K.W.: esporal irrigation, artificial inoculation, mycorrhizal.

EVALUACIÓN DE LA MICORRIZACIÓN MEDIANTE RIEGO ESPORAL EN PLANTA DE DOS SAVIAS DE Quercus faginea, Q. ilex, Q. pyrenaica, Q. suber y Castanea sativa CON DIFERENTES HONGOS MICORRÍCICOS I. ESCUDERO; H. DÍAZ; C. MARTÍNEZ; J. MISIEGO; R. GUERRAS; V. FERNÁNDEZ; V. PANDO; R. SIERRA; P. MARTÍNEZ-ZURIMENDI Departamento de Producción Vegetal y Silvopascicultura E.T.S. de Ingenierías Agrarias. Universidad de Valladolid Avda. de Madrid, nº 44. 34004 PALENCIA Telf. 979 10 84 25 FAX: 979 10 84 40 e-mail de contacto: mzurimen@pvs.uva.es RESUMEN: Se presentan los resultados de la inoculación micorrícica realizada en varias especies de frondosas de interés forestal de dos savias mediante riego esporal con diferentes especies de hongos micorrícicos de las mismas. Las especies inoculadas han sido Quercus faginea, Quercus ilex, Quercus pyrenaica, Quercus suber y Castanea sativa. La evaluación de la micorrización en diferentes momentos del desarrollo de la planta ha dado resultados positivos: el porcentaje de raíces micorrizadas es pequeño en todos los tratamientos pero sensiblemente superior a los testigos no inoculados. Asimismo, se han apreciado en ocasiones crecimientos significativamente mayores en las dimensiones de las plantas frente a testigos sin inocular, fruto de las inoculaciones realizadas. P.C.: riego esporal, inoculación, micorrización. SUMMARY: The results of the artificial inoculation through esporal irrigation at several species of broadleaves two years age are described. Quercus faginea, Quercus ilex, Quercus pyrenaica, Quercus suber and Castanea sativa has been inoculated. The control of the mycorrhizal at several stage in the breeding of the plants has been positive: the percentage of mycorrhizal apex are low in all the treatments but significantly higher that in non-inoculated plants. Also has been observed significantly differences between treatments. K.W.: esporal irrigation, artificial inoculation, mycorrhizal. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS: Ante el requerimiento de los viveristas productores de Fagáceas de desarrollar métodos sencillos de micorrización, se hace necesario elaborar una técnica que pueda ser ejecutada fácilmente, con bajo coste económico y garantía de éxito en campo, cómo es el caso de la inoculación con caldo esporal (CARRILLO & DÍAZ, 1999). Con este fin, se ensayó dicho riego esporal en algunas de las especies más solicitadas: Quercus faginea Lam., Quercus ilex L., Quercus pyrenaica Willd., Quercus suber L. y Castanea sativa Mill. A su vez, el recientemente aprobado Plan Forestal de Castilla y León plasma la intención de repoblar 500000 ha de terrenos agrarios con un ritmo anual de 20000 ha. Ésto, unido al fuerte incremento de peticiones de forestación por parte de propietarios privados, al amparo del Plan Europeo de Reforestación de Tierras Agrarias de la PAC, obliga al control y 1

cumplimiento de los mínimos de calidad exigidos por la Administración regional a instancias de la Unión Europea (OSORNO, 2002). La supervivencia de la planta a corto y medio plazo en estos terrenos agrícolas es complicada. Por todo ello, se hace necesario desarrollar esta técnica de inoculación que pueda ser ejecutada por un viverista con sencillez. El objetivo principal del ensayo buscó lograr la micorrización en planta de vivero de 2 savias. El éxito de dicha micorrización se valoró mediante un análisis directo de los ápices de las raíces y comparando los crecimientos de las plantas inoculadas con el crecimiento de las plantas testigo. Además se trató de identificar el o los tratamientos que fueran significativamente mejores que el resto. MATERIAL Y MÉTODOS: Material vegetal y fúngico: Las plantas de las distintas especies arbóreas señaladas anteriormente fueron transplantadas con una savia en diciembre de 2001, desde su bandeja original (de 350 cm 3 por contenedor)a contenedores de 3.5 l desinfectado y con turba esterilizada (HONRUBIA et al., 1995) para facilitar la infección micorrícica. Estas plantas fueron inoculadas con distintas especies de hongos que fueron recogidos en