Consecutivamente el film es revelado en soluciones especiales para detectar o no, una reacción antígeno-anticuerpo, la cual es evidenciada como un punto negro (f). Fuente: Rojas, 2001 MATERIALES Y MÉTODOS Obtención de la Muestra Los ejemplares de sardina Monterey (Sardinops sagax caerulea) (50 kg) utilizados en esta investigación, fueron proporcionados por la empresa Productos Pesqueros de Guaymas S.A. La sardina, con aproximadamente 7 horas de haber sido capturada, se colectó directamente de la bodega del barco sardinero, donde se mantuvo a 8 C desde su captura. La muestra se colocó en abundante hielo y se transportó al Laboratorio de Investigación de la Academia de Tecnología de Alimentos de la Universidad de Sonora. Una vez en el laboratorio, la mitad del lote se evisceró en frío con cuidado de no afectar el tracto digestivo, ni otros órganos para evitar contaminaciones o pérdida de enzimas. Las vísceras obtenidas fueron colocadas en bolsas de polietileno con cierre hermético conteniendo aproximadamente 100 g cada una y se congelaron inmediatamente a -20 C hasta el momento de su utilización. Extracción y Purificación de Tripsina Preparación del Extracto Crudo de Ciegos Pilóricos 38
El extracto crudo de enzimas se preparó homogenizando 50 g de ciegos pilóricos con 250 ml de buffer de extracción (Tris/HCl 50 mm ph 8.0 + CaCl 2 10 mm + NaCl 0.15 M) durante 1 minuto, en intervalos de 15 segundos, para posteriormente centrifugar a 17,300 x g por 60 minutos. Después se separó la fase lipídica y se recuperó el sobrenadante que es donde se encuentran las enzimas digestivas (Martínez y Serra, 1989). Fraccionación con Sulfato de Amonio El extracto crudo de enzimas de los ciegos pilóricos se sometió a precipitación con sulfato de amonio, añadiendo éste de manera lenta y en frío hasta alcanzar el 70% de saturación en la solución; posteriormente se centrifugó a 17,300 x g por 60 minutos; se colectó el precipitado y se disolvió en aproximadamente 30 ml de buffer TRIS HCl 50 mm ph 7.5, NaCl 0.5 M (Janson y Rydén, 1998, Castillo-Yañez y col., 2005). Cromatografía de Filtración en Gel La solución que se obtuvo a partir del fraccionamiento con sulfato de amonio fue dialisada y se sometió a cromatografía de filtración en gel, utilizando como fase estacionaria Sephadex G-75, empacado en una columna de 1.6 x 70 cm. En esta cromatografía se separaron proteínas de peso molecular mayor a 60 kda, de las proteínas de menor peso molecular (entre 10 y ~ 60 kda), donde se encuentra la enzima de interés. Como fase móvil se utilizó el amortiguador Tris HCl 50 mm ph 7.5, NaCl 0.15 M, a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min, colectándose fracciones de 5 ml (Castillo-Yañez y col., 2005). A las fracciones obtenidas se les detectó proteína, midiendo directamente la absorbancia a 280 nm así como por el método de Bradford 39
(1976); también se evaluó actividad específica tipo tripsina, utilizando benzoilarginina-p-nitroanilida (BAPNA) como sustrato específico, siguiendo el método de Erlanger y col., 1961. Los patrones electroforéticos de las fracciones fueron analizados por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio al 12% (Laemmli, 1970). Cromatografía de Intercambio Iónico Las fracciones con actividad específica tipo tripsina, obtenidas de la cromatografía de filtración en gel, fueron dializadas y liofilizadas; posteriormente fueron sometidas a cromatografía de intercambio iónico, utilizándose como fase estacionaria una resina de intercambio aniónico tipo DEAE-Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). Las resinas se empacaron en columnas de 1.6 x 20 cm y la corrida se llevó a cabo utilizando como fase móvil el amortiguador Tris HCl 50 mm ph 7.5, utilizando una velocidad de flujo de 0.25 ml/min y colectando fracciones de 5 ml. Después de lavar la resina con 3 volúmenes de solución reguladora de equilibrio (Tris HCl 50 mm ph 7.5), se cambiaron las condiciones de la fase móvil para eluir las proteínas que se adsorbieron a la misma aplicando un gradiente lineal de concentración de NaCl de 0 a 0.4 M en el mismo amortiguador de equilibrio. La concentración de proteína, la actividad específica y la electroforesis de las fracciones obtenidas, se realizaron utilizando las mismas técnicas y condiciones que en las fracciones obtenidas en la cromatografía de filtración en gel (Castillo- Yáñez y col., 2005). Las fracciones con mayor concentración de tripsina se congelaron por 24 horas a -30 C para posteriormente liofilizarlas. Ya liofilizada la muestra se dializó y se rehidrató con PBS 1 X para preparar la emulsión antigénica con 40
