Módulo I: Moléculas pequeñas. Módulo II: Macromoléculas.

CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL FCEyN-INTI Materia de Especialización CEBI_E1 Técnicas de análisis en biotecnología Módulo I: Moléculas pequeñas. Módulo II: Macromoléculas. Docente a cargo: SANTAGAPITA, Patricio CEBI_E1_9: Resonancia magnética nuclear

Técnicas de análisis estructural Espectrometría de masa Espectroscopia RMN Patricio Santagapita_CEBI_E1

Espectroscopía Estudio de la interacción entre la radiación electromagnética y la materia, con absorción o emisión de energía radiante T E R M I N O L O G I A Composición: átomos presentes y su proporción (formula molecular) Constitución: uniones entre los átomos (grupos funcionales y subestructuras) Configuración: disposición espacial de los átomos Conformación: disposición espacial de la molécula (rotación o giro de los enlaces simples) Patricio Santagapita_CEBI_E1

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Rayos X/g UV/Vis IR Microondas Radiofrecuencia l Transición de e - internos Transición de e - de valencia Vibración molecular Rotación molecular Spin nuclear Espectroscopía UV Espectroscopía de abs. atómica Espectroscopía IR Espectroscopía RMN Espectroscopía de absorción (o emisión), como IR o UV. Detecta la absorción de radiofrequencias (radiación electromagnética) por ciertos núcleos en una molécula.. Patricio Santagapita_CEBI_E1

Espectroscopía TÉCNICA Rayos X Ultravioleta-Visible Infrarrojo Espectrometría de masas* Resonancia magnética nuclear INFORMACIÓN OBTENIDA Estructura total de la molécula incluída la estereoquímica (posiciones relativas de los átomos) Existencia de cromóforos y/o conjugación en la molécula (absorciones) Grupos funcionales (absorciones) Formula molecular y subestructuras (relación m/z). Grupos funcionales, subestructuras, conectividades, estereoquímica, etc (desplazamiento químico, áreas de los picos y constantes de acoplamiento) * No es una técnica espectroscópica en el sentido que estamos viendo pues no existe irradiación electromagnética de la sustancia y no se produce absorción de dicha radiación. Patricio Santagapita_CEBI_E1

Por qué estudiar RMN? Elucidación estructural Química de los productos naturales. Síntesis orgánica. Método analítico para elegir las condiciones de reacción Estudio de procesos dinámicos Cinética de reacciones. Estudio del equilibrio (químico y estructural). Estructura (tri-dimensional) Proteinas. ADN. Complejos proteína/adn Polisacáridos Diseño de drogas Relación Estructura Actividad por RMN Medicina MRI (Imágenes) Patricio Santagapita_CEBI_E1

RMN: Aplicaciones Análisis cualitativo (determinación estructural) y cuantitativo de las moléculas, orgánicas o inorgánicas, que componen la muestra Determinación estructural de moléculas (productos naturales o sintéticos) propiedades que poseen los núcleos atómicos Análisis de macromoléculas biológicas en condiciones similares a las naturales Estudio de la composición de muestras de origen natural (aceites, vinos, etc). Control de calidad en la industria química, industria de alimentos, industria farmacológica y en síntesis química. Determinación de constantes físicas y químicas (termodinámicas y cinéticas) Patricio Santagapita_CEBI_E1

RMN: fenómeno Núcleos atómicos: espacios ocupados por partículas subatómicas (protón y neutrón). Rodeados de capas de e - (modelo eléctricamente neutro) - - - + 0 0 + 0 + 0 + 0 + - Núcleo + - protones 0 neutrones electrones orbitando ESPÍN (rotación alrededor del eje) MOMENTO ANGULAR (Cantidad de movimiento de rotación) Patricio Santagapita_CEBI_E1

Protón girando Un protón girando genera un campo magnético (momento magnético). Este campo magnético (B) se asemeja al de un imán (dipolo magnético). Qué espín tienen los núcleos? Núcleo está constituido por p protones y n neutrones Espín del núcleo: vector combinación del espín de todos sus p 1. p y n pares proporcionan espín nulo (I = 0): 4 He, 12 C, 16 O, 2. p y n impares dan espín entero: I = 1 2 D, 14 N; I = 3 10 B; 3. p + n = impar espín semientero: I = 1/2 1 H, 13 C; I = 5/2 17 O; TODO NÚCLEO CON ESPÍN NO NULO (I 0) ES SENSIBLE A RMN Patricio Santagapita_CEBI_E1

