Estimados consocios del Comité de Resistencia de Antibacterianos de la Asociación Panamericana de Infectología:

Comité de Resistencia a Antibacterianos Estimados consocios del Comité de Resistencia de Antibacterianos de la Asociación Panamericana de Infectología: Mediante la presente les envío las modificaciones más importantes con algunos comentarios que se han aprobado para las nuevas recomendaciones M7-A7 / M2- A9 y M100-S16, que rigen a partir del 1ro de enero del 2006 y que reemplazan a las recomendaciones 2005. Próximamente, estoy viendo cómo puedo escanearles las modificaciones en las tablas que como uds verán en el texto son cerca de 40 páginas Reemplazo de tablas (2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2G, 2J). Las tablas se les enviaran a la brevedad. No se enviarán el total de las tablas sino sólo aquellas que hubo modificaciones. Esto es para cumplir con el copyright del CLSI que no permite distribuir, copiar, o vender sus recomendaciones. Sólo puede reproducirse hasta el 20% del total de las recomendaciones sin incurrir en problemas legales. Saludos cordiales, José María Casellas Presidente del Comité de Resistencia a Antibacterianos Asociación Panamericana de Infectología Miembro del Advisory Board de CLSI

CLSI Lo que figura en itálica se basa en opiniones del Comité de API que fueron remitidas a CLSI. CAMBIOS EN METODOS DE DILUCION Enero 2006 M7-A7 Vol. 26 Nº 2 (Reemplaza M7-A6 Vol. 23 Nº 2) 1) Preparación del inóculo. a) La correcta densidad del inóculo 0.5 Mac Farland (con Ba S0 4 ) ó con partículas de látex se debe determinar en un espectrofotómetro midiendo la absorbancia con una fuente de luz de espesor de 1cm y cubetas equiparables. La absorbancia a 625nm debe ser 0.08 a 0.13. Se recuerda que los tubos conteniendo las suspensiones (4 a 6 ml) deben ser de tapa a rosca y conservados en la oscuridad (o tapados con papel negro) a temperatura ambiente (no refrigerar!). Si se usa Ba SO 4 agitar con Vortex antes de usar. Reemplazar y no usar si aparecen partículas groseras. Si se usan partículas de látex agitar por inversión vigorosa. No usar Vortex. La densidad del estándar de Ba So 4 debe controlarse mensualmente. b) Puede usarse la preparación del inóculo por una suspensión de colonias por desarrollo en caldo previo. b1) El método de suspensión directa de colonias es el recomendado en particular para Haemophilus spp, N. gonorrhoeae, N meningitidis y enterococos asi como para determinar oxacilino resistencia. b2) El método de desarrollo previo en caldo puede ser usado alternativamente y se recomienda cuando las colonias son difíciles de suspender (colonias rugosas) o para bacterias no fastidiosas y estafilococos en los casos en que no se disponga de colonias de 24 h. para efectuar la suspensión directa Recordar que para ambos métodos el inóculo corresponde aproximadamente a 1 ó 2 X10 8 UFC/ml de E coli ATCC 25922. 2) Descripción de antibacterianos. 2a) Penemes: Se incluyó la descripción de penemes que se dividen en dos subclases: - carbapenemes - penemes 2b) Glucopéptidos: Se incluye teicoplanina y vancomicina en el grupo. No se deben incluir a los lipopéptidos en este grupo. 2c) Lipopéptidos: Este grupo incluye a ATB que tienen como diana a la membrana citoplasmática. Se consideran 2 subgrupos: - Polimixinas: incluye a Polimixina B y colistina (polimixina E). - Daptomicina: es un lipopéptido cíclico.

