PRACTICA Núm. 12 AISLAMIENTO DE 2 MICROORGANISMOS Y OBTENCION DE UN CULTIVO AXENICO I. OBJETIVO Aislar dos microorganismos por la técnica de siembra de dilución por estría en placa de agar y obtener un cultivo axénico o puro. II. INTRODUCCION Si se toma un asa bacteriológica cargada con una muestra que contenga bacterias y se van haciendo estrías de ésta sobre una placa de agar nutritivo de tal manera que el material se vaya diluyendo sobre la superficie (Fig. 12.1), llegará un momento en que las bacterias depositadas en la estría estén bien separadas unas de otras, reproduciéndose cada una en progresión geométrica (1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, etc.). Dependiendo del tiempo de generación, que varía según la especie bacteriana, después de cierto tiempo, cada una se habrá multiplicado muchas veces, formando sobre la superficie del medio un pequeño promontorio constituido por células bacterianas llamado Colonia, que se obtiene generalmente en unas 24-48 horas. Las colonias de cada especie bacteriana son diferentes ya sea en tamaño, color, consistencia etc., y pueden ser diferenciadas sobre estas bases. Cada colonia aislada está constituida de un solo tipo de bacterias, ya que se supone que es la descendencia de una sola célula y por tanto, un cultivo puro. Para estudiar las características físicas, químicas, fisiológicas, etc., de una bacteria, se necesita que ésta sea aislada en cultivo puro y el aislamiento en caja Petri es el primer paso para ello, siendo el segundo paso la siembra de una porción de una colonia en un medio de cultivo en tubo, verificando su pureza después de la incubación apropiada, mediante observación al microscopio. La morfología de las colonias es importante por lo anteriormente expuesto y debe familiarizarse el alumno con ella. (Fig. 12.2). La terminología mencionada a continuación sobre algunas de las características más constantes de una colonia bacteriana es muy útil: 59
FORMA: Puntiforme, circular, irregular, alargada, fusiforme, filamentosa, rizoide, etc. TAMAÑO: Estimar el diámetro en mm. SUPERFICIE: Lisa, rugosa, cerebriforme, en anillos concéntricos, etc. ELEVACION: Aplanada, elevada, pulvinada, convexa, umbonada, umblicada, etc. BORDE: Continuo, ondulado, lobulado, erosionado, festoneado, filamentoso, etc. ESTRUCTURA INTERNA: Amorfa o granulosa. COLOR: Según sea observado por la luz reflejada o por la luz transmitida, puede ser de color blanco, amarillo, rojo ladrillo, anaranjado, etc. OPACIDAD: Transparente, opaca, etc. CONSISTENCIA: Dura, viscosa, membranosa, gelatinosa, mucosa, etc. Usar el asa bacteriológica para determinar la consistencia. III. MATERIAL Y SUBSTANCIAS. Caja de Petri conteniendo agar nutritivo estéril. 60
2 Tubos de ensayo conteniendo agar inclinado. Tubos de ensayo conteniendo cultivo mixto. Lápiz graso. Asa bacteriológica. Mechero Bunsen. Cerillos ó encendedor. Gradilla. IV. TECNICA 1. Con el lápiz graso dividir la caja Petri en 3 sectores, de tal manera que al destaparla para proceder a la inoculación, se tenga como se indica en la figura: 1 2 3 El sector No. 1 es más pequeño y sirve para descargar el asa. 2. Usando la técnica ya conocida, tomar el cultivo bacteriano y en condiciones asépticas obtener una asada del material. 3. Una vez cerrado el tubo, colocarlo en una gradilla. 4. Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la caja de Petri y descargar el material en el sector 1, trazando una serie de zig-zags muy cerrados a todo lo ancho del sector. Cerrar la caja. 5. Esterilizar el asa flameándola y mientras que se enfría, girar la caja 90 hasta que el sector 1 quede a la izquierda y el 2 hacia arriba a la derecha. 6. Trazar unos 5 zig-zags en el sector 2 invadiendo el sector 1 para llevar un poco de material al sector 2 y las siguientes estrías no deben tocar el sector 1. En esta forma se diluye el material quedando unas bacterias separadas de las otras. 61
7. Esterilizar de nuevo el asa, girar la caja 90 y ahora el sector 2 estará a la izquierda y el 3 a la derecha. 8. Trazar unos 5 zig-zags en el sector 3 invadiendo el sector 2 y el resto sin tocar el sector 2, como se muestra en el dibujo: 9. Incubar a 37 C por 24-48 horas. 10. Observar si hubo o no, aislamiento de colonias. NOTA: En el sector 1 generalmente no se obtienen colonias aisladas, pero en 2 y 3 sí. 11. Anotar las características de las colonias aisladas 12. Inocular a partir de las colonias aisladas los tubos de agar inclinado, por estría, para obtener cultivos puros. (Fig. 12.3) 13. Incubar a 37 C por 24-48 horas. 14. Después de este período observar si efectivamente hubo crecimiento de un solo tipo de microorganismos. 15. Preparar un frotis, teñir con la técnica de Gram y observar al microscopio con objetivo de inmersión para confirmar su pureza. 16. Dibujar las observaciones hechas al microscopio 62
17. Guardar los cultivos puros en el refrigerador para su posterior clasificación e identificación. NOTAS: Siguiendo la misma técnica, la caja de agar se puede dividir en más de 3 sectores, obteniendo una dilución mayor, como se muestra en el dibujo: Existen otras técnicas de aislamiento en placa, como pueden ser la siembra en superficie y la de placa vertida. (Fig. 12.4) V. CUESTIONARIO 1. Describir una técnica de aislamiento bacteriano a partir de una fuente natural. 2. Consultar dos técnicas de aislamiento en tubo. 3. Qué es un cultivo axénico o puro? 4. Qué importancia tiene la obtención de un cultivo puro? 5. Mencionar 5 Colecciones de Cultivos suministradoras de cultivos microbianos puros. 63
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65 MICROBIOLOGIA APLICADA
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