T4 TOTAL. 01 Español - Ref.: 905. Ref.:905. Instrucciones de Uso
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- Montserrat Martín Vidal
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1 T4 TOTAL Instrucciones de Uso Ref.:905 Finalidad. Sistema para la determinación cuantitativa de la tiroxina total (T4 Total) en el suero y plasma. [Sólo para uso diagnóstico in vitro.] Introduccion. La tiroxina (T4) es una hormona sintetizada a partir de residuos de tirosina que están en la tiroglobulina (proteína producida y almacenada en la glándula tiroides). Bajo la acción de la hormona tirotrópica (TSH) la T4 se libera en circulación sanguínea donde se une a una proteína transportadora específica, la TBG (Thyroxin Binding Globulin) y en menor medida a la fracción albúmina. La mayor parte de la T4 está en su forma unida, en equilibrio con una pequeña fracción libre (T4 Libre). La T4 total de la sangre se representa, por lo tanto, por la suma de las concentraciones de T4 unida y libre. Principio. Inicialmente la T4 presente en la muestra se desplaza de sus proteínas de unión por la acción del ácido 8- anilino naftaleno sulfónico y compite con un análogo (T4 biotinilado) por un número limitado de anticuerpos de conejo anti-t4. Los complejos anticuerpo-t4 y anticuerpo-t4 biotinilado son capturados por anticuerpos anti-igg de conejo que están inmovilizados en la superficie de los Inmunotubos. Después del lavado se suma al medio el conjugado de estreptavidina-peroxidase que forma un complejo cuaternario. Después de la eliminación de los reactivos en exceso, la reacción quimioluminiscente se desencadena mediante la adición de peróxido y luminol. La cantidad de luz emitida, medida en unidades relativas de luz (RLU), es inversamente proporcional a la concentración de T4 Total presente en la muestra, cuyo valor se obtiene a través de una curva de calibración. Características del sistema. La T4 total - Labtest es un sistema semiautomático desarrollado con un enfoque innovador que permite el uso de los sustratos quimioluminiscentes luminol y peróxido en cinética rápida, con obtención de la señal quimioluminiscente en unos pocos segundos. Los niveles de sensibilidad son equivalentes a los de otros sustratos quimioluminiscentes que emplean fosfatasa alcalina como enzima. Los estudios realizados demuestran que el ensayo no sufre interferencia significativa causada por altas concentraciones de hemoglobina, bilirrubina y de triglicéridos. Metodología. Quimioluminiscencia. Reactivos 1. - T4 Biotinilado. Almacenar entre 2-8 º C. Listo para su uso. Contiene T4 biotinilado en tapón 100 mmol/l ph 7,4; conservante; tensoactivo y estabilizantes. 2. ANTI T4 - Anti-T4. Almacenar entre 2-8 º C. Listo para su uso. Contiene anticuerpo policlonal de conejo anti-t4 en tapón 100 mmol/l ph 7,4; conservante; tensoactivo y estabilizantes. 3. DIL REA - Diluyente de Reacción. Almacenar entre 2-8 º C. Listo para su uso. Contiene tapón 100 mmol/l ph 7,4; conservante; tensoactivo y estabilizantes. 4.-Conjugado Concentrado 50X. Almacenar entre 2-8 º C. Contiene estreptavidina-peroxidasa, conservante, tensoactivo y estabilizantes. Consultar apartado Procedimiento - Preparación de reactivos. 5.-Diluyente del Conjugado. Almacenar entre 2-8 º C. Listo para su uso. Contiene tapón 100 mmol/l ph 7,4; conservante, tensoactivo y estabilizantes. 6.-Calibrador Low (Bajo). Almacenar entre 2-8 º C. Preparación liofilizada de T4 en matriz de suero humano; conservante y estabilizantes. Consultar apartado Procedimiento - Preparación de reactivos. La concentración de T4 está señalada en la etiqueta del frasco. Después de la reconstitución, el calibrador es estable por 15 días cuando es almacenado entre 2-8 º C, bien cerrado y protegido de la luz, y por 90 días cuando es almacenado a -15 º C, bien cerrado y protegido de la luz. Consultar apartado PRECAUCIONES Y CUIDADOS ESPECIALES, antes de manipular los calibradores. La concentración de ese calibrador, que figura en el rótulo del producto, deberá ser inserida en el protocolo del test. 7.