bosques naturales de cada especie arbórea, seleccionando posteriormente, de entre todos los recolectados, aquellos hongos con interés comercial, o que pudieran suponer un beneficio demostrable al crecimiento de las plantas. Las especies empleadas para cada especie arbórea fueron las siguientes: -Q. Faginea: Hebeloma edurum Metrod, Xerocomus subtomentosus (L.:) Fr. y Boletus aereus Bull.: Fr. -Q. Ilex: Amanita ovoidea (Bull.: Fr.) Quélet, Boletus impolitus Fr., Scleroderma meridionale Demoulin & Malençon y Hebeloma edurum Métrod. -Q. Pyrenaica: Amanita caesarea Scop., Boletus aereus Bull., Scleroderma polyrhizum Gmel. y Xerocomus ferrugineus Schaeff. -Q. Suber: Boletus appendiculatus Schaeff., Boletus erythropus Fr., Lactarius chrysorrheus Fr., Paxillus involutus (Batsch) Fr. y Xerocomus ferrugineus Schaeff. -C. Sativa: Boletus erythropus Fr., Xerocomus badius (Fr.: Fr.) Gilb., Paxillus involutus (Batsch) Fr., Boletus pinicola (Vitt.) Venturi y Boletus aereus Bull.: Fr. Técnica de inoculación: La técnica de inoculación elegida fue el riego esporal (HONRUBIA et al., 1992) dada su sencillez de aplicación y preparación. Una vez obtenido el caldo esporal, éste se conservó a una temperatura de 0ºC, hasta el momento de realizar los riegos esporales, que se efectuaron en tres tandas espaciadas entre si una semana (PEÑUELAS, 1996). La dosificación, se calculó a partir del conteo de esporas mediante cámara Thoma y microscopio. Esta dosis se mantuvo entre 10 5 y 10 8 esporas por planta (HONRUBIA et al., 1995). Diseño experimental y mediciones realizadas: Sobre cada especie arbórea se realizaron los siguientes tratamientos: riegos esporales individuales con las diferentes especies fúngicas seleccionadas; un testigo sobre turba estéril; 2

y un testigo sobre turba sin esterilizar. El diseño para cada especie arbórea se distribuyó en cinco columnas con dos repeticiones de cada tratamiento por columna, situadas en dos bloques diferenciados y aleatorizados con la única condición de no poder estar en contacto dos tratamientos iguales. De esta manera cada tratamiento estaba presente en 10 plantas. Se realizaron en todas las plantas cuatro mediciones de la altura y el diámetro, espaciadas un mes una de otra ( de Marzo a Junio de 2002). El porcentaje de micorrización se obtuvo mediante un recuento de ápices micorrizados en una muestra de cinco plantas para cada tratamiento, según la técnica empleada en el Centro de Investigaciones Forestales de Valonsadero (Soria) (FISCHER Y COLINAS 1996). Este recuento se llevó a cabo el mes de Julio de 2002, asimismo para las plantas de Quercus faginea Lam. se realizó un segundo análisis en el mes de Diciembre de 2002. Análisis estadístico: El tratamiento estadístico de las diferentes variables medidas se realizó con el paquete informático STATISTICA 99 EDITION. Únicamente se analizaron las plantas que estaban vivas y que no tenían rebrotes, para evitar interferencias en el estudio de los resultados. Se ha realizado un análisis de la covarianza de medidas repetidas de un factor intersujetos (tratamiento) en un diseño de bloques cruzados(2x5) y un factor intra-sujetos de medidas repetidas (mes en tres niveles) y utilizando una covariable (la altura o el diámetro inicial según la variable a analizar). El modelo matemático empleado ha sido el modelo MANCOVA para determinar la variabilidad del crecimiento en altura y diámetro para cada factor No se consideró significativa la influencia de los factores estudiados en las variables respuesta cuando el nivel de significación fue superior a 0,1. RESULTADOS Y DISCUSIÓN: Inoculación en Quercus faginea Lam.: Tras el análisis estadístico, se observó que el crecimiento en altura no se había visto influenciado significativamente por los diferentes tratamientos. En cambio, Xerocomus subtomentosus se mostró significativamente (p=0.007) como el mejor tratamiento para fomentar el crecimiento en diámetro. A su vez, aquellos tratamientos que mayores crecimientos habían producido en diámetro, se mostraron como los peores para fomentar el crecimiento en altura. El tratamiento que presentó unos mayores porcentajes de micorrización