RIDASCREEN Helicobacter IgA, IgG

RIDASCREEN Helicobacter IgA, IgG Nº de art.: K2311 (IgA) K2321 (IgG) R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D-64297 Darmstadt, Alemania Tel.: +49 (0) 61 51 81 02-0 / fax: +49 (0) 61 51 81 02-20

1. Área de aplicación Para el diagnóstico in vitro. Los ensayos RIDASCREEN Helicobacter son inmunoensayos enzimáticos (EIA) para la determinación semicuantitativa de anticuerpos IgA o IgG contra Helicobacter pylori en el suero humano. Los ensayos deberían realizarse si existe la sospecha fundada de una infección con Helicobacter, o para clarificar el estado inmunológico. 2. Resumen y descripción del ensayo Debido a la reacción del sistema inmunológico, tras una infección con Helicobacter se produce la formación de anticuerpos específicos contra los agentes patógenos, los cuales pueden determinarse en el suero mediante procedimientos inmunológicos. En este caso, para establecer el valor informativo de un ensayo, no sólo es importante la elección del antígeno del agente patógeno específico utilizado, sino también el método de comprobación empleado. Existe la posibilidad de diferenciar las clases de inmunoglobulinas individuales en el inmunoensayo enzimático, y por ello pueden emitirse declaraciones más precisas sobre el estado inmunológico de un paciente en comparación con otros métodos serológicos (p. ej. HHT o KBR). 3. Principio del ensayo Los antígenos purificados se ligan a una placa de microtitulación. Los anticuerpos existentes en muestras de pacientes se ligan a los antígenos, y en un segundo paso, se determinan con anticuerpos antihumanos marcados con enzimas (conjugados). Con la acción de la enzima, un sustrato incoloro (H 2 O 2 /TMB) se convierte en un producto final azul. La reacción enzimática finaliza con la adición de ácido sulfúrico. Al mismo tiempo se produce un cambio de color de azul a amarillo. La medición final se efectúa en un fotómetro a 450 nm (longitud de onda de referencia 620 nm). RIDASCREEN Helicobacter 11-05-05 2

4. Contenido del envase Tab. 1: Contenido del envase (los reactivos de un envase permiten 96 determinaciones) K2311 IgA K2321 IgG Plate 96 det. Placa de microtitulación; 12 de tiras de microtitulación (separables) en el bastidor de sujeción; revestida con antígeno H. pylori SeroPP 110 ml Búfer de muestra, listo para usar; búfer de fosfato NaCl-Lsg., coloreado en amarillo; SeroWP 100 ml Búfer de lavado, concentración x 10; búfer Tris NaCl-Lsg.; contiene 0,2 % de Bronidox-L y 0,5% de Tween 20 Control IgA + tapa azul 2,5 ml Control estándar IgA, listo para usar; suero humano diluido, coloreado en azul; Control IgG + tapa verde 2,5 ml Control estándar IgG, listo para usar; suero humano diluido, coloreado en verde; Control IgA tapa incolora 1,2 ml Control negativo IgA, listo para usar; suero humano diluido; Control IgG tapa incolora 1,2 ml Control negativo IgG, listo para usar; suero humano diluido; Control IgA A tapa azul Control IgA B tapa azul 1,2 ml Control A IgA, listo para usar; suero humano diluido; 1,2 ml Control B IgA, listo para usar; suero humano diluido; Control IgG A tapa verde Control IgG B tapa verde 1,2 ml Control A IgG, listo para usar; suero humano diluido; 1,2 ml Control B IgG, listo para usar; suero humano diluido; SeroA LD tapa azul 12 ml Conjugado IgA antihumano (cabra), listo para usar; conjug. de peroxidasa. Anticuerpos en solución de proteínas estabil.; contiene 10 ppm de Proclin, 0,01% de Methylisothiazolon y 0,01% de Bromonitrodioxan SeroG HD tapa verde 12 ml Conjugado IgG antihumano (conejo), listo para usar; conjug. de peroxidasa. Anticuerpos en solución de proteínas estabil.; contiene 10 ppm de Proclin, 0,01% de Methylisothiazolon y 0,01% de Bromonitrodioxan SeroSC 12 ml Sustrato H 2 O 2 /Tetramethylbenzidin; listo para usar SeroStop 12 ml Reactivo de parada; ácido sulfúrico 1 N; listo para usar RIDASCREEN Helicobacter 11-05-05 3