-Calibrador High (Alto). Almacenar entre 2-8 º C. Preparación liofilizada de T4 en matriz de suero humano; conservante y estabilizantes. Consultar apartado Procedimiento - Preparación de reactivos. La concentración de T4 está señalada en la etiqueta del frasco. Después de la reconstitución, el calibrador es estable por 15 días cuando es almacenado entre 2-8 º C, bien cerrado y protegido de la luz, y por 90 días cuando es almacenado a -15 º C, bien cerrado y protegido de la luz. Consultar apartado PRECAUCIONES Y CUIDADOS ESPECIALES antes de manipular los calibradores. La concentración de ese calibrador, que figura en el rótulo del producto, deberá ser inserida en el protocolo del test Inmunotubos. Almacenar entre 2-8 º C. Listo para su uso. Tubos de poliestireno sensibilizados con anticuerpos policlonales anti-igg de conejo. Los envases de plástico que contienen los tubos deben abrirse sólo cuando están en equilibrio con la temperatura del ambiente (temperatura inferior a 30 º C) donde se hará la prueba, para evitar la condensación de vapor de agua en los tubos. El incumplimiento de esta orientación resultará en la disminución de la estabilidad del reactivo. Después de abrir los envases, los tubos son estables durante 6 meses cuando se almacenan entre 2-8 º C y con el desecante en el envase de plástico bien cerrado. 01 Español - Ref.: 905
2 Los reactivos sin abrir, cuando se almacenan bajo las condiciones establecidas, son estables hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta. Después de abiertos, los reactivos deben ser manejados de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio para evitar contaminaciones químicas y microbianas que pueden causar reducción de la estabilidad. Precauciones y cuidados especiales Los calibradores son preparados a partir de derivados de sangre humana y fueron testados para la presencia de HBsAg, anticuerpos anti-hcv y anti-hiv presentando resultados negativos. Se utilizaron pruebas validadas y aprobadas, pero ellas no pueden asegurar que productos derivados de sangre humana no tengan agentes infecciosos. Por lo tanto, se deben aplicar los cuidados habituales de seguridad en el manejo de los productos (no se deben pipetearlos con la boca). Se recomienda manejarlos como potencialmente infecciosos. No mezclar reactivos de lotes distintos y no utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad. No permitir la contaminación cruzada entre los componentes. Utilizar sólo puntas desechables para pipetear cada muestra y cada reactivo. La limpieza y el secado adecuados del material utilizado son factores fundamentales para la estabilidad de los reactivos y obtención de resultados correctos. Residuos de jabón, detergentes o agentes oxidantes en los recipientes utilizados para la preparación del Conjugado de uso pueden interferir en la reacción. Utilizar preferiblemente material de plástico desechable. Si utilizar envases de vidrio, se recomienda lavarlos con ácido sulfúrico o ácido clorhídrico 0,5 mol/l, enjuagar exhaustivamente con agua destilada o desionizada y secar antes de usarlos. Los envases de plástico que contienen los inmunotubos deben abrirse sólo cuando están en equilibrio con la temperatura ambiente (temperatura inferior a 30 º C), donde se hará la prueba, para evitar la condensación de vapor de agua en los tubos. El incumplimiento de esta orientación resultará en la disminución de la estabilidad del reactivo. Después de abrir los envases, los tubos son estables durante 6 meses cuando se almacenan con el desecante en el envase de plástico bien cerrado. Los inmunotubos deben ser desechados después de su uso. No reutilizar para otros fines. Para la eliminación de los reactivos y del material biológico, se aconseja aplicar las normas locales, provinciales o federales de protección ambiental. Material necesario ( no está incluído) 1. Micropipetas y puntas desechables. 