Ovino con scrapie (n=9) Hembras 3-5 años Genotipo ARQ/ARQ Rasa Aragonesa Sintomatología clínica Ovino control (n=5) Igual sexo, edad, genotipo y raza Grupo de Investigación en enfermedades priónicas y lentivirus animales Médula oblongada Núcleo motor del hipogloso (H) Núcleo del tracto solitario (S) Núcleo del nervio trigémino (V,NV) Núcleo cuneatus medial (ACN) Núcleo de la oliva (IO) Núcleo parasimpático del nervio vago (MX) Formación reticular (RF) Fijación Inclusión RF RNA later 6

Expresión génica Marcadores apoptosis: Bax Bcl-2 Factor Normalización*: ACTB 18SRNA Media geométrica GAPDH *Vandesompele et al. (2002) Gen Pr. Forward Sonda Pr. Reverse Ta Cycles Bcl-2 5 -TGGTGGAGGAGCTCTTCAGG-3 FAM-ATGCGCCCCCAGTTCACCCC-TANRA 5 -TCCGAACTCAAAGAAGGCCA-3 60 40 Bax 5 -GTAACATGGAGCTGCAGAGG-3 FAM-AGTAACATGGAGCTGCAGAGGATGATCGC- TAMRA 5 -CTTGAGCACCAGTTTGCTGG-3 63º 40 GAPDH 5 -TCCATGACCACTTTGGCATCGT-3' VIC-AGGGACTTATGACCACTGTCCACGCC-TAMRA 5 -GTCTTCTGGGTGGCAGTGA-3 60 40 ACTB 5 -ATGCCTCCTGCACCACCA-3 SYBRGREEN 5 -GCATTTGCGTGGACGAT-3 60 45 18SRNA 5 -GGGAATGACGGTTCGATTCC-3 5 -FAM-TCCAAGGAAGGCAGCAGGCGC-TAMRA-3 5 -GGGTCGGGAGAGCGTAATTT-3 60º 35 Diferencias entre grupos: T Student Determinación IHQ Marcadores de apoptosis: Bax (1:300; rabbit polyclonal P-19; Santa Cruz) Bcl-2 (1:200; rabbit polyclonal; Upstate) Lesiones EETs: PrP Sc: L42 (1:500; R-Biopharm, Germany) HE (vacuolización, espongiosis) Apoptosis: Apoptag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (Chemicon International) Caspasa-3 activa (1:40; mouse monoclonal Ab-4; Calbiochem) Utilizada en la identificación de la apoptosis en Alzheimer (Stadelmann et al., 1999) 0-3 7

Análisis estadístico Análisis no paramétricos: Diferencias entre grupos Test Mann-Whitney Efecto del área Test ANOVA Kruskal-Wallis Test Mann-Whitney Relación entre valores de inmunomarcaje de Bax y lesiones histopatológicas Correlación de Spearman Test Chi cuadrado: Relación Bax/Vacuolización (H, MX) Resultados: Expresión génica Scrqpie Control Scrqpie Control Scrqpie Control Aumento de la expresión del factor pro-apoptótico BAX en ovino infectado de forma natural con scrapie. 8

Resultados IHQ Bax Bax - Scrapie Control Scrapie PrP Sc H-E - Sobre-expresión de Bax en neuronas de ovino con scrapie (Mann-Whitney U test p<0.001) - No hay un efecto significativo del área en la expresión de Bax - No se observan cambios en Bcl-2 Correlación Bax y PrP Sc Correlación significativa entre Bax intraneuronal y depósito intraneuronal de PrP Sc (rs=0.429; p<0.01 ) y en neuropilo (rs=0.297; p<0.05 ) Efecto significativo de PrP Sc en los valores de Bax (Kruskal-Wallis test p<0.01) Correlación entre Bax y las áreas de vacuolización (rs=0.362; p<0.05) Bax y vacuolización son procesos independientes 9

Apoptosis TUNEL: -Glías positivas en scrapie y control - No marcaje en neuronas TUNEL Caspasa-3 Caspasa-3 Caspasa-3 CASPASA-3 ACTIVA: - Se observa en neuronas sin aspecto apoptótico tanto en scrapie como control - Glías apoptóticas positivas en scrapie y control No existen evidencias de apoptosis Falta de evidencias de apoptosis (Liberski et al., 2004) Poca densidad neuronal en la médula oblongada y/o PrP Sc Bloqueo de apoptosis por vía mitocondrial/ inducción otras vías 10