5. Reactivos y su almacenamiento El kit de prueba puede utilizarse hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta si se almacena a 2 8 C. El búfer de lavado diluido puede conservarse durante cuatro semanas si se almacena a 2 8 C, y una semana si se almacena a temperatura ambiente (20 25 C). Transcurrida la fecha de caducidad no puede ofrecerse ninguna garantía de calidad. La bolsa de aluminio donde se encuentra la placa de microtitulación ha de abrirse de forma que el cierre clip no se corte. Las tiras de microtitulación no necesarias han de almacenarse de inmediato en la bolsa de aluminio cerrada a 2 8 C. Se ha de evitar la contaminación de los reactivos, así como la incidencia de luz directa sobre el sustrato incoloro. 6. Reactivos adicionales necesarios accesorios requeridos 6.1. Reactivos Agua destilada o desionizada 6.2. Accesorios Incubadora a 37 C Tubo de muestras Mezcladora Vortex Micropipetas para volúmenes de 10 100 µl y 100 1000 µl Cilindro de medición (1000 ml) Cronómetro Lavadora para placas de microtitulación o pipeta de canal múltiple Fotómetro para placas de microtitulación (450 nm, filtro de referencia 620 nm) Papel de filtro (paños de laboratorio) Recipientes para residuos con una solución de hipoclorito sódico de 0,5 % 7. Medidas de precaución Sólo para el diagnóstico in vitro. Este ensayo sólo debe realizarse por personal de laboratorio con la debida formación. Se han de respetar las directivas para el trabajo en laboratorios médicos. Se han de cumplir estrictamente las instrucciones de uso para la realización del ensayo. No pipetear las muestras o reactivos con la boca, y evitar el contacto con heridas en la piel o las mucosas. Durante la manipulación de las muestras, usar guantes desechables y lavarse las manos una vez finalizado el ensayo. Se prohíbe fumar, comer y beber en las áreas donde se trabaje con las muestras o los reactivos de prueba. RIDASCREEN Helicobacter 11-05-05 4

Los sueros de control que se encuentran en el kit (control estándar, control negativo, control A y B) se han examinado en lo referente a HIV-Ak, HCV-Ak y HbsAg, proporcionando resultados negativos. No obstante, deberían tratarse como potencialmente infecciosos, al igual que las muestras de pacientes y todos los materiales que entren en contacto con los mismos, y manipularse de acuerdo con las correspondientes disposiciones de seguridad nacionales. El control estándar y el control negativo, el control A y B y el búfer de muestra contienen 0,01 % de Thimerosal como conservante. Se ha de evitar el contacto con la piel o la mucosa. El búfer de lavado contiene 0,2% de Bronidox-L como conservante. Se ha de evitar el contacto con la piel o la mucosa. El peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 - sustrato) puede provocar causticaciones. Manipular con cuidado! El reactivo de parada contiene ácido sulfúrico 1 N. Evitar el contacto con la piel y la ropa. Si entra en contacto con la piel, enjuagar con agua. Todos los reactivos y materiales que entren en contacto con muestras potencialmente infecciosas tienen que tratarse con desinfectantes adecuados o esterilizarse en autoclave durante al menos una hora a 121 ºC. PRECAUCIÓN: Para evitar la liberación de gases tóxicos, los residuos líquidos que contengan reactivos de parada tienen que neutralizarse antes de echarse en una solución de hipoclorito. 8. Recolección y almacenamiento de las muestras El ensayo se ha desarrollado para el examen de muestras de suero humano. Tras la extracción de sangre, para evitar una hemólisis, el suero debería separarse del coágulo sanguíneo con la mayor rapidez posible. Hasta la realización del ensayo, las muestras deben almacenarse en condiciones frías o congeladas. Se debe evitar necesariamente la congelación y descongelación repetida de muestras, así como la contaminación microbiana. El uso de muestras desprovistas de calor, lipémicas, hemolíticas, ictéricas o turbias pueden provocar resultados erróneos. Tab. 2: Almacenamiento de muestras Suero no diluido Suero diluido 2 8 C 20 C 2 8 C 1 semana > 1 semana 7 horas RIDASCREEN Helicobacter 11-05-05 5