2. Baño María (37 1 º C). 3. Recipiente para preparar las diluciones. 4. Cronómetro. 5. Solución de Lavado Concentrada (Ref. 908). 6. Soluciones Reveladoras (Ref. 909). 7. Estantería para tubos 12 x 75 mm con sistema de fijación. 8. Microordenador. 9. Luminómetro Lumiquest o instrumento similar equipado con dos inyectores y capacidad para acomodar tubos 12 x 75 mm. 10. Solución Desinfec tante (Ref. 604). Muestra 1 Utilizar suero o plasma (EDTA, Heparina, Citrato). Cuando se obtiene la sangre en el anticoagulante citrato, hacer corrección por la dilución causada en la muestra. El analito es estable durante 7 días entre 2-8 º C y por hasta 30 días en temperatura inferior a 15 º C negativos cuando se almacena en recipiente apropiado para la congelación. Asegurarse de que las muestras estén descongeladas y homogeneizadas antes de su uso. Se deben eliminar las partículas en suspensión a través de la centrifugación. No usar las muestras con signos de contaminación o muestras congeladas y descongeladas más de una vez. Debe crearse un Procedimiento Operativo Estándar (POE) para recolección, preparación y almacenamiento de la muestra. Enfatizamos que los errores debidos a la muestra pueden ser mucho más grandes que los errores que se ocurrieron en el procedimiento analítico. Como ninguna prueba conocida puede garantizar que muestras de sangre no transmiten infecciones, todos ellas deben considerarse como potencialmente infecciosas. Por lo tanto, para su manejo, se deben seguir las normas de bioseguridad. Interferencias Concentraciones de hemoglobina hasta 1000 mg/dl, bilirrubina hasta 30 mg/dl y triglicérido hasta 1000 mg/dl no producen interferencias significativas. Procedimiento Cuidados especiales. Los empaques de plástico que contienen los inmunotubos deben abrirse sólo en equilibrio con la temperatura ambiente (temperatura inferior a 30 º C) donde se hará la prueba, para evitar la condensación de vapor de agua en los tubos. El incumplimiento de esta orientación resultará en la disminución de la estabilidad del reactivo. Los reactivos líquidos deben homogeneizarse suavemente antes de su uso. Preparación de los reactivos Conjugado de uso. Para preparar el Conjugado de Uso es necesario pipetear todo el contenido del frasco de Conjugado Concentrado ytransferir para el frasco que contiene el Diluyente del Conjugadoyhomogeneizar. Si es necesario, centrifugar el material para asegurar que todo el contenido del frasco Conjugado Concentrado estea en la parte inferior del tubo. Después de transferir la totalidad del volumen, enjuagar el frasco de Conjugado Concentrado con parte de la mezcla del Conjugado Concentrado y Diluyente del Conjugado. Homogeneizar suavemente por inversión. Una vez preparado, el Conjugado de Uso es estable durante 4 meses cuando se almacena entre 2 y 8ºC. Identificar el frasco y anotar la fecha de caducidad. 02 Español - Ref.: 905
3 Si es necesario, se puede preparar volúmenes más pequeños del Conjugado de Uso y transferir 1 (un) volumen del Conjugado Concentrado y 50 volúmenes del Diluyente del Conjugado para un frasco limpio y seco. Una vez preparado, el Conjugado de Uso es estable durante 4 meses cuando se almacena entre 2-8 º C. Identificar el frasco y anotar la fecha de caducidad. Para mantener su desempeño, el Conjugado de Uso debe permanecer fuera de la nevera sólo el tiempo necesario para su uso. Reconstitución de los calibradores. Consultar el apartado 1 - Observaciones. Quitar el precinto de aluminio y retirar con cuidado la tapa de goma. Sumar al frasco del calibrador el volumen de agua calidad reactivo con una pipeta volumétrica, tal como se indica en la etiqueta. Vuelva a colocar la tapa de goma, dejar reposar durante 15 minutos y