Los estados de spin del nucleo (m) estan cuantizados: m = I, (I - 1), (I - 2),, -I m es el número cuántico magnético. Para 1 H, 13 C, 15 N, 31 P : m = 1/2, -1/2 Esto significa que solo existen dos estados (niveles E) para ese núcleo Patricio Santagapita_CEBI_E1

En un núcleo con espín no nulo (I 0): Los dipolos magnéticos están dispuestos al azar Qué le ocurre bajo un campo magnético externo (B 0 )? El campo intenta alinear los dipolos de los núcleos en su misma dirección pero: 1. El momento magnético forma un ángulo con B 0 2. Existe más de una orientación del momento respecto a B 0 Patricio Santagapita_CEBI_E1

El momento magnético del núcleo rota alrededor del eje de B 0 con una frecuencia de precesión (w o u): Se comporta como un trompo o giroscopio Patricio Santagapita_CEBI_E1

Modelo de giróscopo del spin nuclear : B o m = -1/2 Nucleo rotando La cuantización de la componente según z del spin nuclear resulta en un ángulo = 54.73º para spin ½ o de 45º para spin 1.

Para un núcleo de I = ½ Dos estados energéticos posibles: a favor o en contra del campo B o B o = 0 B o > 0 b a La energía necesaria para pasar de un estado de espin al otro está determinada por: E = h = g h B 0 / 2 0 = g B 0 / 2 ECUACIÓN DE LARMOR E: relacionado con la intensidad del campo externo (B 0 ) y con la frecuencia de precesión ( ) El cambio de orientación se realiza absorbiendo o emitiendo radiación a la misma frecuencia ( ) Patricio Santagapita_CEBI_E1

Bajo un B 0 qué ocurrirá si suministramos E por otra fuente? Irradiando una radiofrecuencia ( ) los núcleos entran en RESONANCIA: absorben E y cambian de orientación Cambio de orientación crea un voltaje que puede ser registrado Patricio Santagapita_CEBI_E1

Magnetización macroscópica M o es directamente proporcional a la diferencia de población (N a - N b ), en la cual se promedian las contribuciones de los diferentes ms : z z x M o x y B o y B o Si descomponemos la contribución de los m en contribución sobre z y en el plano <xy>. Los componentes en el plano <xy> estan distribuidos al azar y se cancelan. Para los del eje z, tenemos una magnetizacion proporcional a N a - N b. Esto es mas o menos la situacion en una muestra macroscópica, usamos M o Diferencia importante entre m y M o. El primero está cuantizado y puede adoptar sólo uno de dos estados (a o b), El ultimo es la población total de spins (es un número continuo de estados).

Interpretación gráfica

RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR radiofrecuencia (bobina) propiedad del núcleo (espín I) campo magnético externo (B 0 ) (imán) Detector (bobina) para registrar el cambio de orientación Patricio Santagapita_CEBI_E1

Al dejar de irradiar con la frecuencia de resonancia la distribución vuelve al estado basal (relajación) La señal depende del exceso de núcleos que viene fijado por E: E ghb 0 2 h 1. Constante giroscópica del núcleo (g) 2. Campo magnético externo (B 0 ) A mayor B 0 : 1. Mayor exceso en N i (más señal o sensibilidad) 2. Mayor 0 (más resolución) Patricio Santagapita_CEBI_E1

1 millón - 64 El exceso de población con el que se trabaja es muy pequeño 2 millones 1 millón - 32 1 millón -8 m = 16 m = 64 m = 128 1 millón + 8 E 1 millón + 32 B 0 (Tesla) 0 T 2.35 T (100 MHz) 1 millón + 64 9.4 T 18.8 T (400 MHz) (800 MHz) Patricio Santagapita_CEBI_E1

Influencia de B 0 en la calidad del espectro Espectros RMN 1 H de santonina 90 MHz 500 MHz A mayor B 0 MAYOR RESOLUCIÓN DE MULTIPLETES