fue Boletus aereus (32% de ápices micorrizados, ver tabla 1). El resto de los tratamientos no bajó del 20 % de micorrización. Las plantas testigo en ningún caso superaron el 10 % de ápices micorrizados (DÍAZ, 2002). Tras la segunda medición del porcentaje de ápices micorrizados (diciembre de 2002), se observó que en todos los casos la micorrización había aumentado hasta lograr en todos los tratamientos porcentajes cercanos al 40 %. Asimismo, se detectó una importante infección micorrícica en las plantas testigo sin inocular, presentando unos niveles de micorrización en torno al 30 %. Esto se debe a la invasión por parte de otros hongos de los ápices que permanecían sin micorrizar tras la inoculación, prueba de ello fue la aparición de carpóforos de Laccaria lacata en algunas de las plantas tratadas con diferentes hongos. Este hecho ha podido ocultar los resultados de micorrización realmente conseguidos con los hongos inoculados, de forma que han tendido a igualarse en exceso los porcentajes obtenidos. El 3

enmascaramiento de la micorrización debida a la inoculación explica el hecho de que los valores de micorrización detectados no se hayan visto acompañados por un aumento significativo en las dimensiones de las plantas, tal y como se esperaba. (FERNÁNDEZ, 2003) Inoculación en Quercus ilex L.: El crecimiento en altura no resultó ser significativamente distinto entre los diferentes tratamientos (p=0.15), lo mismo ocurrió con el crecimiento en diámetro (p=0.77). Únicamente señalar que el crecimiento tanto en altura como en diámetro de las plantas testigo sobre turba esterilizada se mostró inferior al resto de las plantas del ensayo. En cuanto al porcentaje de micorrización detectado, se observó que las plantas inoculadas con Amanita ovoidea presentaron unos niveles de micorrización muy superiores al resto de tratamientos (62.40 % de ápices micorrizados). El resto de los tratamientos presentaron unos porcentajes de micorrización aceptables (ver tabla 1). Únicamente Scleroderma meridionale se mostró con unos porcentajes de micorrización claramente inferiores al resto de tratamientos. Lo más destacable fue el nivel de ápices micorrizados detectado en las plantas testigo con turba sin esterilizar (22.60 % de ápices micorrizados) que superó en algunos casos al nivel de micorrización de plantas inoculadas. Esto produjo que los crecimientos detectados en plantas inoculadas y no inoculadas fuese similar. En cambio, las plantas testigo con turba esterilizada presentaron unos porcentajes de micorrización prácticamente anecdóticos (2.60 %). (MISIEGO, 2002). Inoculación en Quercus pyrenaica Willd.: En el rebollo todos los testigos sin esterilizar murieron por falta de humedad del sustrato. Estas 10 plantas fueron las únicas que se dispusieron sobre sustrato sin esterilizar que retiene peor el agua. No existieron diferencias estadísticamente reveladoras en las alturas, aunque se observó, que todos los tratamientos provocaron crecimientos inferiores al testigo estéril que creció 4.8 cm. Por el contrario, sobre los crecimientos en diámetro, se experimentó la situación contraria: todos los tratamientos se mostraron significativamente superiores al testigo estéril, especialmente Xerocomus ferrugineus que llegó a ser de 4.2 mm. En cuanto a los porcentajes de micorrización se pudo constatar que todos los tratamientos provocaron una infección significativa de la planta, siempre por encima del testigo estéril (6.2 %, ver tabla 1). Destaca el resultado obtenido para Xerocomus ferrugineus, que se mostró significativamente peor que el resto de tratamientos (a excepción del testigo sobre turba esterilizada), pero que sin embargo, provocó los mayores crecimientos en diámetro. El mayor porcentaje se obtuvo para Amanita caesarea, con un 36% de ápices micorrizados. (ESCUDERO, 2002). Inoculación en Quercus suber L.: Las plantas inoculadas con Xerocomus ferrugineus generaron los mayores crecimientos tanto en altura como en diámetro, aunque en ningún caso estas diferencias fueron significativas. Los porcentajes de ápices micorrizados detectados en las plantas inoculadas fueron en todos los casos superiores a las plantas testigo. El tratamiento que presentó los mayores porcentajes de micorrización fue Paxillus involutus (39.24 % de ápices micorrizados, ver 4