Animales Ovino con scrapie (n=13) Hembras 3-5 años Genotipo ARQ/ARQ Rasa Aragonesa Sintomatología clínica Ovino control (n=5) Igual sexo, edad, genotipo y raza Grupo de Investigación en enfermedades priónicas y lentivirus animales Regiones del SNC Cortex Basal ganglia Hippocampus RNA IHQ 11

Expresión de Bax Cálculo del Factor de Normalización*: Media geométrica de los 3 o 4 genes más estables en cada área (Objetivo 4) *Vandesompele et al. (2002) 1.8 1.6 1.4 1.2 * * 1 0.8 Control Scrapie 0.6 0.4 0.2 0 Medula Obl. Diencéfalo Cerebelo Corteza AF Determinación tisular Bax Hipocampo Cerebelo - Hipotálamo Médula oblongada 12

Animal Sc Mo P Cerebelo Bg Corteza T Ht H Co GM WM Cv Cc Fc Oc Pc 0-438 C1 / / 0-439 C2 / 0-441 C3 n.d. n.d. 0-442 C4 0-73 SC1 / / / 0-85 SC2 / 0-86 0-107 SC3 SC4 / / / Marcaje intraneuronal / 0-120 SC5 0-122 SC6 / / 0-138 SC7 0-139 SC8 0-248 SC9 n.d. n.d. Gran variedad interindividual Sobre-expresión de Bax IN Causas de la muerte neuronal (Liberski et al.; 2004) : - Acción tóxica de PrP Sc - Muerte en zonas con poco depósito - Pérdida de acción neuroprotectora de PrP C : - Muerte en zonas con acumulación de PrP Sc Correspondencia de Bax IN con las zonas donde se observa un mayor depósito de PrP Sc pérdida acción neuroprotectora de PrP C 13

Apoptosis (caspasa-3) Gran variabilidad interindividual Cerebelo Cerebelo Células de cerebelo con morfología apoptótica Nunca C. Purkinjes Resultados similares en cerebelo de CJD (Puig y Ferrer, 2001) Cerebelo Médula espinal Punteado fino en el citoplasma neuronal No existen diferencias en scrapie y control Falta de evidencias de apoptosis Poca densidad neuronal en la médula oblongada/ PrP Sc Bloqueo de apoptosis por vía mitocondrial/ inducción otras vías 14

Cascadas moleculares de apoptosis FASL/TNFα FAS/TNFR1/TNFR2 HSP70 HSP90 HSP70 HSP70 HSP70 HSP90 HSP27 MCL1 BAK BAX BCL2 BAD BCLXL TGF-β HSP27 BCLXS HSP70 HSP90 APAF1 AIF HSP27 PARP1 Expresión génica Gen Pr. Forward Sonda Pr. Reverse Ta C Bcl-2 5 -TGGTGGAGGAGCTCTTCAGG-3 FAM-ATGCGCCCCCAGTTCACCCC-TAMRA 5 -TCCGAACTCAAAGAAGGCCA-3 60 40 Bax 5 -GTAACATGGAGCTGCAGAGG-3 FAM-AGTAACATGGAGCTGCAGAGGATGATCGC- TAMRA 5 -CTTGAGCACCAGTTTGCTGG-3 63 40 Mcl-1 5 -GGCTTTCCAAGGCATGCTT-3 FAM-TCGAGTGATGGTTCATGTTTTCAGTGACG- TAMRA 5 -GAGTCACAATCCTGCCCCAG-3' 60 40 Bcl-xL 5 -CAGGCGATGAGTTTGAACTG-3' FAM-CGACCTGACGTCCCAGCTCCACA-TAMRA 5 -TCCCGGAAGAGTTCATTCAC-3' 60 45 Bcl-xS 5 -TCAGAGCTTTGAACAGGACACG-3' SYBRGREEN 5 -TCAGGAACCAGCGGTTGAAG-3' 60 45 Bad 5 -CAGAGTTTGAGCCGAGTGAG-3' SYBRGREN 5 -GGCTGTTAGCCAGTGCTTG-3' 59 45 Bak 5 -TCCATGACCACTTTGGCATCGT-3' VIC-AGGGACTTATGACCACTGTCCACGCC- TAMRA 5 -GTCTTCTGGGTGGCAGTGA-3 60 40 Análisis mediante RT-PCR en Tiempo Real T Student 15

