AdnaTest BreastCancerSelect Enriquecimiento de células tumorales provenientes de sangre de pacientes con cáncer de mama para el análisis de la expresión génica Para uso de diagnóstico in vitro Manual T-1-508
Contenido Información para pedidos... 3 Finalidad prevista... 3 Abreviaciones y símbolos... 4 Patentes y marcas registradas... 4 Descripción del producto... 5 Componentes del kit... 6 Materiales adicionales necesarios... 7 Almacenamiento... 8 Información para la aplicación... 8 Advertencias y precauciones para el diagnóstico in vitro... 10 Protocolo... 11 A. Preparación de las microesferas BreastSelect... 11 B. Selección de células tumorales... 12 Características de rendimiento... 14 Guía breve... 15 2
Información para pedidos La información para realizar pedidos está disponible en www.qiagen.com y www.adnagen.com. Asimismo, puede ponerse en contacto con el equipo de asistencia de QIAGEN Hannover para resolver cualquier duda relacionada con las pruebas AdnaTest (support@adnagen.com). Finalidad prevista La prueba se ha desarrollado para el enriquecimiento de células tumorales circulantes en sangre periférica de pacientes con cáncer de mama y está diseñada para el uso de diagnóstico in vitro. Se recomienda utilizar la prueba AdnaTest BreastCancerDetect para el análisis posterior de la expresión génica asociada al cáncer de mama. 3
Abreviaciones y símbolos AdnaMag-L AdnaMag-S pb ADNc ADN ARMm PCR RNasa rpm RT Concentrador de partículas magnéticas (grande) Concentrador de partículas magnéticas (pequeño) Pares de bases Ácido desoxirribonucleico complementario Ácido desoxirribonucleico Ácido ribonucleico mensajero Reacción en cadena de la polimerasa Ribonucleasa Revoluciones por minuto Transcripción inversa Fecha de caducidad Límite de temperatura Número de referencia Consultar las instrucciones de uso Fabricante Dispositivo médico para diagnóstico in vitro Patentes y marcas registradas Dynabeads es una marca registrada de Invitrogen and Life Technologies Corporation. 4
Descripción del producto La prueba se utiliza para el enriquecimiento inmunomagnético de las células tumorales a través de los antígenos epiteliales y asociados a tumores. Los anticuerpos contra antígenos epiteliales y asociados a tumores se conjugan con las microesferas magnéticas (Dynabeads ) para la marcación de las células tumorales en sangre periférica. Las células marcadas se extraen mediante un concentrador de partículas magnéticas (AdnaMag-L y AdnaMag-S) para su posterior lisado (ilustración 1). El lisado celular sirve para la realización de otros análisis (se recomienda continuar con la prueba AdnaTest BreastCancerDetect). Microesferas BreastSelect Incubación Separación Lisis celular ARN ARN Purificación del ARNm con microesferas magnéticas recubiertas con Oligo(dT) 25 ARN Transcripción inversa ADNc Células sanguíneas Células tumorales Microesferas magnéticas recubiertas con anticuerpos u Oligo(dT) 25 AdnaTest BreastCancerDetect Ilustración 1. Descripción esquemática de la preparación de la muestra 5
Componentes del kit La prueba incluye los siguientes componentes: Tabla 1. Componentes del kit Componente Símbolo T-1-508 (12 pruebas) BreastSelect Beads (Microesferas BreastSelect) Lysis/Binding Buffer (Tampón de lisis/unión) 1 1 2 1 6
Materiales adicionales necesarios Equipo: Rotor de tubos para tubos de 15 ml y 1,5 ml Concentradores de partículas magnéticas AdnaMag-L (QIAGEN Hannover GmbH, n.º de ref. T-1-700) AdnaMag-S (QIAGEN Hannover GmbH, n.º de ref. T-1-800) Material: Pipeteador y pipetas de vidrio o de plástico de 10 ml estériles y exentas de RNasa Tubos de reacción de 1,5 ml estériles y exentos de RNasa (p. ej., Sarstedt, n.º de ref. 72.690) Tubos de 15 ml (utilice tubos de polipropileno estériles y exentos de RNasa, p. ej., Sarstedt, n.º de ref. 65.554.502) Pipetas y puntas de pipeta exentas de RNasa con barrera para aerosoles, aptas para pipetear volúmenes de 100 µl a 1.000 µl Guantes de protección y gafas de seguridad Reactivos: Tampón fosfato salino (PBS), ph 7,0-7,3 (p. ej., Fisher, n.º de ref. VX14190169, D-PBS) 7