Mientras que las polimixinas son solamente activas sobre determinadas especies de gram negativos, daptomicina es sólo activa en gram positivos. Una diferencia de suma importancia es que mientras que el exceso de cationes calcio inhibe la actividad de polimixinas, en cambio para daptomicina la concentración fisiológica de iones calcio (50 mg/l) es esencial para su actividad. 2d) Clases exclusivas de ATB ( simple classes ) - Se agregó telitromicina como futura inclusión en el grupo de cetólidos, separado de macrólidos. - Se agregó tigeciclina como integrante del grupo glicilciclina separada de tetraciclinas. 3) Reactivos. 3a) Medida del ph del Agar Mueller Hinton: Para macrodilución en agar se confirma que si el ph es demasiado bajo (< ph 7.2) los aminoglucósidos y los macrólidos tendrán menos potencia, mientras que otros ATB como tetraciclinas tendrán exceso de actividad. Si el ph es alto (> 7.4) se esperan los efectos opuestos. Preguntas de API - Los inconvenientes para macrólidos se aplican a telitromicina? Hay pruebas de que así es (incubación en CO 2 ) y para tetraciclinas se aplican a tigeciclina? Excluir comentarios sobre daptomicina, talavancina y ceftobioprole que no están (ni se sabe si estarán) a la venta en Latinoamérica. 3b) Suplementación de sangre lisada de caballo (LHB). Alternativamente al método clásico de preparación agregar 5 microlítros de LHB 50% a cada 100 microlitros antes de inocular el pocillo. 4) Bacterias fastidiosas. 4.1) La información sobre Haemophilus spp fue modificada a H. influenzae y H. parainfluenzae exclusivamente. No existe experiencia con dilución en agar. Esta modificación corresponde a una inquietud planteada por el Comité de ATB de API que entendió que no podía aplicarse a otros especies de Haemophilus (ej. H. ducreyii). 4.2) Recomendaciones para el ensayo por microdilución y dilución en agar para el ensayo de N. meningitidis. a) Se han validado tanto la microdilución como la dilución en agar para ensayar N. meningitidis. Hasta el presente la resistencia sólo había sido detectada para penicilina y ampicilina o en ATB usados para la profilaxis de contactos (rifampicina). No se ha detectado resistencia a cefotaxima o ceftriaxona que son empleadas para el tratamiento de infecciones invasivas por lo que no se sugiere su ensayo rutinario.

b) Debe recordarse el peligro que implica la generación de aerosoles por lo que se sugiere que cuando se trabaja con aislados de N. meningitidis se efectúen los procedimientos en una cabina con flujo laminar y lámparas de luz UV. El operador debe usar barbijo. Se recomienda la vacunación del personal que trabaja con frecuentes aislados. c) Medios recomendados. Para microdilución se recomienda el caldo Mueller Hinton con ajuste de cationes y el agregado de 2 a 5% de sangre de caballo lisada. Para la dilución en agar el ensayo puede realizarse con agar Mueller Hinton con el agregado de 5% de sangre ovina desfibrinada. d) Ensayo Se recomienda el método de suspensión directa de colonias a partir de cultivo de 20-24hs en agar achocolatado enriquecido con suplementos e incubado a 35º +- 2ºC en una atmósfera de 5% de CO 2. Se prepara una suspensión en solución fisiológica para lograr una concentración de 0.5 Mac Farland (ver punto 1). Esta suspensión debe usarse dentro de los 15 minutos de preparada con la turbidez ajustada. Las placas o loa paneles se incuban a 35ºC +- 2ºC en atmósfera de 5% de CO 2 por 20 a 24hs. e) Criterios de interpretación. e1) Para tratamiento CIM mg/l Comentarios ATB S I R Penicilina Ampicilina 0.06 0.12-0.25 0.12 0.25-0.1 0.5 2 Cefotaxima ó cefriaxona 0.12 -- -- No se han aislado cepas R. Meropenem 0.25 -- -- No se han aislado cepas R. Minociclina 2 -- -- No se han aislado cepas con CIM superiores. Cloranfenicol 2 4 8 Levofloxacina ó Ciprofloxacina 0.03 0.06 0.12 Para vigilar la emergencia de R considerar que una CIM 8mg/L a ácido nalidíxico se correlaciona con disminución de sensibilidad a fluoroquinolonas. e2) Para profilaxis. CIM mg/l Comentarios ATB S I R Rifampicina 0.5 1 2 TMS 0.12 0.25 0.5 Valores en trimetoprima Azitromicina 2 -- -- No se han detectado cepas con CIM superiores.