9. Realización del ensayo 9.1. Generalidades Los reactivos y las tiras de microtitulación tienen que adaptarse a la temperatura ambiente (20 25 C) antes de utilizarse. Las tiras de microtitulación sólo han de extraerse de la bolsa de aluminio cuando se haya alcanzado la temperatura ambiente. Los reactivos deben mezclarse bien antes de utilizarse. El kit ha de almacenarse de inmediato a 2 8 C después de usarse. Sólo debería extraerse la cantidad de reactivo necesaria para la realización del ensayo. El reactivo excesivo no debe volver al recipiente, pues ello puede provocar contaminación. Las tiras de microtitulación no pueden utilizarse varias veces. Los reactivos y las tiras de microtitulación no deben utilizarse si el envase está dañado o los recipientes no fueran estancos. Algunos de los reactivos contenidos en el kit no son específicos para ensayos. Esos reactivos están marcados con Sero (p. ej. SeroPP), y también pueden utilizarse en otros RIDASCREEN Sero EIA con los reactivos correspondientes. Los sueros de control son específicos de lote. Se prohíbe el intercambio de los sueros de control entre kits con diferentes números de lote. Los controles A y B de RIDASCREEN Sero ELISA se ofrecen como muestras de control específicas adicionales para el correspondiente kit de prueba RIDASCREEN Sero ELISA. Se trata de muestras de control que permiten una garantía de calidad adicional, y que pueden utilizarse opcionalmente. Las mismas contienen suero de control humano con diferentes concentraciones de anticuerpos. 9.2. Elaboración del búfer de lavado 1 parte del concentrado del búfer de lavado SeroWP se mezcla con 9 partes de agua destilada. Para ello, 100 ml del concentrado se echan en una probeta con pie de 1000 ml que se llena con agua destilada en su totalidad. Los cristales eventualmente existentes en el concentrado han de disolverse previamente por calentamiento (baño de agua a 37 C). El búfer de lavado diluido puede conservarse durante cuatro semanas si se almacena a 2 8 C, y una semana si se almacena a temperatura ambiente (20 25 C). 9.3. Preparación de las muestras Antes de iniciar el ensayo, las muestras de suero a examinar se diluyen 1:50 con el búfer de muestra SeroPP. p. ej. 10 µl de suero + 490 µl de SeroPP RIDASCREEN Helicobacter 11-05-05 6

Atención! El control negativo y el control estándar, y los controles A y B están listos para usar y no deben diluirse o absorberse. 9.4. Primera incubación Tras la colocación de un número adecuado de cavidades en el bastidor de sujeción, en los pocillos correspondientes se pipetean 100 µl de los sueros diluidos y de los controles listos para usar; la posición A1 (valor blanco del reactivo) permanece libre. El control negativo Control IgA - o Control IgG - se efectúa una vez, y el control estándar Control IgA + o Control IgG +, dos veces. Los controles A y B se efectúan una vez. La placa se incuba en una incubadora durante 30 minutos a 37 C. En ese caso, la base de las cavidades no debería entrar en contacto con materiales que conduzcan bien el calor. La placa de microtitulación ha de cubrirse durante la incubación. Se han de utilizar controles conformes con la determinación (IgA o IgG). A1 Valor blanco del reactivo B1 Control negativo C1 Control estándar D1 Control estándar E1 Control A F1 Control B G1, H1 Suero de paciente 1, 2, etc. Atención! La placa de microtitulación no debe ponerse en un recipiente de incubación frío que sólo se caliente a 37 C durante la incubación. El recipiente tiene adaptarse previamente a 37 C. 9.5. Lavado Las cavidades deberían vaciarse en un recipiente de desechos con solución de hipoclorito a efectos de desinfección. Seguidamente, la placa se sacude sobre un papel absorbente para eliminar la humedad residual. A continuación se lava 4 veces con 300 µl de búfer de lavado. Tras cada ciclo de lavado ha de efectuarse un vaciado completo sacudiendo en una zona no utilizada del papel. Si se utiliza una máquina automática de lavado, se ha de controlar el ajuste correcto del aparato en función del tipo de placa utilizada. Tras el lavado, la placa debería sacudirse sobre un papel limpio y absorbente para eliminar la humedad residual. RIDASCREEN Helicobacter 11-05-05 7

