2. Reactivo Almacenar entre 2-8ºC. 3. Estándar - - Almacenar entre 2-8ºC.

Transcripción

1 GAMMA GT Liquiform Instrucciones de Uso Ref.:105 Finalidad. Sistema para la determinación cuantitativa de la actividad de la -glutamil transferasa (Gamma GT) en suero o plasma (EDTA) por fotometría en modo cinético. Uso professional. [Solamente para uso diagnóstico in vitro.] Principio. La Gamma GT cataliza la transferencia del grupo glutamil de la L- -glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida a glicilglicina, formando L- -glutamilglicilglicina y p-nitroanilina, de acuerdo a la siguiente reacción: L- -glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida + Glicilglicina L- -glutamilglicilglicina + p-nitroanilina. Gamma GT La cantidad formada de p-nitroanilina, que presenta elevada absorbancia a 405 nm, es directamente proporcional a la actividad de la Gamma GT en la muestra. Características del sistema. Labtest desarrolló el sistema Gamma GT Liquiform sobre la base del principio del método de Szasz modificado, que propicia un procedimiento para la determinación de la Gamma GT cuyo desempeño es sustancialmente equivalente al método de referencia propuesto por la International Federation of Clinical 1, Chemistry and Laboratory Medicine (IFFC). Los componentes de la reacción se encuentran distribuidos adecuadamene en dos reactivos para otorgar mayor estabilidad a la forma líquida original y mantener las condiciones óptimas de la reacción, permitiendo la utilización directa de los reactivos (sistema bi-reactivo) en analizadores automáticos. Alternativamente, se puede preparar un Reactivo de Trabajo que presenta elevada estabilidad (1 días entre -8ºC), permitiendo su utilización aun en situaciones de baja demanda del ensayo. El sistema permite preparar el volumen de Reactivo de Trabajo necesario para una única medición de la actividad de la Gamma GT. Gamma GT Liquiform posee respuesta lineal hasta las 700 U/L, equivalente a 15 veces el valor superior de referencia, reduciendo significativamente las necesidades de diluciones y repeticiones de las mediciones en muestras con actividades elevadas. Los estudios realizados demuestran que la reacción no sufre interferencias significativas provocadas por valores elevados de bilirrubina, hemoglobina y triglicéridos. Las mediciones pueden ser realizadas por cinética de tiempo fijo, en analizadores semi-automáticos, utilizando el Estándar de p-nitroanilina (Ref.: 105.3). También, las mediciones pueden realizarse de modo cinético continuo, tanto en analizadores automáticos como en semiautomáticos. Para ello, Labtest dispone de la línea Calibra con actividad de Gamma GT trazable al material de referencia ERM -AD45/IFCC del Institute for Reference Materials and Measurements y al método de referencia de la IFCC. Metodologia. Szasz modificada. Reactivos 1. Reactivo Almacenar entre -8ºC. Contiene glicilglicina 197 mmol/l y azida sódica 0,095%.. Reactivo - - Almacenar entre -8ºC. Contiene L- -glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida 1 mmol/l y azida sódica 0,095%. 3. Estándar - - Almacenar entre -8ºC. Contiene p-nitroanilina 500 mol/l y azida sódica 0,095%. No contiene gamma glutamil transferasa. El Estándar se emplea solamente en el método cinético de tiempo fijo, descripto en estas instrucciones de uso, y la cantidad de p-nitroanilina equivale a una actividad de Gamma GT de 15 U/L. Los reactivos no abiertos, almacenados en las condiciones indicadas, son estables hasta la fecha de expiración impresa en el rótulo. Después de abiertos, los reactivos deben ser manipulados de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio para evitar contaminaciones de naturaleza química y microbiana que pueden provocar reducción de su estabilidad. Precauciones y cuidados especiales No utilizar el Reactivo de Trabajo cuando su absorbancia, medida contra agua a 405 nm