5) Bacterias problema. 5.1) Recomendaciones para el estudio de resistencia mec A en estafilococos. 5.1.a) Muchos de los estafilococos OXA R están mediados por el gen mec A que dirige la producción de una PLP supletoria: PLP2a que es expresada sea hemogéneamente o en forma heterogénea. La resistencia homogénea es detectada, sin problemas, por los métodos estándar mientras que la detección de la resistencia heterogénea es mucho mas dificultosa dado que sólo una fracción de la población (ej.: 1:100000 células) expresan este fenotipo. Hace unos años (y en recomendaciones precisas de CLSI (NCCLS)) la presencia de resistencia a otros ATB se consideraba propia de oxacilina-resistencia. Sin embargo, actualmente muchos aislados de MRSA adquiridos en la comunidad (CA-MRSA) no presentan la clásica resistencia múltiple. 5.1.b) Los aislados OXA-S, mec A negativos de S. lugdunensis exhiben CIM en el rango de 0.12 a 1mg/L, mientras que las cepas mec A positivas son casi siempre 4mg/L. Por lo tanto la presencia de mec A en S. lugdunensis es detectada con mayor efectividad utilizando los criterios para S. aureus que para estafilococos coagulasa negativos. 5.1.c.1) Métodos Oxacilina es la preferida entre las penicilinas estables a la penicilinasa para el ensayo in vitro. Pero debe tenerse en cuenta en los países que los comercializan que el resultado para oxacilina puede aplicarse a cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, meticilina y nafcilina. c.2) Los ensayos para detectar el gen mec A o la proteína que codifica la PLP 2a son los métodos más adecuados para predecir la resistencia a oxacilina. c.3) Los resultados del método de difusión con disco de 30 microgramos de cefoxitina pueden ser usados para predecir la resistencia mediada por mec A en estafilococos. Los resultados del disco de cefoxitina son equivalentes a la CIM a oxacilina en S. aureus tanto en sensibilidad como en especificidad. Para los estafilococos coagulasa negativos el disco de cefoxitina tiene equivalente sensibilidad que la CIM a oxacilina pero el disco de cefoxitina presenta mayor especificidad (identifica con mayor efectividad las cepas que presentan gen mec). 5.1.d) Ensayo de oxacilina. d 1 ) Se requiere la adición de Na Cl (2% p/v; 0.34 mol/l) Tanto para dilución en agar como con dilución en caldo. d 2 ) La suspensión se debe preparar por el método de suspensión de colonias (ver punto 1), no por desarrollo previo en caldo. d 3 ) La incubación debe prolongarse por 24h. a 35ºC. El ensayo a temperaturas superiores a 35ºC puede no detectar la oxacilina resistencia. Sin embargo si se observa resistencia a las 16h, puede ser informada.

5.1.e) Informe e1) Si se usa el disco de cefoxitina se puede informar la oxacilina basado en su resultado. e2) Igualmente si se detecta el gen mec A o la producción de PLP 2a se debe informar la oxacilina como resistente. e3) Si los aislados dan resultado negativo para mec A o PLP 2a se debe informar sensible a oxacilina siempre que la CIM sea < 2mg/mL. Si la CIM es 4 mg/l aunque sea mec A y/o PLP 2a negativa debe informarse oxacilina resistente debido a que la resistencia podría ser debida a otra causa. e4) Si el aislado es OXA-R deben informarse todos los beta lactámicos como R. Sin embargo si es OXA-S, el resultado debe corresponder al ensayo en cada beta lactámico individualmente. 5.2) Placa de despistaje agar screen para vancomicina. Puede usarse para detectar S. aureus con sensibilidad reducida a vancomicina. Se recomienda el uso de agar cerebro-corazón (BHI) suplementado con 6 mg/l de vancomicina. Es preferible la inoculación directa de una suspensión de colonias equivalente a 0.5 Mac Farland. Con una micropipeta se deposita una gota de 10 microlitros sobre la superficie del agar. Incubar a 35ºC por 24h. CLSI. CAMBIOS EN MÉTODOS DE DIFUSIÓN (DISCOS O TABLETAS). Muchos cambios se refieren a los ya presentados en los métodos de dilución. 6.1) Descripción de antibacterianos. (ver puntos 2, 2a, 2b, 2c, 2d). 6.2) Problemas que ocurren si el ph del medio Mueller Hinton está fuera de rango. (ver puntos 3, 3a y 3b). Ver más adelante tabla 3C. 6.3) Preparación del inóculo 0.5 Mac Farland. (ver punto 1, 1a, 1b) 6.4) Cambio en las especies requeridas como Haemophilus spp. (Ver punto 4, 4.1 y comentarios). 6.5) Recomendaciones para el ensayo de N. meningitidis. (Ver puntos 4.2, 4.2.a, 4.2.b, 4.2.c y 4.2.d) Ver los criterios de interpretación (adelante) en la tabla 2J. 6.6) Se separan las tablas de S. pneumoniae y estafilococos (Ver adelante y tabla 2G y 2H) 6.7) Ensayo de oxacilina resistencia a S. lugdunensis. (Ver tabla 5.1.b) 6.8) Recomendaciones para ensayar e informar la resistencia por gen mec A en estafilococos. (Ver punto 5, 5.1.a, 5.1.b, 5.1.c, 5.1.d y 5.1.e)