9.6. Segunda incubación Agregar 100 µl de conjugado SeroA LD o SeroG HD en los pocillos correspondientes (incluido A1). A continuación, la placa se incuba en una incubadora durante 30 minutos a 37 C (véase el punto 9.4.). 9.7. Lavado Lavar 4 veces de acuerdo con el punto 9.5. 9.8. Tercera incubación Agregar 100 µl de sustrato SeroSC en todos los pocillos. A continuación, la placa se incuba en una incubadora durante 30 minutos a 37 C. Seguidamente se detiene la reacción agregando 100 µl de solución de parada SeroStop en todos los pocillos. Tras una mezcla cuidadosa (ligero golpeteo en el borde de la placa), la extinción se mide en un fotómetro de placas a 450 nm (longitud de onda de referencia blanco del reactivo (posición A1). 620 nm). El ajuste del valor cero se realiza frente al valor Atención: Para la eliminación de agua condensada, la parte inferior de la placa de microtitulación tiene que limpiarse antes de la medición. 10. Control de calidad y señales de caducidad de los reactivos Para el control de calidad, en cada realización del ensayo ha de efectuarse un control estándar (determinación doble) y un control negativo. El ensayo ha transcurrido correctamente si el valor medio de extinción del control estándar a 450/620 nm se encuentra en el rango de los valores indicados en la hoja de datos adjunta. Si las dos mediciones individuales difieren en más de un 20% del valor medio, el ensayo tiene que repetirse. El control negativo tiene que presentar un valor de extinción < 0,3 a 450/620 nm. Los controles A y B de RIDASCREEN Sero ELISA son muestras de control adicionales para garantizar la calidad, los cuales pueden utilizarse opcionalmente. Los rangos perseguidos se reflejan en el certificado de calidad específico de lote adjunto. Los valores obtenidos (U/ml, IU/ml o miu/ml) le sirven al usuario como valores orientativos para la garantía de calidad interna del laboratorio. La diferencia frente a los valores exigidos y la turbidez del reactivo o la coloración azul del sustrato antes de la adición en las cavidades puede ser un indicio de caducidad del reactivo. Si los valores preestablecidos no se cumplieran, antes de repetir el ensayo debería verificarse lo siguiente: Durabilidad de los reactivos utilizados RIDASCREEN Helicobacter 11-05-05 8

Funcionalidad de los aparatos utilizados (p. ej. calibración) Realización correcta del ensayo Control visual de los componentes del kit en cuanto a contaminación o fugas; si la solución del sustrato tiene un color azulado, la misma no debe utilizarse Una vez repetido el ensayo, si las condiciones vuelven a incumplirse, póngase en contacto con el fabricante. 11. Evaluación e interpretación La evaluación del ensayo puede realizarse de tres formas distintas: 1. con la curva estándar adjunta 2. con la tabla de valores (véase la hoja de datos adjunta) 3. matemáticamente, según el método de 4 parámetros o el método Antes de la evaluación, el valor blanco del reactivo tiene que restarse de todos los valores de extinción. 11.1. Evaluación con la curva estándar Para realizar una evaluación mediante la curva estándar, primero tiene que efectuarse una corrección de la fluctuación diaria a través del valor medio del control estándar. El factor de corrección F se calcula con el valor teórico del control estándar y el valor medido actual del control. El valor teórico dependiente del lote se indica en la hoja de datos adjunta. F = Valor nominal del Estándar de control Valor promedio de la Absorbancia del Estándar de control Todos los valores OD de las muestras se multiplican con el factor F. Después, el valor U/ml correspondiente se lee en la curva estándar con esos valores corregidos. RIDASCREEN Helicobacter 11-05-05 9