Almacenamiento La prueba debe almacenarse a una temperatura comprendida entre 4 y 8 C. Ninguno de los componentes debe utilizarse una vez superada la fecha de caducidad. Información para la aplicación En caso de producirse daños externos en la caja del kit o en componentes individuales, póngase en contacto con el servicio técnico de QIAGEN (para obtener la información de contacto, visite www.qiagen.com). La prueba debe realizarla personal especializado en técnicas de biología molecular. Preparación de la muestra: Las muestras de sangre se deben obtener antes de la aplicación de sustancias terapéuticas. No utilice la prueba AdnaTest antes de 7 días desde la última intervención terapéutica. Extracción de sangre: utilice únicamente tubos de recogida de sangre AdnaCollect (n.º de ref. T-1-600, QIAGEN Hannover GmbH) o tubos que contengan EDTA como anticoagulante para la extracción de sangre (p. ej., S Monovette Kalium EDTA, Sarstedt; BD Vacutainer K3EDTA, Becton Dickinson) para recoger un mínimo de 5 ml de sangre total. No utilice heparina ni citrato. 8
La sangre debe almacenarse a una temperatura comprendida entre 4 y 8 C de forma inmediata. Las muestras deben procesarse lo antes posible, pero nunca después de las 4 horas posteriores a la extracción de sangre cuando se utilicen tubos con EDTA estándares o una vez transcurridas 24 horas cuando se utilicen tubos AdnaCollect. La muestra de sangre no se debe hemolizar. Manipulación: Las microesferas BreastSelect 1 contienen azida sódica como conservante. La azida sódica es citotóxica y, por lo tanto, debe eliminarse antes de utilizar las microesferas. Todos los componentes y reactivos adicionales suministrados por otros proveedores deben almacenarse conforme a las instrucciones de los mismos. Deben cumplirse los consejos de seguridad de los respectivos fabricantes. Utilice guantes de protección para evitar la contaminación por ADN, ARN y RNasas. Alicuotee las microesferas BreastSelect para evitar la contaminación. La prueba debe realizarse en la secuencia indicada y deben cumplirse todas las especificaciones relativas a los tiempos y las temperaturas de incubación. Deseche las muestras en las que las microesferas de selección se hayan aglutinado durante el enriquecimiento. 9
Para evitar la contaminación cruzada, lleve a cabo el procesamiento de la muestra, incluida la transcripción inversa y el posterior análisis de los productos de PCR amplificados, en salas diferentes, si es posible. El uso de productos de proveedores distintos a los sugeridos puede generar resultados de calidad inferior. Advertencias y precauciones para el diagnóstico in vitro Siempre que trabaje con productos químicos, utilice una bata de laboratorio adecuada, guantes desechables y gafas protectoras. Para obtener más información, consulte las hojas de datos sobre seguridad (SDS) correspondientes. Puede obtenerlas en línea en el práctico y compacto formato PDF en www.qiagen.com/safety, desde donde también podrá buscar, ver e imprimir las hojas de datos SDS de todos los kits y componentes de los kits QIAGEN. Deseche los residuos de muestras y ensayos conforme a los requisitos de seguridad local. 10
Protocolo A. Preparación de las microesferas BreastSelect Es necesario eliminar la azida sódica mediante el lavado de las microesferas BreastSelect antes de utilizarlas: 1. Resuspenda por completo las microesferas BreastSelect 1 mediante pipeteo (no mezcle en vórtex). 2. Calcule el volumen de microesferas BreastSelect 1 necesario para procesar todas las muestras (100 µl por muestra) y transfiera el volumen calculado a un tubo de reacción de 1,5 ml. Si se procesan más de 10 muestras, utilice tubos de reacción de 1,5 ml adicionales. 3. Coloque el tubo en el concentrador AdnaMag-S. 4. Transcurrido 1 min, retire el sobrenadante con una pipeta. Importante para cada procedimiento No toque las microesferas cuando retire el sobrenadante 5. Lavado a. Retire el deslizador magnético del concentrador AdnaMag-S. b. Añada 1 ml de PBS y resuspenda las microesferas realizando varios pipeteos. c. Coloque el deslizador magnético en el concentrador AdnaMag-S. 11
d. Transcurrido 1 min, retire todo el sobrenadante con una pipeta. Repita este proceso dos veces (tres lavados en total). 6. Retire el tubo del concentrador AdnaMag-S y resuspenda las microesferas en PBS hasta alcanzar el volumen original (100 µl por muestra). B. Selección de células tumorales 1. Pipetee 5 ml de una muestra de sangre en un tubo de 15 ml. (Utilice únicamente tubos de recogida de sangre aprobados; consulte la página 8). 2. Resuspenda por completo las microesferas BreastSelect (preparadas en el paso A6) pipeteando 100 µl de las microesferas en cada muestra de sangre. 3. Introduzca los tubos en un dispositivo que permita tanto inclinación como rotación para hacerlos girar lentamente (aprox. 5 rpm) durante 30 min a temperatura ambiente. 4. Coloque los tubos en el concentrador AdnaMag-L sin deslizador magnético. Incline hacia abajo el concentrador AdnaMag-L para liberar las gotas de sangre que hayan podido quedar en el tapón. 5. Inserte el deslizador magnético e incube los tubos en el concentrador AdnaMag-L durante 3 min a temperatura ambiente. 12