6.9) Empleo del disco de cefoxitina como reemplazo al disco de oxacilina para detectar oxacilina resistencia en estafilococos. (Ver punto 5.1.c.3) 6.10) Procedimiento actualizado para el agar screening para detectar resistencia en S. aureus exclusivamente. El método de despiste ( screening ) para detectar oxacilina resistencia en S. aureus sigue siendo recomendado. Recordar que sólo es recomendado para S. aureus y NO debe emplearse para coagulasa negativos. Se realiza inoculando colonias de S. aureus sobre agar Mueller Hinton que ha sido suplementado con NaCl (4% p/v; 0.68 mol/l) y con 6mg/L de oxacilina (se puede obtener de Sigma). Hay dos formas de inocular: A partir de la suspensión de colonias a 0.5 Mac Farland usando pipeta que libere 1 microlitro o con hisopo. a) Usando ansa inocular un área de 10 a 15mm de diámetro. b) Usando un hisopo, elimine el exceso de líquido comprimiendo el hisopo sobre la pared del tubo y siempre en área de 10 a 15mm de diámetro en forma de obtener un desarrollo confluente. Incubar a 35ºC (no más!) por 24h completas y examinar cuidadosamente con luz transmitida para la búsqueda de colonias de pequeño tamaño o una ligera pátina de crecimiento. (En la reunión de CLSI se sugirió que si no se tiene buena acuidad visual se utilice lupa y para ello que se disponga de una cepa de lectura difícil para evaluar la capacidad de los técnicos para efectuar la lectura). No deben reusarse las placas incubadas previamente. 6.11) Recomendaciones para el uso de la placa de despìste de agar cerebro corazón para detectar con sensibilidad disminuida a vancomicina S. aureus y para enterococos. (Ver punto 5.2 para S. aureus). Para enterococos. La placa de agar cerebro corazón suplementada con 6mg/L de vancomicina puede usarse para la detección de enterococos resistentes a vancomicina. Proceder exactamente igual que en el método para detección de oxaxilina resistencia en S. aureus. (Sin NaCl ). (Ver punto 6.10, 6.10a y 6.10b y comentarios). 6.12) Recomendaciones para detectar resistencia inducible a clindamicina en Staphylococeus spp y estreptococos beta hemolíticos. Los aislados resistentes a macrólidos (y azálidos) en S. aureus, estafilococos coagulasa negativos y estreptococos beta hemolíticos (de cualquier grupo) pueden presentar resistencia constitutiva o inducilble a clindamicina (por metilación del rarn 23S codificado por el gen erm). Esta resistencia también se conoce como MLS B (macrólidos, lincosamidas, estreptograminas del grupo B). Por otra parte la resistencia puede ser debida a un mecanismo de eflujo que afecta a macrólidos de 14 miembros (eritromicina, claritromicina, roxitromicina) y azálidos. El mecanismo de eflujo está codificado por el gen msr A en estafilococos y por el gen mef en estreptococos.