adyuvante completo e incompleto de Freund s con el fin de inmunizar a los ratones con la tripsina purificada. Animales de Experimentación Se utilizaron ratones machos de la cepa singénica C3H/HeJ de 8 a 14 semanas de edad (The Jackson Laboratories, Maine, USA). Los animales se mantuvieron en el Bioterio del Departamento de Investigación y Posgrado en Alimentos de la Universidad de Sonora (DIPA). Los ratones contaron con fotoperíodos de 12 horas a 25º C y fueron alimentados ad libitum con una dieta comercial para ratones. Inmunización de Ratones Se inmunizaron 3 ratones C3H/HeJ con 100 µg de tripsina en adyuvante completo de Freund s (GIBCO); esta emulsión se agitó en vórtex por 30 minutos para después inmunizar a los modelos por vía intraperitoneal con 200 µl de la suspensión anterior. En las siguientes inmunizaciones se utilizó adyuvante incompleto de Freund s en la misma proporción que el adyuvante completo de Freund s. Los ratones se retaron con el inmunógeno cada 10 días durante 2 meses (Ontiveros, 2005). Recolección de Sueros de Ratones Inmunizados 41
Antes de cada inmunización se colectaron aproximadamente 500 µl de sangre de la cola de los ratones y el suero se obtuvo después de separar el coágulo, por centrifugación a 1,100 x g durante 5 minutos. Los sueros fueron congelados a - 30 C, hasta su utilización (Ontiveros, 2005). Estandarización de Metodologías Inmunoenzimáticas para Evaluar la Respuesta Inmune Humoral Inmunoensayo Absorbente Ligado a Enzimas (ELISA) De manera inicial, con el fin de detectar si los ratones generaron anticuerpos contra la tripsina, se llevó a cabo el método de ELISA indirecto; incubando 2 µg de de la enzima, en Na 2 CO 3 0.015 M y NaHCO 3 0.034 M, ph 9.6, en 50 µl, en una microplaca de poliestireno. La placa fue incubada con el antígeno durante toda la noche a 4 C y después fue bloqueada con PBS1X- Tween 0.025%, durante 1 H, a temperatura ambiente (TA). Posteriormente se aplicaron diluciones seriadas de los sueros de ratón (1:50-1:1,000), incubando durante 1 H, a T.A. Como segundo anticuerpo se utilizó el antisuero de cabra anti-igg de ratón acoplado a la peroxidasa, utilizando una dilución constante de 1:2,000. En todo el proceso, se utilizó como solución de lavado, PBS 1X-Tween (0.025%) y ABTS (ácido 2,2 -azino-6,3-dietilbenstiazolinsulfónico) como cromógeno. El desarrollo de color se midió a 415 nm en un lector de microplacas Benchmark de BioRad, U.S.A., después de 15 minutos de reacción. Como controles negativos se utilizaron los sueros obtenidos antes de la inmunización (pre-inmunización). 42
Para determinar la cantidad óptima de antígeno (tripsina), así como la dilución del suero murino, se repitió el ensayo anterior pero utilizando distintas cantidades de tripsina que varían de 0.0 a 2.5 µg/pozo. El suero se utilizó en diluciones seriadas (1:500, 1:1,000, 1:2,000 y 1:4,000). La titulación fue realizada en todos los casos utilizando el antisuero de cabra anti IgG de ratón (1:2,000), conjugado a peroxidasa de rábano. El ensayo se repitió solo 2 ocasiones por falta de antígeno. Ensayo de Manchas (Dot-Blot) Para establecer las condiciones óptimas para el ensayo de manchas (dilución del suero de los ratones), se inmovilizaron 1.6 µg de tripsina en membranas de nitrocelulosa (Trans Blot, Bio-Rad, U.S.A) durante 1 hora. Transcurrido ese tiempo, se llevaron a cabo 5 lavados de 5 minutos con PBS 1X- Tween al 0.025% y los sitios libres de antígeno fueron bloqueados con proteína de leche semidescremada en polvo (Svelty de Nestlé) al 10%, en PBS1X-albúmina de suero bovino al 1% en agitación suave durante 1 hora. Las membranas fueron incubadas durante 1 hora con los sueros murinos, en diluciones dobles seriadas (1:500 a 1:16,000). El segundo anticuerpo (antisuero de cabra anti-igg de ratón acoplado a la peroxidasa de rábano) se utilizó en una dilución constante de 1:10,000. Para revelar se utilizó como sustrato H 2 O 2 y luminol como agente cromógeno. Los resultados se evaluaron de manera cualitativa. Éste ensayo se repitió en 6 ocasiones. 43