tabla 1). Las plantas inoculadas con Xerocomus ferrugineus presentaron los menores porcentajes de ápices micorrizados de todos las inoculaciones realizadas (9.76 % de ápices micorrizados).(guerras, 2002) TABLA 1: Tabla resumen de los porcentajes de micorrización detectados en cada especie arbórea analizada para los diferentes tratamientos inoculados. Las letras asociadas a cada porcentaje de micorrización indican, si las letras son distintas, diferencias significativas entre las medias de cada tratamiento (para un nivel de significación p=0,1). TSE: plantas testigo con turba sin esterilizar; TE: plantas testigo con turba esterilizada Quercus faginea TRATAMIENTO % Micorr. Julio 2002 % Micorr. Dic. 2002 B. aereus 32,03 a 41,32 a H. edurum 28,13 ab 40,91 a X. subtomentosus 21,21 c 41,89 a TSE 8,26 d 30,56 b TE 4,01 d 33,3 b Quercus ilex Quercus pyrenaica TRATAMIENTO % Micorrización TRATAMIENTO % Micorrización A. ovoidea 62,4 a A. caesarea 35,69 a B. impolitus 35,4 b S. Polyrhizum 34,55 ab H. edurum 45 c B. aereus 31,89 b TSE 22,6 e X. ferrugineus 23,61 c S. meridionale 15,6 d TSE + TE 2,6 f TE 6,18 d Quercus suber Castanea sativa TRATAMIENTO % Micorrización TRATAMIENTO % Micorrización P. involutus 39,24 a B. erythropus 16 a L. chrysorrheus 20,06 b B. aereus 14,5 ab B. appendiculatus 14,88 c X. badius 11 bc B. erythropus 11,66 cd P. involutus 10,25 bcd X. ferrugineus 9,76 de B. pinicola 8,75 cdef TE 6,18 ef TSE 6,25 cdefg TSE 4,06 f TE 9,25 cde Inoculación en Castanea sativa Mill.: En el castaño el crecimiento en altura experimentó diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos. El crecimiento más destacado se obtuvo para Xerocomus badius, siendo este significativamente mejor que el testigo sin esterilizar, Boletus aereus y Boletus pinicola. Algo similar, pero menos destacable ocurrió para los diámetros, siendo de nuevo Xerocomus badius el más importante. (MARTÍNEZ, 2002). El mayor porcentaje de micorrización lo presentó Boletus erythropus, con un 16% de ápices micorrizados, seguido de Boletus aereus con 14,5%. Ambos tratamientos se mostraron 5

estadísticamente mejores que los 2 testigos. Sin embargo, ningún tratamiento consiguió un porcentaje de micorrización superior al 20 % (ver tabla 1). Discusión general: Como notas comunes a todas las especies arbóreas, se han observado una serie de tendencias en el comportamiento de ciertos géneros de hongos. Así, se observó que las plantas tratadas con especies del género Xerocomus presentaron los mayores crecimientos a pesar de detectarse en ocasiones unos porcentajes de micorrización inferiores al resto de hongos inoculados. De igual manera, las plantas inoculadas con especies del género Amanita presentaron los mayores porcentajes de ápices micorrizados, aunque esto no se vio acompañado por un incremento en las dimensiones de las plantas. Finalmente, analizando el comportamiento de las plantas inoculadas con especies del género Boletus, se observó que su comportamiento no siguió ningún patrón fijo en cuanto a su influencia en las dimensiones de la planta. Asimismo, la esterilización del sustrato de las plantas testigo ha permitido observar que, en general, la misma retrasó el desarrollo de micorrizas por otros hongos distintos de los inoculados. En la mayoría de los casos, los porcentajes de micorrización detectados en las plantas testigo sin esterilizar han sido superiores a los detectados en las plantas testigo con turba esterilizada. Esto es debido a la permanencia en el sustrato de posibles propágulos micorrícicos que acaban infectando las raíces de las plantas. CONCLUSIONES: El porcentaje de ápices micorrizados en casi todos los tratamientos es más elevado que en los dos testigos sin inocular. Esto demuestra que la técnica de inoculación ha sido un éxito, en la mayoría de los casos se han obtenidos porcentajes de micorrización más elevados que el detectado en las plantas sin inocular. Asimismo, se ha comprobado que la micorrización incide en el crecimiento