La resistencia inducible a clindamicina puede ser detectada por el método de aproximación de discos que debieran formar parte en estas especies de la PSA por discos. (El método original fue propuesto por la Dra. Seppala usando tabletas y se conoce en Europa como Seppala test. En USA dada la forma que se observa cuando existe inducción se conoce como D test. Esta forma era conocida previamente para detectar la resistencia inducible en productores de ampc acercando discos a cefoxitina o ácido clavulánico a cefotaxima. Por otra parte en caso de utilizar el término de USA no debemos denominar di test sino de test ). Si aparece la zona mencionada se supone que existe resistencia inducible. (A pesar de que con el disco de clindamicina del lado opuesto hay un halo manifiesto). Para que la prueba sea efectiva se recomienda colocar un disco (o tableta) de 2 microgramos de clindamicina a 15mmde distancia de un disco (o tableta) de eritromicina de 15 microgramos (ojo no otro macrólido) de borde a borde. Los aislados con resistencia inducible a clindamicina (test de Seppala positivo) deben ser informados como clindamicina resistentes. Se incluye en la recomendación que a pesar de ello clindamicina podría resultar efectiva en algunos pacientes. (Hemos enviado a CLSI un documento probando que con alto inóculo la mayoría de los inducibles seleccionan una población resistente). 6.13) Se incluyen las cepas de QC para la prueba de despiste de S. aureus oxacilina resistentes. Las cepas son S. aureus ATCC 29213 y S. aureus ATCC 43300. (Deben usarse ambas cepas). 6.14) Problema de pérdida del plásmido de E. coli ATCC 35218. E. coli ATCC 35218 contiene un plásmido que codifica producción de beta lactamasa (NO BLEE!), por lo cual es resistente a varios beta lactámicos (productores de TEM-1; TEM-2; SHV-1; etc) pero es sensible a la acción de combinaciones con inhibidores de beta lactamasas (ampicilina+ sulbactam, amoxicilina+ clavulánico, piperacilina+ tazobactam, ticarcilina+ clavulánico). El plásmido puede estar presente en la cepa control de QC pero puede perderse durante el mantenimiento en congelador o heladera. Para asegurarse de que el plásmido no se ha perdido, la cepa debe ensayarse frente a un beta lactámico sólo (ampicilina, piperacilina o ticarcilina) y a otro adicionado a un inhibidor (ej ampicilina-sulbactam). Si la cepa perdió el plásmido será sensible al agente beta lactámico sin inhibidor. (No queda claro por qué este criterio no se aplica a las cepas que se usan como QC de BLEE?). 6.15) Frecuencia de ensayo de cepas QC. 6.15.1) El QC debe ser efectuado diariamente en casos que se efectúan PSA en menor frecuencia que uno por semana. - Se considera que el QC es satisfactorio cuando no más de 3 de 30 resultados consecutivos para cada combinación ATB/bacteria estén fuera de los límites aceptables. Caso contrario se requiere una acción correctiva por el laboratorio. (Ver adelante tabla 3C las posibles causas de error).

6.15.2) Requerimiento para pasar de control diario a control semanal. a) Ensaye todos los QC aplicables por 20 a 30 días consecutivos y documente los resultados. b) Para convertir el ensayo diario en semanal no más de 1 entre 20 ó 3 de 30 diámetros de halos para cada combinación ATB/bacteria puede estar afuera de los intervalos de diámetro aceptables. De lo contrario tomar acciones correctivas (Ver tabla 3C posibles causas de error). 6.15.3) El control semanal puede realizarse toda vez que se hayan obtenido resultados satisfactorios según 6.15.2 - Realice un QC de los discos o tabletas una vez por semana y además cada vez que use un nuevo lote de agar, de suplementos o de discos o tabletas o bien toda vez que cambia la marca (fabricante) de cualquiera de dichos productos. - Cualquiera de las causas que determinan que los resultados no están en el rango aceptable debe llevar a una acción correctiva. - Si se agrega un ATB nuevo hay que proceder según 6.15.2 y 6.15.3. 6.15.4) Razones obvias (más frecuentes) que dan lugar a resultados fuera de límites aceptables. - Uso de un disco equivocado. - Uso de una cepa de QC que no corresponde a la bacteria/atb ensayada. - Contaminación de la cepa QC. - Tiempo de lectura a temperatura de incubación inapropiados. 6.15.5) Resultados fuera de control por causas no obvias. Ensaye el par de ATB/bacterias QC por 5 días consecutivos. Documente si los 5 resultados están dentro de rangos aceptables, en tal caso no se requiere acciones correctivas. Si uno o más de los 5 ensayos están fuera de rango debe tomarse una acción correctiva. Piense en las siguientes posibilidades: - Lectura y copia incorrecta de halos. - Estado del estándar de turbidez. No debe estar vencido (duración 1 mes). - Todos los implementos usados deben estar dentro del plazo de expiración y almacenados a temperaturas adecuadas. - La temperatura de la estufa debe ser la correcta y mantenerse estable. - Ansas, pipetas e hisopos deben estar en buenas condiciones. - Los discos o tabletas no deben haber sido almacenados a temperaturas diferentes de las indicadas por el fabricante. - La cepa de QC tiene el desarrollo habitual y no está contaminada?. - Se están preparando correctamente los inóculos?. El inóculo proviene de una placa incubada el tiempo correcto (no más de 24hs). Si aún así no se comprueban fallas puede ser necesario obtener una nueva cepa QC (Ver tabla 3C). TABLAS. Seguidamente se incorporan las copias de las tablas que han sufrido modificaciones.

