MARS Hu-14 de la columna en la búsqueda de nuevos biomarcadores de enfermedad Cardiovascular Sergio Alonso Orgaz Doctor en Biología Carlos Martínez aborde icenciado en Química aboratorio de Fisiopatología Vascular (Dra. M.G.Barderas Hospital Nacional de Parapléjicos)
Necesidad de nuevos biomarcadores www.who.int/
Qué es un biomarcador? El National Institutes of Health (NIH) estandarizó en 2001 la definición de biomarcador como una característica que se mide y evalúa objetivamente como indicador de procesos biológicos normales, procesos patogénicos o respuestas farmacológicas a una intervención terapéutica DNA / RNA Proteínas Metabolitos
Proteínas como biomarcadores de enfermedad Desde el punto de vista proteómico, un biomarcador es una proteína o grupo de proteínas cuya variación de expresión permita establecer un diagnóstico en una fase temprana de las enfermedades, un pronóstico acerca de su desarrollo y/o una evaluación de la respuesta a un tratamiento. Diagnóstico Seguimiento Pronóstico
Para que un biomarcador sea interesante desde un punto de vista clínico tiene que cumplir los siguientes requisitos: Coste-efectivo Métodos no invasivos Estable y fácil de cuantificar
Cualquier tipo de muestra biológica puede ser utilizada para la búsqueda de nuevos biomarcadores de enfermedad, pero las más interesantes desde un punto de vista clínico son: Suero/Plasma Orina
PASMA Obtención mínimamente invasiva Mínimo coste. Fácil toma de muestra y procesado Procesado (factores a tener en cuenta): Plasma o Suero? Modo de obtención (posición del paciente ) Material de recolección de muestra Almacenamiento (Tª y tiempo) Inhibidores de proteasas Ciclos de descongelación Fuente de biomarcadores? Reflejo de lo que ocurre en el organismo MEZCA Proteínas en muy variadas concentraciones dificultad detección biomarcadores
Composición del Plasma IgG transferrin fibrinogen IgA α-2-macroglobulin α-1-antitrypsin Complement C3 IgM haptoglobin albumin
Rango dinámico de concentraciones proteicas en Plasma mg/ml pg/ml Dynamic range is 9 to 10 magnitudes Albumin: 30-50 mg/ml Interleukin-6: 1-5 pg/ml From Anderson et al. 2002, Mol. Cell. Prot. 1, 867
MARS Human 14 97,5% - 99,9% de eliminación de 14 proteínas mayoritarias Ac específico Proteína retenida
H H H H H 20 μl plasma Diluído 1:3 tampón A Columna MARS Hu-14 HPC Proteínas minoritarias Tampón A Proteínas mayoritarias Tampón B H H H H H H H H H H H Potenciales biomarcadores Proteínas a estudiar Proteínas minoritarias Fracción no retenida Proteínas mayoritarias Fracción retenida H H H H H H H H H H H 94% de proteínas plasmáticas
Suero 1-Marcador de peso molecular 2-Suero completo 3-Fraccción de proteínas minoritarias 4-Fracción de proteínas mayoritarias Plasma 5-Marcador de peso molecular 6-Plasma completo 7-Fraccción de proteínas minoritarias 8-Fracción de proteínas mayoritarias
SDS-PAGE 10% SDS-PAGE 10% Introducción MARS Hu-14 Estudio proteómico de plasma en pacientes con Estenosis Aórtica ph 4 7 ph 4 7 Plasma completo Tira IPG 24cm ph 4-7 y 10%SDS-PAGE Plasma deplecionado con MARS HU-14 Tira IPG 24cm ph 4-7 y 10%SDS-PAGE *Gil-Dones F, et al Journal of Proteomics (2011). En Prensa
4 manchas proteicas diferencialmente expresadas 3 aumentadas y 1 disminuídas (p<0.05) 71 manchas proteicas diferencialmente expresadas 41 aumentadas y 30 disminuídas (p<0.05) MARS Hu-14 Plasma completo Gel 2D-DIGE Plasma deplecionado MARS-14 Gel 2D-DIGE *Gil-Dones F, et al Journal of Proteomics (2011). En Prensa
MARS Hu-14 Validación mediante Western Blot Proteína 1 Proteína 2 Proteína 3 *Gil-Dones F, et al Journal of Proteomics (2011). En Prensa
MARS Hu-14 Validación mediante 2D-Western Blot Plasma deplecionado MARS-14 Plasma completo ph 5,5 7 ph 5,5 7 ph 5,5 7 ph 5,5 7 *Gil-Dones F, et al Journal of Proteomics (2011). En Prensa
MARS Hu-14 Validación mediante 2D-Western Blot Plasma deplecionado MARS-14 Plasma completo ph 5,5 7 ph 5,5 7 ph 5,5 7 ph 5,5 7 *Gil-Dones F, et al Journal of Proteomics (2011). En Prensa
MARS Hu-14 Resumen y conclusiones a columna de afinidad MARS Hu-14 reduce la presencia de las 14 proteínas más abundantes de suero, plasma, CR y otros fluidos biológicos. Elimina ~ 94% del contenido total de proteína del plasma/suero. El sistema de eliminación de afinidad múltiple también ofrece la mayor facilidad de uso, la mayor selectividad y reproducibilidad en comparación a cualquier otro sistema equivalente de eliminación de proteínas mayoritarias. Como se ha podido ver en los resultados mostrados el uso de la columna MARS Hu-14 supone una excelente herramienta en la búsqueda proteínas como nuevos biomarcadores de enfermedad.
aboratorio de Fisiopatología Vascular Hospital Nacional de Parapléjicos (Toledo) Dra. M. G. Barderas Dr. F. Gil-Dones Dr. S. Alonso-Orgaz Dr. F.de la Cuesta C. M. aborde. Mourino-Álvarez F. Akerstrom C. Bermúdez Gracias por la atención Unidad de Proteómica Hospital Nacional de Parapléjicos (Toledo) Dra. M. G. Barderas Dra. V. M. Dardé G. Barroso A. Gallardo Servicio de Cardiología Hospital Virgen de la Salud (Toledo) Dr.. R. Padial Dr.. F. ópez-almodovar Dr. J. Moreu