11.2. Evaluación con la tabla de valores U/ml Rango de valores del control estándar 0,89-0,94 - < 10,0 < 0,17? 10,0-16,0 0,17-0,26 16,1-30,0 0,27-0,47 30,1-60,0 0,48-0,80 + 60,1-110,0 0,81-1,27 110,1-210,0 1,28-1,84 210,1-400,0 1,85-2,39 > 400,0 > 2,39 Fig. 1: Ejemplo para una determinación IgG (extracto de una hoja de datos específica de lote) El valor medio de extinción del control estándar determina - en la tabla de valores - la columna con el rango de valores que es válido para la medición actual. En la columna, el valor de extinción medido de la muestra se asigna al rango de extinción adecuado, y en la segunda columna de la izquierda se lee el título correspondiente en U/ml. En una medición, el valor medio de extinción del control estándar asciende por ejemplo a 0,91. En este caso, para la determinación del resultado es decisiva la columna de la tabla con el rango de 0,89 a 0,94. Una muestra de pacientes con un valor de extinción de 0,61 tiene entonces un rango de título de 30,1 a 60,0 unidades/ml (los valores mencionados se muestran como ejemplo y pueden diferir de los valores actuales de la hoja de datos). La evaluación del resultado determinado - positivo (+), negativo (-) o valor límite (?) - se refleja en la primera columna de la tabla de valores. 11.3. Evaluación matemática En la hoja de datos adjunta se reflejan los valores necesarios para una evaluación matemática según la evaluación de 4 parámetros o el método. RIDASCREEN Helicobacter 11-05-05 10

11.4. Resultado del ensayo Tab. 3: Evaluación de las unidades determinadas IgA (IgG) Negativo < 10 U/ml < 10 U/ml Valor límite 10-13 U/ml 10-16 U/ml Positivo > 13 U/ml > 16 U/ml 12. Límites del método Los ensayos RIDASCREEN Helicobacter EIA acreditan anticuerpos IgA e IgG contra H. pylori. No es posible derivar ninguna relación entre el valor de extinción medido y la aparición o la gravedad de síntomas clínicos. Los resultados obtenidos han de interpretarse siempre en combinación con el cuadro clínico. Un resultado negativo en el EIA no puede excluir una infección con Helicobacter pylori. Si existe sospecha clínica de una infección con Helicobacter pylori y resultados serológicos negativos, al cabo de cuatro semanas debería realizarse una toma de muestras y un ensayo adicional. Un resultado con valor límite podría señalar el comienzo de una respuesta inmunológica. Existen anticuerpos contra Helicobacter pylori. Una conversión serológica progresiva, que apunta a un curso agudo de la enfermedad, ha de clarificarse con un autoensayo repetido al cabo de dos a cuatro semanas. No obstante, también puede observarse un resultado dudoso después de realizarse la terapia y superarse la infección. Generalmente, en estudios serológicos realizados para mejorar el resultado del diagnóstico, deberían examinarse siempre dos muestras sucesivas de suero de un paciente. Para la interpretación de un resultado es importante el curso del título. Un resultado positivo en el EIA no significa necesariamente que exista un curso activo de la enfermedad. Es posible determinar la existencia de anticuerpos incluso con una colonización de curso subclínico con Helicobacter pylori. Se recomienda la realización del ensayo RIDA BLOT Helicobacter para confirmar los resultados del EIA e identificar cepas de Helicobacter pylori altamente virulentas mediante la determinación de anticuerpos contra los factores patógenos CagA y VacA. En este momento existen pocos estudios sobre la importancia de los anticuerpos IgA en caso de infección con Helicobacter pylori. Si los resultados IgG no son claros, se recomienda la realización de este estudio. RIDASCREEN Helicobacter 11-05-05 11

Un resultado positivo no excluye la presencia de otros agentes infecciosos como causa de una enfermedad. 13. Características Tab. 4: Varianza interensayo (n=5) Varianza interensayo IgA IgG OD VK OD VK Suero 1 0,189 8,72 % 0,178 9,9 % Suero 2 0,388 8,47 % 0,736 6,2 % Suero 3 0,872 8,3 % 1,284 4,4 % Tab. 5: Varianza interensayo (n=24) Varianza interensayo IgA IgG OD VK OD VK Suero 1 0,169 9,4 % 0,119 3,3 % Suero 2 0,350 9,1 % 0,536 4,8 % Suero 3 0,832 7,7 % 1,164 3,0 % Tab. 6: Sensibilidad y especificidad en comparación con otros dos ELISA comerciales IgA IgG Sensibilidad 100,0 % 97,7 % Especificidad 100,0 % 100,0 % RIDASCREEN Helicobacter 11-05-05 12

Tab. 7: Resultados obtenidos con 212 sueros de donantes de sangre examinados en un centro de donación de sangre de Alemania 200 sueros de donantes de sangre IgA IgG Negativo 74,5 % 64,1 % Valor límite 5,5 % 5,2 % Positivo 20,0 % 30,7 % RIDASCREEN Helicobacter 11-05-05 13

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