Centro Nacional de Alimentación Detección n de Alérgenos en Alimentos. Actuaciones del Centro Nacional de Alimentación Mª Isabel Prieto Santos Servicio de Biotecnología
ALÉRGENOS ALIMENTARIOS Los alérgenos alimentarios son proteínas o glicoproteínas presentes de forma natural en los alimentos, tanto de origen vegetal como animal
PROTEÍNAS ALERGÉNICAS Alimento Cacahuete 29% Leche Proteínas Totales 20% (proteínas del suero) Huevo 11 13% Trigo (Gluten) CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN Proteína Alergénica Ara h1 Ara h2 Otras (arah3 a arah8) β lactoglobulinas α lactoglobulinas 63 64 kd 17 kd 18 kd 13 14 kd 80% caseína α, β,κ,γ caseínas 19 33kD Ovomucoide (Gal d 1) Ovoalbumina (Gal d 2) Ovotransferrina (Gal d 3) Lisozima 10 15 % α, β,γω Gliadinas y Gluteninas Nuez Ber e 1 Glicinina Soja 70% β Conglicinina Inhibidor de la tripsina Mostaza Sin a 1 Bra j 1 Crustáceos Tropomiosina (Pen a1, Met e 1, Sa I y Sa II) 9 3 kd 13 14 kd 22 25 kd 15 kd 16 kd 36 kd Pescado Parvalbúmina (Gad c1 o alergeno M) 12 kd PM
ANÁLISIS DE ALÉRGENOS EN ALIMENTOS A) Métodos M Inmunológicos Detección de las proteínas alergénicas mediante anticuerpos específicos B) Métodos M basados en Biología a Molecular Detección de secuencias diana de ADN mediante PCR C) Métodos M cromatográficos Utilizados en investigación
A) MÉTODOS M INMUNOLÓGICOS Métodos basados en la detección de una o más proteínas o fragmentos proteicos (alérgeno), mediante la unión especifica antígeno anticuerpo a) Enzimoinmunoensayo ELISA ELISA sandwich ELISA competitivo ELISA directo b) Métodos rápidos (tiras inmunocromatográficas)
SISTEMAS DE FLUJO LATERAL (LFD) o TIRAS REACTIVAS Sistemas cualitativos (puede ser utilizados como semicuantitativos con precaución) Utilidad para muestreo ambiental, verificación zonas de limpieza, screening Disponibles para muchos alérgenos Rápidos Sencillos Sensibilidad declarada (5 mg/kg (ppm))
Método ELISA Sandwich : Etapas Extracto de la muestra Anticuerpo conjugado Incubación Sustrato lavado Frenado
SISTEMAS ELISA Métodos directos : DETECTAN LAS PROTEÍNAS ALERGÉNICAS Cuantitativos AgraQuant Rápidos No requiere equipos demasiado complejos (lector de placas) TEPNEL BIOKITS ALTA SENSIBILIDAD: La mayoría de los ELISA declaran una sensibilidad suficiente para detectar concentraciones relativamente pequeñas de alérgenos (adecuados para proteger al consumidor) (Límite de detección : entre 0,5 mg/kg (ppm) a 5mg/kg (ppm))
Limitaciones analíticas en el control de alérgenos: A) Extracción n de proteínas alergénicas B) Diferencias en los distintos sistemas ELISA C) No disponibilidad de MR certificados
A) Dificultad de la extracción n de proteínas alergénicas en los alimentos La facilidad y/o dificultad de la extracción depende: a) a) Influencia del procesado en en las las propiedades de de las las proteínas alergénicas b) b) Complejidad de de la la matriz que contiene el el alérgeno Polifenoles y taninos Grasas ph ph c) c) Distribución en en el el alimento
RETO Desarrollo de adecuados procedimientos de extracción Kits comerciales suministran sus propios tampones de extracción Procesos rápidos y fáciles de realizar Composición desconocida (PBS, Tris/ClNa,...) Similares para todos los alérgenos Necesidad de aditivos especiales: gelatina de pescado leche en polvo sustancias reductoras ( β-mercaptoetanol) urea 6 mol/litro agentes surfactantes (1% Tween 20 0,4% Triton X-100, 4% SDS)
ESTUDIOS SOBRE EL EFECTO MATRIZ ( CNA) Efecto de la matriz en alimentos ricos en taninos y polifenoles Cacao, chocolate y derivados Café y Té Frutas ricas en taninos: Uvas, platano, manzana, pera Frutos secos con piel: castaña..