en diámetro y altura de las plantas, pero de manera irregular en el tiempo, y con la especie. Por ello, se considera interesante continuar con el estudio de la posible evolución de las plantas en campo y estudiar la evolución de los crecimientos para poder sacar conclusiones más definitivas. A pesar de todo ello, se observa como tendencia general que las plantas inoculadas con especies del género Xerocomus presentan los mayores crecimientos en todos los casos en los que fueron inoculados, a pesar de que en ocasiones el porcentaje de micorrización detectado no fuese muy elevado. Asimismo, las especies del género Amanita se han mostrado como especies micorrícicas adecuadas para la inoculación dado el elevado porcentaje de micorrización detectado en todos los casos en los que aparecieron. En otros géneros de hongos no se han podido establecer conclusiones tan claras sobre la posible evolución de las plantas inoculadas con estos hongos. Por ello, se recomienda realizar un seguimiento más a largo plazo de las mismas para poder analizar más detalladamente esta posible evolución y poder sacar conclusiones más claras. Finalmente, se ha comprobado que la contaminación producida por hongos distintos a los micorrizados ha sido en algunos casos importante, por lo que se recomienda la esterilización de la turba a emplear en la inoculación cuando se desee reducir esa micorrización adventicia. 6

AGRADECIMIENTOS La colaboración de Viveros Fuenteamarga que suministró los materiales para el ensayo y de Juan Andrés Oria de Rueda que comprobó las identificaciones y seleccionó los hongos más interesantes fueron esenciales para la realización del trabajo. BIBLIOGRAFÍA: CARRILLO, C.; DÍAZ, G.; (1999). Aislamiento, cultivo y producción de inóculo de hongos ectomicorricicos. II Curso avanzado de viveros y producción de planta forestal autóctona para colonización de ecosistemas mediterráneos. DÍAZ, H.; (2002). Influencia de la inoculación esporal en la calidad de planta de Quercus faginea Lam. producida en vivero. Trabajo fin de carrera. E.T.S.II.AA. Palencia (sin publicar). ESCUDERO, I.; (2002). Influencia de la inoculación esporal en la calidad de planta de Quercus pyrenaica Willd. producida en vivero. Trabajo fin de carrera. E.T.S.II.AA. Palencia (sin publicar). FERNÁNDEZ, V.; (2003). Evaluación de la micorrización e influencia de la inoculación esporal en la calidad de plantas de una y de dos savias de Quercus faginea Lam. y Quercus robur L. producidas en vivero. Trabajo fin de carrera. E.T.S.II.AA. Palencia (sin publicar). FISCHER, C. y COLINAS, C. 1996. Methodology for certification of Quercus ilex seedlings inoculated with Tuber melanosporum for commercial application. In Proceedings of the 1 st International Conference in Mycorrhizae. Berkeley.California. EEUU. GUERRAS, R.; (2002). Influencia de la inoculación esporal en la calidad de la planta de Quercus suber L. producida en vivero. Trabajo fin de carrera. E.T.S.II.AA. Palencia (sin publicar). HONRUBIA, M.; TORRES, P.; DÍAZ, G.; CANO, A.; (1992). Manual para micorrizar plantas en viveros forestales. LUCDEME VIII. ICONA. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación. Monografías 54. Madrid. 45 pp. HONRUBIA, M.; TORRES, P.; DIAZ, G.; MORTE, A.; (1995). Biotecnología forestal: Técnicas de micorrización y micropropagación de plantas. Universidad de Murcia. Servicio de publicaciones. MARTÍNEZ, C.; (2002). Influencia de la inoculación esporal en la calidad de planta de Castanea sativa Miller producida en vivero. Trabajo fin de carrera. E.T.S.II.AA. Palencia (sin publicar). MISIEGO, J.; (2002). Influencia de la inoculación esporal en la calidad de la planta de Quercus ilex subsp. ballota producida en vivero. Trabajo fin de carrera. E.T.S.II.AA. Palencia (sin publicar). OSORNO, O.; (2002). Estudio de la micoflora asociada a Pinus nigra Arnold sbsp. Salzmannii (Dunal) Franco, Pinus sylvestris L., Quercus ilex L. y Quercus pyrenaica Willd. en el vivero forestal Natura S.L. de León. Trabajo fin de carrera. E.T.S.II.AA. Palencia. PEÑUELAS, J.; OCAÑA, L. (1996). Cultivo de plantas forestales en contenedor. Mundi Prensa. Madrid 7