Para cada tipo de núcleo la frecuencia de Larmor puede sufrir pequeñas variaciones que dependen del entorno molecular: Los electrones de los alrededores producen pequeños campos magnéticos que se agregan a B 0 Desplazamiento Químico (ppm de la frecuencia) Los núcleos de los alrededores con momento magnético dan lugar a desplazamientos simétricos de las frecuencias Acoplamiento spin-spin:j (Hz) Patricio Santagapita_CEBI_E1

Qué información se puede obtener de un espectro RMN 1 H? Número de señales: relacionada con el número de 1 H diferentes de la muestra Frecuencia de las señales ( ) : relacionada con el entorno molecular del núcleo. Área de las señales (integral): relacionada con la cantidad de cada tipo de 1 H. Multiplicidad de cada señal: relacionada con el número de 1 H vecinos de cada tipo. Constantes de acoplamiento (J): brinda información estereoquímica. Intercambio de 1 H : indica la presencia de cierto tipo de grupos funcionales (-COOH, -OH, -NH 2 ) Patricio Santagapita_CEBI_E1

constantes de acoplamiento: J (Hz) integrales frecuencia ( ) triplete multiplete triplete Multiplicidad de señales Patricio Santagapita_CEBI_E1

Escala de RMN (, ppm) 0 = g B 0 / 2 ECUACIÓN DE LARMOR La frecuencia de Larmor de un núcleo depende de B 0 No se puede definir ni utilizar una escala de frecuencias absoluta en RMN Ej: en un equipo de 90 MHz, la señal de CH 3 Br aparece a 90000237 Hz, la de CH 2 Br 2 a 90000441 y la de CHBr 3 a 90000614 Hz Se define una escala relativa y sin unidades: desplazamiento químico (, ppm) utilizando una sustancia de referencia = muestra - ref. X 10 6 ref. Se expresa en partes por millón (ppm) es independiente de B 0 para un dado núcleo, su será el mismo en cualquier equipo.

Desplazamiento CH 3 H 3 C Si CH 3 CH 3 Tetrametilsilano = TMS. Referencia más usada. Soluble en la mayor parte de los solventes, inerte, volátil, da una señal intensa (12H) y suele estar a menores que la mayor parte de los compuestos orgánicos Por definición: TMS = 0 El TMS se agrega al solvente deuterado en el que se prepara la muestra

Escalas de 1 H : ~ 15 ppm Acidos, Aldehidos Alcoholes, protones a Aromaticos a cetonas Olefinas Alifáticos ppm 13 C : ~ 220 ppm 15 10 7 5 2 0 TMS C=O de cetonas Aromaticos,olefinas Alifaticos CH 3, CH 2, CH ppm 210 150 100 80 50 0 TMS C=O de Acidos, Carbonos unidos a grupos oxigenados y derivados de ácido

Desplazamiento El electrón tiene I = ½ posee momento magnético y éste es mucho más intenso que el de 1 H En una molécula, un núcleo está rodeado por una nube electrónica el B ef sobre el núcleo es la suma de B 0 y el campo generado por los electrones, B loc Como el electrón tiene carga negativa, el campo se opone al B 0 B ef < B o la nube electrónica apantalla

Desplazamiento 31 e - que rodean al nucleo tienen carga opuesta al 1 H, entonces pueden generar un campo magnético opuesto a B 0 Desapantallamiento Factores que disminuyen la densidad electrónica permiten al núcleo ver más a B 0 Resonancia a > energía Apantallamiento Factores que aumentan la densidad electrónica no dejan ver al núcleo a B 0 Resonancia a < energía

RMN de protones < apantallamiento campos bajos > δ > apantallamiento campos altos < δ Campo bajo Protección Aumenta el campo magnético Aumenta la frecuencia Campo alto Desprotección

Factores que afectan al desplazamiento Efecto inductivo: Si un átomo más electronegativo retira densidad de carga eléctrica, el B loc que se oponía a B 0 disminuye, en consecuencia la resonancia se produce con un campo externo menos intenso. Ojo! Se produce a mayor frecuencia, más a la izquierda Cuanto mayor es la diferencia de electronegatividad, mayor es el desapantallamiento/protección

Factores que afectan al desplazamiento Anisotropía magnética de los sistemas : Cuando los sistemas de electrones son sometidos a B 0 inducen otro campo que se opone al anterior. Aromáticos: el campo magnético efectivo que sienten los protones aumenta δ Otros sistemas con electrones