Efecto de matriz rica en taninos (muestras con alto contenido en chocolate) en la detección n de gluten en alimentos. OBJETIVO: Mejorar el rendimiento de la extracción Datos : Procedentes de los Estudios de Validación n del procedimiento de Determinación n de gluten en alimentos realizados en el CNA mg/kg de Gluten Valor esperado 20 mg/kg de gluten Muestra extraída con solución cocktail Recuperación n < 80% Muestra extraída con solución cocktail con leche desnatada Recuperación n > 80%
La influencia de los polifenoles en la detección n de gluten en alimentos infantiles hidrolizados a base de fruta. Efectos de la matriz en la extracci ción n de las proteínas del gluten OBJETIVO: Comprobar el efecto inhibidor de los polifenoles presentes en alimentos con alto contenido en fruta en la extracción n de gluten. PROCEDIMIENTO: Comprobación n del Rendimiento de extracción n de diferentes tipos de soluciones en alimentos infantiles ricos en fruta (papillas infantiles ntiles de frutas): 1. Solución Cocktail con Etanol al 80% 2. Solución n de Guanidina / β mercaptoetanol / Isopropanol 3. Solución n 1 con Gelatina de pescado 4. Solución n 1 con leche desnatada
RESULTADOS: CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN Muestras adicionadas con 40 mg/kg de Gluten 1. Solución Cocktail con Etanol al 80% 2. Solución n de Guanidina / β mercaptoetanol / Isopropanol 3. Solución n 1 con Gelatina de pescado 4. Solución n 1 con leche desnatada
B) Diferencia de resultados entre distintos sistemas ELISA Detectan diferentes proteínas (Diferente sistemas antígeno anticuerpo) Utilizan diferentes calibrantes Diferentes unidades de expresión de resultados ESTUDIOS SOBRE EL COMPORTAMIENTO DE LOS DISTINTOS SISTEMAS
ESPECIFICACIONES DE LOS KITS DE DETECCIÓN N DE PROTEÍNAS DE HUEVO SISTEMA ELISA A ESPECIFICIDAD Anticuerpo policlonal Ovomucoide (Gald1) B C Anticuerpos Ovomucoide (Gald1) DIFERENTES PROTEINAS UNIDADES DE MEDIDA Proteína blanca de huevo (EWP) Huevo entero en polvo Huevo entero en polvo CALIBRANTE NIST SRM8445 (Huevo seco entero en polvo) Proteína total de huevo RANGO DE CUANTIFICACION mg/kg (ppm) DIFERENTES UNIDADES DE MEDIDA DIFERENTE CALIBRANTE DIFERENTE LC LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN LC mg/kg (ppm) 0,5 10 0,5 2,5 25 2,5 1 10 1 D Ovoalbúmina y ovomucoide (Gald 1 y Gald 2) Huevo entero en polvo NIST SRM8445 (Huevo seco entero en polvo) 0,5 13,5 0,5
Estudio Comparativo kits ELISA determinación n de proteínas de huevo Resultados con muestras de valor conocido Preparación de muestras cargadas con NIST SRM 8445 ( Huevo entero en Polvo, Valor de referencia 48% ± 1% Proteína total de Huevo) MUESTRAS Valor Esperado 1 2 3 4 mg/kg (ppm) proteína blanca de huevo mg/kg (ppm) Huevo entero en polvo mg/kg (ppm) Huevo entero en polvo mg/kg (ppm) Huevo entero en polvo Galleta Pasta Bollo Helado Vino 3 mg/kg huevo entero en polvo 1,1 5,6 3,15 4 6 mg/kg huevo entero en polvo 2,6 8,2 5,58 8 3 mg/kg huevo entero en polvo 1,21 6,8 3,05 3 1,5 mg/kg huevo entero en polvo 0,53 3,4 1,72 1,6 1,5 mg/kg huevo entero en polvo 1, 35 2,4 1,7 1,6