homogeneizar suavemente por inversión. Antes de usar, homogeneizar suavemente y retirar la cantidad necesaria para su uso. Tapar inmediatamente y almacenar entre 2-8 º C. Después de la reconstitución, los calibradores son estables durante 15 días, si se almacena entre 2-8 ºC. Para su uso posterior, separar el calibrador en alícuotas inmediatamente después de la reconstitución y almacenar en temperatura inferior a 15 º C negativos por hasta 90 días en recipiente herméticamente cerrado, protegido de la luz. Para evitar la evaporación del material durante el período de almacenamiento es esencial utilizar frascos adecuados para congelación (criotubos). Las alícuotas del calibrador deben descongelarse sólo una vez. Los calibradores deben ser manejados de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio para evitar la contaminación de naturaleza química y microbiana que puede causar reducción de la estabilidad. Calibración. La calibración del sistema se realiza mediante el uso de una Master Curve de 6 puntos (concentración de los calibradores y sus respectivas RLUs) y ajustada cuando sea necesario, utilizando los dos calibradores de ayuste (Calibrador Low - ( Bajo) Ref e Calibrador High - ( Alto) Ref ). La Master Curve es suministrada en un documento adjunto juntamente con el producto T4 Total y es específica para cada lote de reactivos. Al inserir los datos de la Master Curve durante la creación del protocolo del test, inserir también las concentraciones de los calibradores de ayuste que figuran en el rótulo de los productos (Calibrador Low - ( Bajo) Ref e Calibrador High - ( Alto) Ref ). Cuando se utiliza un lote de producto por primera vez, deben insertarse los datos de la Master Curve en el programa del luminómetro y luego debe hacer un ajuste en la curva de calibración, ensayando en duplicado los dos calibradores proporcionados en el kit (Calibrador Low - ( Baj o) Ref e Calibrador High - ( Alto) Ref ). Para configurar la programación del aparato e introducir correctamente los datos de la Master Curve, consultar el manual del equipo. Cuando los reactivos se mantienen en las condiciones indicadas, la calibración permanece estable durante 15 días. La calibración del sistema se ajusta en las condiciones a continuación: 1. Cuando se utiliza un lote de producto por primera vez; 2. A cada nueva preparación del Conjugado de Uso; 3. A cada cambio de lote de las Soluciones Reveladoras (Ref. 909). 4. Cuando el control de calidad indicar. Procedimiento de prueba Importante 1. Los parámetros de lectura de las pruebas, así como los datos de la Master curve deben insertarse en el luminómetro antes de hacer las pruebas. Consultar apartado "Calibración" y el manual del equipo para obtener más informaciones. 2. No utilice en el ensayo una cantidad mayor que 20 inmunotubos a la vez. 1. Separar el número de inmunotubos necesarios a las pruebas, calibradores y controles, identificarlos y posicionarlos en la estantería para inmunotubos. 2. Sumar 0,02 ml de muestra, calibradores y controles en la parte inferior de cada tubo. 3. Sumar 0,10 ml de T4 Biotinilado en la parte inferior de cada tubo. 4. Sumar 0,10 ml de Anti-T4 ANTI T4 en la parte inferior de cada tubo. Homogeneizar. 5. Incubar 30 minutos en baño María a 37 º C. 6. Retirar los tubos del baño María. 7. Sumar 1,0 ml de Solución de Lavado Concentrada (Ref. 908) lista para uso. 8. Descartar el contenido de los tubos por inversión y, con la estantería todavía invertida, retirar el exceso de líquido, apoyando el borde superior de los tubos sobre una superficie absorbente (2-3 capas de toallas de papel). 9. Sumar 0,10 ml de Diluyente de Reacción DIL REA en la parte inferior de cada tubo. 10. Sumar 0,10 ml de Conjugado de Uso directamente al contenido de cada tubo. Homogeneizar. 11. Incubar 30 minutos en baño María a 37 º C. 12. Retirar los tubos del baño María. 13. Repetir por seis veces consecutivas los pasos 7 e Español - Ref.: 905