MATERIAL Y MÉTODOS Expresión de genes de apoptosis y gliosis PCR a Tiempo Real DISEÑO DE CEBADORES Y SONDAS Gen TNF-α TNFR1 TNFR2 FAS FASL TGF-β1 AIF APAF1 PARP1 Número de acceso X56756 U90937 NM_001040490 AB011671 XM_584322 X76916 AF529274 XM_617966 D90073 Cebadores y sondas (5 3 ) pb Tª (ºC) F: CCCTTCCACCCCCTTGTTC R: GGCTCTTGATGGCAGAGAGGAT F: CTCAGGACCCAGGCACTACAG R: CCCGCAAATGATGGAGTAGAG F: GATGGGTCCTGTCTTGGTGTGT R: CAAAACAACAAGGGCTCCAGAA F: CTGGAGCAAGTTCCTGCCAA R: CTCCGTCGCGTTTGCAAT F: GAAGAGGAGGGACCACAACACA R: CTTTGGCTGGTGGACTCTCTGA S: FAM-TGGTGGCCCTGGTTGGATTGGG-TAMRA F: GCACGTGGAGCTGTACCAGAA R: GCCACTGCCGCACAACTC F: TGGAGGCACAGCTGCTTTT R: CGGCAGCTCAGGATCTTCA F: GCCAAGCAGGAGGTCGATAA R: GCAAGCATGGTAAACAGCATCT F: AGTGAAGGCCACGATTGAGAA R: TCAGACACGACACGGATGTTG 277 60 134 59 144 60 105 60 147 61 125 60 94 59 117 60 147 59 Cálculo Factor de Normalización Cálculo del Factor Normalización *Vandesompele et al. (2002) Symbol ACTB G6PDH GAPD 18S rrna HPRT1 RPL-32 SDHA YWHAZ Name Beta actin Glucose-6-phosphate dehydrogenase Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 18S ribosomal RNA Hypoxanthine phosphoribosyl-transferase 1 Ribosomal protein L32 Succinate dehydrogenase complex, subunit A Tyrosine 3-monooxygenase/ tryptophan 5-monooxygenase activation protein, zeta polypeptide Lyahyai et al., enviado (Exp Mol Path) 16

Análisis GeNorm - Todos los HK mostraron valores de estabilidad M<1.5 (recomendado por Vandesompele et al. (2002)) - GeNorm ordena los HK en función de su estabilidad Corteza Frontal ACTB SDHA GAPDH Diencéfalo YWHAZ SDHA GAPDH Cerebelo G6PDH SDHA ACTB Médula oblongada G6PDH GAPDH RPL32 YWHAZ G6PDH YWHAZ HPRT HPRT ACTB GAPDH YWHAZ G6PDH rrna rrna ACTB rrna RPL32 RPL32 SDHA RPL32 HPRT HPRT rrna Lyahyai et al., enviado (Exp Mol Path) Análisis GeNorm V2/3 V3/4 V4/5 V5/6 V6/7 V7/8 0,16 0,14 Valores de Vn/Vn1 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 V: variación entre dos FN secuenciales V>0.15 es necesario añadir un nuevo HK 0,02 0,00 Cortex Cortex_healthy Cortex_scrapie Cerebellum Cerebellum_healthy Cerebellum_scrapie M.oblongata M.oblongata_healthy M.oblongata_scrapie Thallamus Thallamus_healthy Thallamus_scrapie Lyahyai et al., enviado (Exp Mol Path) 17