Valor esperado en mg/kg de huevo entero en polvo 1 2 Resultado expresado en 3 mg/kg de huevo entero en polvo 4
Estudio Comparativo kits ELISA determinación n de Avellana Sistema ELISA Expresión n de resultado Limite de cuantificación 1 Proteína de avellana 0,5 mg/kg 2 Avellana 1 mg/kg 3 Avellana 2,5 mg/kg 4 Avellana 2,5 mg/kg
RESULTADOS INICIALES CON UN ÚNICO KIT DUDOSAS NEGATIVAS POSITIVAS ETIQUETADO Puede contener trazas de avellana. Rastros de avellana. Trazas de frutos secos.. Frutos de cascara. No Figura Avellana entre sus ingredientes No contiene Frutos secos Contiene avellanas Con un x% de avellana Pasta de avellana PRESENCIA DE AVELLANA Nº de Muestras DETECTADO NO DETECTADO 10 6 4 10 2 8 10 9 1
DISTINTOS SISTEMAS ELISA 1 2 3 4 LC 0,5 mg/kg (ppm) de Proteína de avellana LC 1 mg/kg (ppm) de Avellana LC 2,5 mg/kg (ppm) de Avellana LC 2,5 mg/kg (ppm) de Avellana MUESTRAS POSITIVAS /NO ETIQUETADAS No figura avellana entre Galleta con chocolate sus ingredientes > 5 mg/kg 35 mg/kg 15,5 mg/kg > 20 mg/kg Galleta multivitaminada No figura avellana entre sus ingredientes 0,7 mg/kg 2,9 mg/kg 4,9 mg/kg 8,3 mg/kg MUESTRAS POSITIVAS / ETIQUETADAS Pastel Avellana 2% NO DETECTADO NO DETECTADO 3,6 mg/kg NO DETECTADO MUESTRAS ETIQUETADO DUDOSO Chocolate Rastros de avellana NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO Barquillo Puede contener trazas de nueces, almendras y soja NO DETECTADO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO Turrón Trazas de frutos secos NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO Chocolate Rastros de cacahuete,avellana y almendra NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO
C) No Disponibilidad de Materiales de Referencia Recuperación n con muestras fortificadas con 5 mg/kg de avellana Preparación n de muestras fortificadas, mediante mezcla de variedades de avellana
B) MÉTODOS M BIOLOGÍA A MOLECULAR Reacción n de la Polimerasa en Cadena PCR Detección mediante PCR de secuencias de ADN : especificas del alimento alergénico secuencias de ADN que codifican la proteína alergénica Desarrollo de kits comerciales (Límite de sensibilidad declarado menos de 2,5 ppm de alimento alergénico )
VENTAJAS Gran sensibilidad Gran especificidad Fácil de usar Mayor estabilidad Cumple con el Reglamento (UE) 1169/2011 Útil si no existe ELISA Verificar resultados cuestionables (ej: proteínas hidrolizadas) Bueno como método confirmativo INCONVENIENTES No detectan la proteína alergénica No relación n constante entre presencia de ADN y Proteína Cualitativo o semicuantitativo ( no se puede comparar unidades de medida)
CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACION Alcance actual de acreditación del CNA bajo la Norma UNE EN ISO 17025, en el campo de alérgenos Gluten, en 2009 Cacahuete, en 2010 Proteínas lácteas, en 2010 β lactoglobulina Caseína Proteínas de huevo, en 2012 Ampliación de alcance de Acreditación ( Próxima auditoria de ENAC, 2013) Detección de avellana
Centro Nacional de Alimentación Muchas Gracias Directora del CNA Mª Teresa López L Esteban mlopeze@msssi.es Servicio de Biotecnología Mª Isabel Prieto Santos mprietos@msssi.es