Tabla 2A Enterobacteriaceae. 1) Se agrega cefamicinas junto con cefalosporinas de 1º y 2º generación de los ATB que NO deben ensayarse para Salmonella spp y Shigella spp ya que no son efectivos clínicamente. 2) Se indica que P. mirabilis sólo debe ser ensayado para BLEE cuando es clínicamente relevante. (Ej bacteriemias). Este punto fue rechazado por la mayoría de integrantes de la SC de ATB de API. 3) Se modifican los puntos de corte para sospechar BLEE para cefpodoxima y P. mirabilis. El valor de sospecha es 22mm. Tabla 2B P. aeruginosa, Acinetobacter spp, B. cepacia y S. maltophilia. Se separan en tablas individuales para cada género 2B 1, 2B 2, 2B 3 Y 2B 4. Se incorpora TMS al informe de B. cepacia. Tabla 2C Estafilococos 1) Se agrega en las condiciones de ensayo que la temperatura no debe exceder los 35ºC. 2) Se agregan para QC S. aureus ATCC BAA-977 y S. aureus ATCC BAA-976 con el objeto de controlar el resultado de la inducción de metilasa en clindamicina. 3) Se destaca que para ciertos ATB la ausencia o excepcional ocurrencia de cepas resistentes impide la inclusión de otra categoría que no sea sensible. 4) Se reitera que para S. lugdunensis no se debe ensayar oxacilina sino cefoxitina e informar como betalactámico el resultado de cefoxitina. 5) Se destaca que si se obtiene resultados intermedios para oxacilina se debe controlar efectuando algunos de los siguientes ensayos que definirá OXA S u OXA R (no informar OXA I) - Disco de cefoxitina (informar el resultado como oxacilina). - Usar la placa de despiste ( screening ) con oxacilina y NaCl. - Detectar gen mec ó PLP 2a. 6) Se recuerda que el disco de cefoxitina es más específico para detectar el gen mec en estafilococos coagulasa negativos que oxacilina. Puede usarse cefoxitina (no oxacilina) para detectar gen mec en S.saprophyticus. Tabla 2D Enterococos. Se incluyeron las siguientes aclaraciones al pie de tabla de resistencia de alto nivel a aminoglucósidos (RANAG). Se debe aclarar a los médicos solicitantes que en RANAG: Resistente: indica que no habrá sinergia con ATB que afectan biosíntesis de pared celular (ej.: ampicilina, penicilina, vancomicina ) Inconclusivo o intermedio: implica que el resultado debe ser ensayado por dilución. Sensible: implica sinergia con ATB que afectan síntesis de pared (siempre que exista sensibilidad - no intermedio! a éstos).

Tabla 2E Haemophilus. La única modificación es la aclaración que la tabla NO es para Haemophilus spp sino solamente para H. influenzae y H. parainfluenzae. Tabla 2G Neumococos. Se indica que si un aislado presenta una zona 19mm debe efectuarse CIM a penicilina, cefotaxima o ceftriaxona o meropenem ya que puede ser falso resistente. Tabla 2J Meningococos. Nueva tabla. Ver atrás punto 4. Se destaca que penicilina y ampicilina sólo pueden determinarse por dilución.