6. Mientras tanto, deje que el tampón de lisis/unión 2 alcance la temperatura ambiente. Nota: compruebe que el tampón de lisis/unión no contiene precipitados. Si observa algún precipitado, deje que el tampón alcance la temperatura ambiente y mézclelo hasta que se disuelva por completo. 7. Retire todo el sobrenadante con una pipeta de 10 ml sin tocar las microesferas. 8. Lavado a. Retire el deslizador magnético del concentrador AdnaMag-L. b. Añada 5 ml de PBS, cierre los tubos y agite suavemente el concentrador AdnaMag-L hacia atrás y hacia delante 5 veces para resuspender los complejos de microesferas/células magnéticas. c. Incline dos veces el concentrador AdnaMag-L con los tubos orientados hacia abajo para liberar las gotas de sangre que hayan podido quedar en el tapón. d. Coloque el deslizador magnético en el concentrador AdnaMag-L e incube durante 1 min a temperatura ambiente. e. Retire todo el sobrenadante con una pipeta. Repita este proceso dos veces (tres lavados en total). 9. Retire el deslizador magnético del concentrador AdnaMag-L. 10. Resuspenda los complejos de microesferas magnéticas/células en 1 ml de PBS y transfiera cada muestra a un tubo de reacción de 1,5 ml. 13
11. Coloque los tubos de reacción en un concentrador AdnaMag-S en el que se haya introducido un deslizador magnético. Nota: el deslizador magnético del concentrador AdnaMag-S se puede insertar en dos posiciones. Asegúrese de insertarlo siempre con la película de plástico blanco orientada hacia delante para que los imanes estén cerca de los tubos de reacción. 12. Transcurrido 1 min, retire todo el sobrenadante con una pipeta para optimizar la siguiente lisis celular. 13. Extraiga el deslizador magnético del concentrador AdnaMag-S. 14. Añada 200 µl de tampón de lisis/unión 2 (que haya alcanzado la temperatura ambiente) a cada tubo de reacción. Resuspenda la solución pipeteando al menos cinco veces. 15. Introduzca el deslizador magnético en el concentrador AdnaMag-S e incube durante 1 min. 16. Transfiera los sobrenadantes (lisados celulares) a tubos de reacción de 1,5 ml nuevos. 17. Deseche los tubos con microesferas. 18. Continúe con el aislamiento de ARNm (AdnaTest Breast- CancerDetect) inmediatamente o almacene los lisados celulares a una temperatura máxima de 20 C durante un periodo no superior a 2 semanas. Características de rendimiento Consulte www.qiagen.com/hb-2109-d01 para conocer las características de rendimiento de la prueba. 14
Guía breve Componentes BreastSelect Beads (Microesferas BreastSelect) Lysis/Binding Buffer (Tampón de lisis/unión) 1 2 Material necesario para cada muestra 5 ml de sangre total (consulte la página 8 para obtener información detallada) 1 tubo de 15 ml 2 tubos de reacción de 1,5 ml Pipeteador y pipetas (exentas de RNasa) de vidrio o de plástico de 10 ml Pipetas de 100-1.000 µl y puntas (exentas de RNasa) Protocolo Resuspenda por completo las microesferas BreastSelect 1 y transfiera 100 µl de cada muestra de sangre a un tubo de reacción de 1,5 ml. Lave las microesferas BreastSelect con 1 ml de PBS 3 veces. Resuspenda las microesferas BreastSelect en 100 µl de PBS por muestra de sangre. Transfiera 5 ml de sangre total a un tubo de 15 ml. Añada 100 µl de microesferas BreastSelect lavadas a cada muestra de sangre. Incube durante 30 min a temperatura ambiente con inclinación y rotación a aprox. 5 rpm. 15
Coloque el tubo durante 3 min en el concentrador AdnaMag-L para separar las microesferas. Incline hacia abajo el concentrador AdnaMag-L para liberar las gotas de sangre que hayan podido quedar retenidas en el tapón. Retire el sobrenadante de la sangre. Lave las microesferas en 5 ml de PBS 3 veces. Resuspenda las microesferas en 1 ml de PBS y transfiéralas a un tubo de reacción de 1,5 ml nuevo. Separe las microesferas en el concentrador AdnaMag-S y retire el sobrenadante. Resuspenda las microesferas en 200 µl de tampón de lisis/ unión 2 pipeteando un mínimo de cinco veces. Coloque los tubos de reacción en el concentrador AdnaMag-S y transfiera el sobrenadante a un tubo de reacción nuevo. Continúe inmediatamente con la prueba AdnaTest Breast- CancerDetect o almacene a una temperatura máxima de 20 C durante un máximo de 2 semanas. 16
HB-2110-ES-001# QIAGEN GmbH QIAGEN Strasse 1 D-40724 Hilden ALEMANIA Para obtener asistencia: Número de teléfono: +49 (0) 511 72 59 50-50 Fax: +49 (0) 511 72 59 50-40 Correo electrónico: support@adnagen.com Internet: www.adnagen.com y www.qiagen.com