Factores que afectan al desplazamiento Puentes de hidrógeno: Los protones que pueden formar enlaces por puentes de hidrógeno (alcoholes, aminas) disminuyen fuertemente la densidad electrónica alrededor del 1 H. A medida que aumentan los puentes aumenta también el desplazamiento químico. RMN del hidrógeno ácido del fenol a distintas concentraciones

Multiplicidad El 1 H que observamos sufre está sometido a dos B ef diferentes: En uno B 0 se refuerza por el 50% de los núcleos alineados con él 2) En el otro, B 0 sufre una pequeña merma por el 50% de los núcleos que están en su contra. El 1 H aparece como un doblete debido a la influencia del protón vecino. La separación entre las señales es la constante de acoplamiento J y se mide en Hz.

Generalizando: la señal de un núcleo acoplado a n spins equivalentes constará de n + 1 líneas 8 Las intensidades de las líneas siguen el triángulo de Pascal 4 4 2 22 2 1 1 1 1 2 1 1 3 3 1 1 4 6 4 1 s d t q qn 1 111 111 1

Patrones de acoplamiento más comunes X CH 3 X Metilo: singulete Etilo: cuarteto - triplete X X tert-butilo: singulete iso-propilo: septeto - doblete

Patrones de acoplamiento más comunes Alquenos La multiplicidad observada para H a es un doble doblete H c 2 J gem = 0 1 Hz X C H a C H b 3 J trans = 11-18 Hz 3 J AC 3 J AB 3 J AB 3 J cis = 6-15 Hz

INTERPRETACIÓN DE UN ESPECTRO 1 H-RMN Número de señales: relacionada con el número de 1 H diferentes Frecuencia de las señales ( ) : relacionada con el entorno molecular del núcleo. Tipo de 1 H diferentes Área de las señales (integral): cantidad de cada tipo de 1 H diferentes Multiplicidad de cada señal: relacionada con el número de 1 H vecinos de cada tipo. Constantes de acoplamiento (J): brinda información estereoquímica Intercambio de 1 H : indica la presencia de cierto tipo de grupos funcionales (-COOH, -OH, -NH 2 )

INTERPRETACIÓN DE UN ESPECTRO 1 H-RMN FM=C 4 H 8 O 2 IR C=O Tabla Señal Multip. y J 1.1 14 2.3 11 3.7 15 total 40 40/8=5 14/5=2.8~3 11/5=2.2~2 15/5=3 Estructura?? integral

INTERPRETACIÓN DE UN ESPECTRO 1 H-RMN FM=C 4 H 8 O 2 IR C=O Tabla Señal Multip. y J 1.1 14 2.3 11 3.7 15 total 40 40/8=5 14/5=2.8~3 11/5=2.2~2 15/5=3 Estructura?? integral

INTERPRETACIÓN 1 H-RMN su isómero

Como preparar una muestra? Para un 1 H se utilizan unos pocos mg Cuidados:5-10 mg para moléculas promedio. La muestra: soluble en un solvente deuterado. Por qué? La señal del deuterio se utiliza para la estabilización del campo y como referencia. Cuánto? alrededor de 0,5 ml de solvente No disolver en recipientes grandes La solución no debe contener sólidos en suspensión (polvo, sílica, fibras, etc.) Filtrar a través (algodón o lana de vidrio). Evitar la presencia de metales (limaduras, restos de granallas, etc.) La solución debe ser homogénea en todo el tubo Evitar excesiva manipulación del material

Cuantificación por RMN Cuantificación relativa similar a un CG pero el factor de respuesta es conocido en forma exacta RMN es el método más usado para la determinación relativa de isómeros, diasterómeros y enantiómeros Cuantificación absoluta Se agrega un estándar a una masa conocida de mezcla RMN es un método primario de medición (con la más alta calidad metrológica y cuyos resultados son aceptados sin referencia a un estándar de la cantidad que se está midiendo)

Cuantificación absoluta: Uso de patrón interno El área no depende de la molécula en que se encuentran (la respuesta se relaciona con la cantidad de núcleos) No requiere separación previa ni establecimiento del factor de respuesta. Condiciones para un patrón Tener por lo menos un núcleo en común con la muestra Ser soluble en el mismo solvente No interferir con la muestra (no dar señales próximas, preferentemente una única, ni reaccionar químicamente con ella) Obtenerse con alto grado de pureza y título confiable Sustancia estable, no volátil, preferentemente sólida