4 14. Para obtener los resultados, proceder de la siguiente manera: 1. Realizar el prime del luminómetro (consultar las instrucciones de uso del producto Soluciones de Reveladoras - Ref. 909 y el manual de operación del luminómetro); 2. Seleccionar el protocolo de la prueba que tiene los datos de la Master Curve; 3. Realizar la medición de los calibradores de ajuste, muestras y controles. Intervalo operativo. El intervalo operativo de la prueba es de 1,0 g/dl hasta 20 g/dl. El límite del intervalo se define de acuerdo a la concentración del último calibrador de la curva de calibración. Las muestras con resultados más bajos que el límite de la sensibilidad analítica deben reportarse como <1,0 g/dl. Las muestras con concentraciones superiores a 20 g/dl pueden diluirse con solución salina 0,85%. Después de la dilución, multiplicar el valor obtenido por el factor de dilución utilizado. Control interno de calidad. El laboratorio debe mantener un programa de control interno de calidad que define claramente los reglamentos aplicables, objetivos, procedimientos, normas, criterios para especificaciones de la calidad y límites de tolerancia, acciones correctivas y registro de las actividades. El uso de los controles en todos los conjuntos de pruebas es esencial para controlar la imprecisión de la medición y desviaciones de la calibración. Comparación de métodos. El método que se propone fue comparado con producto disponible en el mercado, que utiliza metodología similar y se obtuvo los resultados a continuación: Número de muestras Intervalo de concentraciones ( g/dl) Media de las estimaciones ( g/dl) Ecuación de regresión Coeficiente de correlación Método Comparativo Usando la ecuación de regresión, el error sistemático (sesgo) estimado fue igual a 1,0% para una muestra igual 4 g/dl, 1,0% para una muestra igual 7,5 g/dl y 1,0% para una muestra igual 15 g/dl, error 4 considerado aceptable y que no representa desviaciones de resultados entre la metodología comparativa. Estudios de precisión. Los estudios de precisión se realizaron utilizándose muestras nativas en tres niveles distintos: 45 0,70-18, 9,14 Método Labtest 45 1,07-18,91 9,19 Método Labtest = 1,0093 x Método Comparativo + 0,0287 0,988 Se sugiere utilizar las preparaciones de la Línea Qualitrol Q de Labtest (Ref. 907) para control interno de la calidad en ensayos de quimioluminiscencia. Intervalo de referencia 2. Se debe utilizar el intervalo solo para orientarse. Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio intervalo de referencia en la población atendida. Repetitividad - Imprecisión intra-ensayo Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 N Media ( g/dl) 4,03 6,88 13,34 DE 0,19 0,29 0,67 CV (%) 5,62 4,61 3,97, Edad recién nacido hasta 3 días 1 a 2 semanas 1 a 4 meses 4 a 12 meses 1 a 5 años 5 a 10 años 10 a 15 años 15 a 60 años >60 años Características de desempeño 3 T4 Total ( g/dl) 11,8-22,6 9,8-16,6 7,2-14,4 7,8-16,5 7,3-15,0 6,4-13,3 5,6-11,7 4,6-11,0 5,0-10,7 Efectos de la dilución de la matriz. Se utilizó una muestra con un valor igual a 19 g/dl para evaluar la respuesta del sistema en diluciones de la matriz con NaCl 150 mmol/l (0,85%). Utilizando factores de dilución que van de 2 a 32 se encontró recuperación media de 8%. Reproducibilidad - Imprecisión total Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 N Media ( g/dl) 4,03 6,88 13,34 Sensibilidad metodológica o analítica. Límite de detección: 1,0 g/dl. Representa la concentración más baja de T4 Total que se puede distinguir de cero. Equivale a la concentración de T4 Total situada dos desviaciones estándares encima del calibrador 1 (0 g/dl). Significado clínico 5. La T4 incorporada a las proteínas transportadoras representa un depósito de T4 necesario para mantener constante la concentración plasmática de la hormona libre (T4 Libre). La estimulación de la producción de T4 se hace por la hormona tirotrópica (TSH). La integración bioquímica de la hipófisis anterior, productora de TSH y la tiroides, glándula de destino, se hace a través de la Hormona liberadora de tirotropina, la TRH ( Thyrotropin Releasing Hormone), que actúa directamente sobre la hipófisis y estimula la producción de TSH. DE 0,20 0,30 0,64 CV (%) 7,09 6,19 6,69 04 Español - Ref.: 905