Series de HK Corteza Frontal ACTB/SDHA GAPDH Diencéfalo YWHAZ /SDHA GAPDH Cerebelo G6PDH /SDHA ACTB Médula oblongada G6PDH / GAPDH RPL32 YWHAZ G6PDH YWHAZ HPRT HPRT ACTB GAPDH YWHAZ G6PDH rrna rrna ACTB rrna RPL32 RPL32 SDHA RPL32 HPRT HPRT rrna Media geométrica FN Lyahyai et al., enviado (Exp Mol Path) 6 5 4 3 2 1 0-1 6 5 4 3 2 1 0-1 Perfiles de expresión génica de marcadores de apoptosis - Inducción Medulla de distintos Oblongata mecanismos de la vía mitocondrial Diencephalon - Efecto neuroprotector BAD de Mcl-1 BAD HSP90 250 BAK HSP90 - Facilitar la deposición temprana BAX * del prión (Hsp27, Hsp90) 250 Control Scrapie HSP73 200 HSP72 150 BCL-2 HSP27 100 BCL-XL 50 PARP1 0 BCL-XS * TGFB1 MCL-1 * FASL AIF * Prion * FASGiosis Spongiosis APAF1Neuronal deposition * TNFR2 TNFR1 TNFa * vacuolization HSP72 Prefrontal cortex * HSP90 HSP73 BAD 250 200 150 BAK * BAX BCL-2 * * HSP27 100 BCL-XL * Prion Gliosis 50 Spongiosis Neuronal deposition PARP1 0 vacuolization BCL-XS TGFB1 MCL-1 FASL AIF * FAS APAF1 TNFR2 TNFa TNFR1 BAK* BAX* *HSP73 200 6 HSP72 150 BCL2 5 HSP27 100 BCL-XL 50 4 PARP1 0 BCL-XS 3 2 TGFB1 MCL-1 1 FASL AIF 0 *FAS APAF1 Prion Giosis TNFR2 Spongiosis TNFa Neuronal -1 deposition TNFR1 vacuolization 6 Cerebellum 5 4 3 BAD HSP90 250 BAK HSP73 BAX 2 200 HSP72 1 150 BCL-2 * 0 HSP27 100 BCL-XL * Prion Giosis 50 Spongiosis Neuronal deposition PARP1 0 TGFB1 FASL FAS BCL-XS vacuolization MCL-1 * AIF APAF1 * TNFR2 TNFa TNFR1 - Inducción de las vías mitocondrial y extrínseca - Cambios de expresión relacionados con gliosis - Efecto neuroprotector de Mcl-1 y Hsp70 - Inducción de vías independiente de caspasas (AIF) 18

Conclusiones vía Mitocondrial En scrapie natural ovino se induce la expresión de Bax. La correlación de Bax con PrP Sc indica que la inducción de Bax puede ser consecuencia de la pérdida de actividad neuroprotectora de PrP C El incremento de Bax no lleva asociada la detección de apoptosis no tiene un papel relevante en la inducción de apoptosis en scrapie ovino Serrano, Lyahyai et al. (en revisión) Vet Res Conclusiones vía mitocondrial La represión de Bcl-2 y Bcl-xL y el aumento de Bak y Bcl-xs pueden estar asociados a la neuropatología de scrapie Podría existir apoptosis independiente de caspasas Se observan mecanismos neuroprotectores (Mcl-1) que podrían ralentizar la apoptosis 19

CONCLUSIONES VÍA EXTRÍNSECA y HSP 9. El incremento de expresión de los factores TNF-α y TNFR2 en médula oblonga de ovino con scrapie natural se correlaciona con el alto grado de gliosis observado en esta zona. 10. En los tejidos altamente lesionados, médula oblonga y diencéfalo, los factores involucrados en las vías de apoptosis mitocondrial (AIF) y extrínseca (TNF-α, TNFR2 y FAS) pueden participar en la pérdida neuronal descrita en estas áreas. 11. En el diencéfalo el abundante depósito de PrP Sc induce la síntesis de miembros de la familia HSP70 que podrían actuar como factores neuroprotectores frente a la inducción de apoptosis por vía mitocondrial y extrínseca. En áreas menos afectadas como la corteza anterior frontal la reducción de HSP90 y HSP27 podría contribuir a la acumulación de proteína prión en estadios tempranos de scrapie. 12. El incremento de la expresión de Hsp90 en las células de Purkinje en animales con scrapie podría tener un efecto neuroprotector frente al estrés inducido por la proteína prión en cerebelo. Serrano, Lyahyai et al. (en revisión) Vet Res Trabajo futuro Confirmar la localización tisular de los miembros de Bcl-2 que han mostrado cambios significativos Determinación de factores que participan en las vías de apoptosis independiente de caspasas Aparición de estrés oxidativo en fases preclínicas (Yun et al., 2006): La apoptosis también ocurre en estadíos tempranos asintomáticos? Análisis de ovino preclínico 20

Equipo de Trabajo Investigadores del Laboratorio de Genética Bioquímica de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza Dr. Jaber Lyahyai Lamarti Dra. Carmen Serrano Calvo Dra. Rosario Osta Pinzolas Dra. Pilar Zaragoza Fernández Investigadores del Grupo de investigación en enfermedades priónicas y lentivirus Dra. Rosa Bolea Bailo Dra. Eva Monleón Dr. Juan J. Badiola Díez 21