Proyecto FONDEF DOOI 1101 BIOMEJORAMIENTO DE LOS SUSTRATOS RADICULARES INSTITUTO DE BIOLOGÍA - PUCV LABORATORIOS DE NEMATOLOGÍA Y BACTERIOLOGÍA
HIPOTESIS DE LA LINEA Los nemátodos bacterívoros pueden ser cultivados masivamente in vitro e incorporados al sustrato para potenciar la calidad del suelo. Se plantea que los nematodos son reservorios nativos, resistentes y autorrenovables que dispersan poblaciones microbianas naturales de importancia en los ciclos biogeoquímicos. Atracción Ingestión TMP2/3 Reproducción Nemátodo Dispersión Aumento del NH 4+ en el suelo
SELECCIÓN DEL ÁREA DE ESTUDIO RECUPERACIÓN DE NEMATODOS
MUESTREO NEMATOLOGICO Area de Estudio Sector Experimental Muestra Nemátodos Relleno Sanitario Loma Los Colorados Parcela A Parcela B Parcela C arbusto maleza arbusto maleza arbusto maleza + + + + + +++ Tranque de Relave Planta Matta Tranque 1 (Sector Lamas) Sector Aledaño (Pie de talud) Prosopis chilensis Punica granatus Acacia saligna Acacia cavens Atriplex sp. +++ ++ ++ ++ + Tranque 2 arbusto - Tranque 3 arbusto - Tranque Ojancos Sector Lamas Shinus molle Acacia saligna Acacia sp. - + + DESARROLLO IN VITRO DE NEMATOFAUNA NATIVA COLONIZADORA EN BASE A POBLACIONES BACTERIANAS NATURALES ASOCIADAS
OBJETIVO GENERAL Seleccionar y reproducir in vitro nemátodos bacterívoros colonizadores usando bacterias naturales asociadas como fuente de alimento. Hembra con huevos en el centro de una colonia bacteriana Huella del desplazamiento de nemátodos en placa Reproducción de nemátodos en una colonia bacteriana
FAMILIA RHABDITIDAE Extremo anterior del cuerpo de un rabdítido Extremo posterior del cuerpo de un rabdítido FAMILIA CEPHALOBIDAE Extremo anterior del cuerpo de un cefalóbido Extremo posterior del cuerpo de un cefalóbido Ejemplar de la familia Cephalobidae
CULTIVOS MONOXÉNICOS Cultivo puro de un nemátodo colonizador y su bacteria asociada Cultivo puro de un nemátodo colonizador y su bacteria asociada BACTERIAS NATURALES ASOCIADAS Bacilos Gram negativo Móviles Oxidasa positivo Metabolismo de la glucosa oxidativo Aislamiento de una bacteria natural asociada
ESTUDIO DE RELACIONES TRÓFICO-DISPERSIVAS ENTRE BACTERIAS Y NEMÁTODOS. OBJETIVO GENERAL Desarrollar un modelo in vitro para el estudio de la atracción, ingestión y dispersión de bacterias dieta por parte de nematodos.
POTENCIAL DE ATRACCION Sembrar en sector t3 la bacteria crecida en agua peptonada e incubar 24 hrs a 25ºC. Contabilizar número de nemátodos inoculados mm= ((1*t1+2*t2+3*t3) (1*c1+2*c2+3*c3)/T)*10 Distancia (mm) recorrida por C. elagans. 26 23 20 17 14 11 8 5 2-1 -4 KMP-3 EC OP50 KMP-4/2 KMP-1 TMP-2/3 KMP-5 TMP-2/1 TMV-3 KMP-8 SL-1344 TMP-1/2 0 20 40 60 80 100 120 140 Minutos
CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS SEGÚN NIVEL DE ATRACCIÓN Nivel de atracción Hiper atractante Atractante media E.coli Bacterias TMP2/1; TMP2/3 OP50; SL-1344;KMP-3 Atractante baja KMP-5; KMP-8; KMP4/2; KMP-1; TMV-3. ACTIVIDAD EN TORNO A LA BACTERIA Agar NG
AREA DE ACTIVIDAD Area cm2 20.00 15.00 10.00 5.00 0.00 TMP2/3 KMP4/2 KMP-1 OP50 Cepas Bacterianas 1 2 3 4 Para determinar que efectivamente el nemátodo se encontraba libre de bacterias en su cutícula se lavó nemátodos alimentados con E.coli MT102, de la misma forma que nemátodos alimentados con TMP2/3 1 2 Los resultados demuestran que la bacteria se encuentra solamente en el interior del intestino del nematodo.
Se recuperó la bacteria TMP2/3 en placas de agar NG. También crecieron en placas de agar L con antibíoticos. 1 Esto sugiere que el lavado externo fue exitoso y efectivamente el nemátodo dispersa la bacteria por sus excretas. 2 3 Evaluación de la asociación bacteria nemátodo, en el aumento de NH + 4 en la zona radicular y en el aumento del peso total de las plantas de Lycopersicon esculentum. Planta: Lycopersicum esculentum. Fotoperiódo: 15 h día- 9 h noche. Tº: 20-25ºC. Suelo: Franco arcilloso, estéril. Humedad: 35% p/v. Nemátodos: Cephalobidae /Rhabditidae. Tiempo de ensayo: 35 días. Réplicas: 35 por tratamiento. Semilla estéril pre-germinada. Nemátodos nativos (10 nem/gr). Inóculo bacteriano (1*10 7 UFC/gr).
Niveles de NH + 4 con distintos tratamientos ppm de NH4/ gr de suelo 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 Control TMP2/3 TMP 2/3+Rhabditidae TMP2/3 + Cephalobidae Cephalobidae Rhabditidae Tratamientos DESARROLLO DE CULTIVOS LÍQUIDOS DE ASOCIACIONES NEMÁTODO - BACTERIA (NemaBac)
LOS NEMATODOS CULTIVADOS Rhabditidae Cephalobidae 10X 20X Cultivo liquido nematodos y huevos Nematodos/ml 10000 8000 6000 4000 2000 0 0 10 20 30 40 Dias Rhabditidae Cephalobidae Porcentaje de eclosión del inóculo Rhabditidae : 55% Cephalobidae : 29%
Determinación de la concentración del inóculo de nemátodos. - Inóculo 103 nematodos/ml, es duplicada en 7 días. - Inóculo 2x103 nematodos/ml, se triplica en 7 días. ENSAYOS DE CAMPO
INÓCULO Nemátodos : Rhabditidae y Cephalobidae (3:1) Bacteria : TMP2/3 PLANTAS INOCULADAS Tranque de relave: - Algarrobo - Aromo azul. PREPARACIÓN PARA LA INOCULACIÓN NEMATODO - BACTERIA
INOCULACIÓN DE LA ASOCIACIÓN NEMÁTODO BACTERIA EN LA ZONA RADICULAR DE PLANTAS. MEDICIÓN DE AMONIO
NIVELES DE AMONIO EN LA RIZÓSFERA DE AROMO Y ALGARROBO EN EL TRANQUE 1 PLANTA MATTA. ppm Nh4-N/ g suelo 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 Algarrobo tratamiento Algarrobo control Aromo tratamiento Aromo control 0.1 0
Atracción Ingestión Reproducción Dispersión AUMENTA EL NH 4 EN EL SUELO NemaBac : Proyecciones Potenciación radicular Estimulación de ciclos Protección Estabilización de suelos Inoculantes