5 Así, altos niveles de T4 inhiben la producción hipotalámica de TRH, reduciendo de esta manera el estímulo para la producción de TSH hipofisaria. Por otro lado, la reducción de los niveles plasmáticos de T4 resulta en una elevación de la producción de TSH a través de la disminución del control del hipotálamo. La comprensión de los mecanismos básicos mencionados anteriormente lleva directamente a las interpretaciones clínicas de los hallazgos de laboratorio encontradas en las diversas patologías. Por lo tanto, en el hipotiroidismo primario, resultante de acometimiento de la glándula tiroides, los niveles de T4 (y también de T3) se encuentran reducidos. En el hipotiroidismo discreto o en su fase inicial, se puede encontrar la T4 en el intervalo de referencia, a pesar de que los niveles de TSH pueden estar altos. En el hipotiroidismo secundario, el defecto metabólico está en el nivel central y ocurre debido a un disturbio en el eje hipotalámico-hipofisario, resultante de lesiones en el hipotálamo, en la hipófisis o en ambos. En este caso, los niveles de T4 se reducen. En el hipertiroidismo primario, como lo que ocurre en la Enfermedad de Graves-Basedow, nódulos tiroideos o adenoma tiroideo, los niveles de T4 en la mayoría de los casos estarán altos. Observaciones 1. El laboratorio clínico tiene como objetivo proveer resultados exactos y precisos. La utilización de agua de calidad inadecuada es una causa potencial de errores analíticos. El agua utilizada en el laboratorio debe tener la calidad adecuada para cada aplicación. Así, para preparar reactivos, usar en las mediciones y para su uso en enjague final de la vidrería, el agua debe tener resistividad 1 megaohm.cm o conductividad 1 microsiemens/cm y concentración de silicatos <0,1 mg/l. Cuando la coluna desionizadora está con su capacidad saturada, ocurre liberación de vários iones, silicatos y sustâncias con gran capacidad de oxidación o reducción que deterioran los reactivos en pocos días o incluso horas, alterando los resultados de modo imprevisible. Por lo cual es fundamental estabelecer un programa de control de la calidad del agua. 4. RiliBÄK (Richtlinien der Bundesärztekammer), publicado en 2009 en el site del CLIA ( (acceso en 07/2012). 5. Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE: Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics, 4.ed. St. Louis: Sauders/Elsevier, p Presentación Producto T4 Total Referencia Informaciones al consumidor [Términos y Condiciones de Garantía] Labtest Diagnóstica garantiza el desempeño de este producto, dentro de las especificaciones, hasta la fecha de expiración indicada en los rótulos, siempre que los cuidados de utilización y almacenamiento indicados en los rótulos y en estas instrucciones, sean seguidos correctamente. Labtest Diagnóstica S.A. CNPJ: / Av. Paulo Ferreira da Costa, Vista Alegre - CEP Lagoa Santa. Minas Gerais Brasil - Servicio de Apoyo al Consumidor Contenido 1 X 5 ml ANTI T4 1 X 5 ml DIL REA 1 X 5 ml 1 X 0,1 ml 1 X 5 ml 1 X 1,0 ml 1 X 1,0 ml 2 X 25 un sac@labtest.com.br Referencias 1. ArupLaboratories: National Reference Laboratory. Disponible en: < acceso en 07/ Tietz NW: Clinical Guide to Laboratory Tests, 3.ed. Philadelphia: Saunders Company, p Labtest: Datos de Archivo. Edición: Enero, 2013 Ref.: Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reproducción bajo previa autorización 05 Español - Ref.: 905
6 06 Español - Ref.: 905
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