Patrones más comunes

A B C D E F G S: integral, N: nro. de núcleos, m: masa, M: PM, p: pureza

Ventajas y desventajas Ventajas No requiere de determinación del factor de respuesta => NO son necesarios estándares de TODOS los analitos No requiere mantenimiento del sistema de detección (sangrado de columnas, carbonización en inyectores, etc.) No requiere de separación previa y puede cuantificarse más de un compuesto en el mismo espectro. Pueden cuantificarse impurezas inesperadas. Es simple, preciso y no destructivo. El costo de mantenimiento es fijo (se use o no el espectrómetro). Desventajas El costo de mantenimiento es el mismo. El costo del equipo de altos campos es 20 o 30 veces el de un CG o un HPLC La utilización del equipo requiere de personal entrenado Requiere de la utilización de He y N 2 líquidos, y su consumo es permanente.

y = 45º se observan todas las señales y = 90º se observan sólo los CH y = 135º se observan por un lado CH y CH 3 y por otro los CH 2, con fases opuestas

DEPT 45: CH 3, CH 2 y CH H Me O DEPT 90: solo CH DEPT 135: CH 3, CH, CH 2

Programa de análisis

Instrumentación en RMN B o N S Imán B 1 Generador de Frecuencia Registrador Detector Imán - Normalmente un superconductor. Algunos electroimanes e imanes permanentes (EM-360, EM-390) quedan. Generador de Frequencia Crea la corriente alterna (a w o ) que induce B 1. De onda continua o pulsado. Detector Resta la frecuencia base (una frecuencia constante muy cercana a w o ) de la frecuencia de salida. Da una frecuencia baja mucho más facil de manejar. Registrador - XY ploter, osciloscopio, computadora, etc., etc.

Free Induction Decay (FID) (decaimiento libre de la inducción Estamos interesados en analizar la señal que aparece en la espira receptora despues de poner la magnetización en el plano <xy> ( / 2 pulso). Dijimos que la muestra retornará al equilibrio precesionando (z). En el sistema rotante, la frecuencia de esta precesión es w - w o. La relajación de M o en el plano <xy> es exponencial (más la clase que sigue). Entonces, la espira receptora detecta una señal que decae y es cosinusoidal (para un spin sólo): w = w o M xy w - w o > 0 M xy time time

FID En una muestra real tenemos cientos de sistemas de spin, todos con frecuencias diferentes de la de B 1 (o frequencia carrier). Como hemos usado un pulso y efectivamente excitado todas las frequencias al mismo tiempo, veremos una combinación de todas en la espira receptora y esto se llama Free Induction Decay (o FID): La FT de esta función nos da el espectro de RMN en frecuencias:

RMN de proteínas Guías prácticas: http://www.cryst.bbk.ac.uk/pps2/projects/schirra/html/home.htm http://www.protein-nmr.org.uk/ http://www.nmr2.buffalo.edu/resources/edu/matr/nmr2_2004.pdf Las proteínas grandes (> 150 residuos) dan peores resultados que las pequeñas, y generalmente NO se pueden asignar todos los picos. RMN > 750 MHz Los espectros son MUY complejos RMN 2D

RMN de proteínas Los espectros son MUY complejos Imposibles de interpretar!

RMN 2D Si los núcleos son iguales: Las señales fuera de la diagonal son las interesantes, por que son las de los protones (x ej) que si intercambiaron información durante el t1.

Si se miden protones en ambas dimensiones, igual siguen siendo complejos!

Actuales http://www.nmr2.buffalo.edu/resources/edu/matr/nmr2_2004.pdf

Comparación MS vs NMR en Metabolómica

Comparación MS vs NMR en Metabolómica Gran diferencia de espacio

Comparación MS vs NMR en Metabolómica

LF-NMR (bajo campo)

LF-NMR (bajo campo) Free Induction Decay (FID) (decaimiento libre de la inducción w = w o M xy time

Enlace interesante https://www2.chemistry.msu.edu/faculty/reusch/virttxtjml/spectrpy/nmr/nmr1.ht m