fuera 1,5 o cuando se encuentre turbio o con señales de contaminación. En los analizadores automáticos, los reactivos están sujetos a contaminaciones con otros reactivos o con el aire ambiente, que dependen de la característica del equipamiento y de las condiciones de trabajo. Estas contaminaciones pueden provocar una reducción de la estabilidad y modificaciones de la calibración. Como ocurre con toda medición de actividad enzimática, la rigurosa observación del tiempo y de la temperatura de incubación es de gran importancia para la calidad de los resultados obtenidos. Los cuidados habituales de seguridad deben ser aplicados en la manipulación de los reactivos. Los reactivos contienen azida sódica que es tóxica. No ingerir y, en caso de contacto con los ojos, lavar inmediatamente con gran cantidad de agua y procurar auxilio médico. La azida puede formar compuestos altamente explosivos con las tuberías de plomo y cobre. Por lo tanto, utilizar grandes volúmenes de agua para descartar los reactivos. 01 Español - Ref.: 105

2 Material necesario y no provisto 1. Pipetas para medir muestras y reactivos.. Cronómetro. Para el método cinético continuo 1. Fotómetro con cubeta termostatizada capaz de medir con exactitud absorbancias a 400 y 40 nm. Para el método cinético de tiempo fijo 1. Baño-maría mantenido a temperatura constante (37ºC).. Solución de ácido ácético al 5% (v/v). 3. Fotómetro capaz de medir con exactitud absorbancias entre 400 y 40 nm. Influencias pre-analíticas. La actividad de la Gamma GT es más baja en las mujeres que en los hombres de la misma edad. La actividad enzimática puede ser hasta un 5% menor en las fases iniciales del embarazo. La actividad enzimática se encuentra elevada en individuos obesos y en fumadores. Por otra parte, la realización de ejercicios físicos regulares lleva a la disminución de la actividad enzimática. La ingestión de bebidas alcohólicas puede elevar la actividad de la Gamma GT en el suero por 4 a 48 horas dependiendo del consumo. El alcoholismo crónico también provoca un aumento de la actividad de la enzima. Valores elevados de Gamma GT fueron observados en muestras de pacientes que utilizan drogas anti-convulsivantes. Por razones todavía no debidamente aclaradas, los pacientes diabéticos presentan actividad de Gamma GT elevada. Se debe crear un Procedimiento Operativo Estándar (POE) que establezca procedimientos adecuados para la toma, preparación y almacenamiento de la muestra. Destacamos que los errores debidos a la muestra pueden ser mucho mayores que los errores ocurridos durante el procedimiento analítico. Usar suero o plasma (EDTA). La actividad enzimática es estable 7 días 3 entre -8ºC y dos meses a 0ºC negativos. Como ningún test conocido puede asegurar que muestras de sangre no transmitan infecciones, todas ellas deben ser consideradas como potencialmente infectivas. Por lo tanto, al manipularlas, se deben seguir las normas establecidas para bioseguridad. Para descartar los reactivos y el material biológico, sugerimos aplicar las normas locales, estatales o federales de protección ambiental. Interferencias Anticoagulantes conteniendo citrato, fluoruro u oxalato inhiben la actividad de la Gamma GT. La heparina como anticoagulante no interfiere en la actividad de la enzima, en tanto que las muestras de pacientes tratados con heparina pueden presentar aumento de la actividad de la Gamma GT. Concentraciones de bilirrubina de hasta 38 mg/dl, hemoglobina hasta 180 mg/dl y triglicéridos hasta 1000 mg/dl no producen interferencias significativas. Para evaluar la concentración aproximada de la hemoglobina en una muestra hemolisada se puede proceder del siguiente modo: diluir 0,05 ml de la muestra en,0 ml de NaCl 150 mmol/l (0,85%) y medir la absorbancia a 405 o 415 nm ajustando el cero con agua desionizada o destilada. Hemoglobina (mg/dl) Absorbancia405 x 601 Hemoglobina (mg/dl) Absorbancia x Preparación del reactivo de trabajo. El conjunto de un frasco de Reactivo 1 y un frasco de Reactivo permite preparar el Reactivo de Trabajo. Transferir el contenido de un frasco del Reactivo a un frasco de Reactivo 1 y homogeneizar por inversión. Anotar la fecha de expiración. El Reactivo de Trabajo es estable 1 día entre 15-5ºC y 1 días entre -8ºC cuando no hubiera contaminación química o microbiana. Identificar el frasco de Reactivo de Trabajo para evitar confusión con otros frascos de Reactivo 1. Para preservar el desempeño, el reactivo debe permanecer fuera de la temperatura de almacenamiento solamente el tiempo necesario para obtener el volumen a utilizar. Evitar la exposición a la luz solar directa. Opcionalmente, se puede preparar menor volumen de Reactivo de Trabajo utilizando la proporción cuatro volúmenes de Reactivo 1 y un volumen de Reactivo. El Reactivo de Trabajo contiene L- -glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida 4, mmol/l, glicilglicina 157,6 mmol/l y azida sódica 0,095%. Procedimiento Método cinético continuo. Ver los ítems Linealidad, Calibración y Observaciones 1, y 3. Es una práctica habitual calcular los resultados de la actividad enzimática utilizando un factor obtenido en condiciones óptimas de reacción que incluyen: Longitud de onda: 405 nm. Cubeta termostatizada a 37 0,ºC de 1,0 cm de paso de luz. Ancho de banda nm. Luz espúria 0,1%. Como la mayoría de las veces no es posible trabajar bajo estas condiciones, las buenas prácticas de laboratorio recomiendan realizar la calibración del ensayo utilizando el calibrador de enzimas indicado por el fabricante del reactivo. Labtest recomienda la línea Calibra para la calibración del sistema Gamma GT Liquiform. 1. En un tubo rotulado Prueba o Calibrador, pipetear 1,0 ml del Reactivo de Trabajo.. Adicionar 0,05 ml de muestra o calibrador de enzimas, homogeneizar y transferir inmediatamente a la cubeta termostatizada a 37 0,ºC. Esperar 1 minuto. 0 Español - Ref.: 105

3 3. Hacer la lectura de la absorbancia inicial (A 1) a 405 nm ( nm), disparando simultáneamente el cronómetro. Repetir la lectura después de minutos (A ). Para verificar la linealidad de la reacción, hacer también una lectura a intervalos de 1 minuto y verificar si la diferencia de absorbancias se mantiene constante. Cálculos A o Calibrador = (A - A ) / 1 Factor = Actividad del Calibrador A Calibrador Gamma GT (U/L) = A Prueba x Factor Ejemplo Prueba A = 0,87 A = 0, ,944-0,87 A Prueba = = 0,036 Reactivo de Trabajo Incubar a 37 ºC durante minutos. Sin sacar los tubos del baño, adicionar: Homogeneizar y mantener a 37 ºC, exactamente 10 minutos (cronometrados). Adicionar: Ácido Acético 5% Homogeneizar y adicionar: Blanco ,05 ml 1,0 ml 1,0 ml 0,05 ml Homogeneizar y determinar la absorbancia de la muestra a 405 nm ( nm) ajustando el cero con el blanco. El color es estable 60 minutos. Calibración. Medir la absorbancia del Estándar por triplicado. Para que el factor pueda ser considerado adecuado, la diferencia entre las absorbancias no debe ser mayor al %. Calibrador A = 0,85 A = 0, ,904-0,85 A Calibrador = = 0,06 Água destilada Estándar Ácido Acético 5% Blanco ,0 ml Estándar 0,05 ml 1,0 ml Actividad del Calibrador (U/L): Factor: = = 577 0,06 Actividad de la Gamma GT (U/L) = 0,036 x 577 = 93 Cuando se consiguen las condiciones óptimas de reacción citadas anteriormente se puede optar por no utilizar el calibrador de enzimas y aplicar el factor 550. Este factor fue obtenido en condiciones experimentales del sistema de medición utilizando una serie continua de comparaciones (trazabilidad) con el método de referencia de la IFCC. Alternativamente, se puede, también, realizar la medición utilizando el método cinético de tiempo fijo. Método cinético de tiempo fijo. Ver ítems Linealidad, Calibración y Observaciones 1, y 3. Este método requiere la utilización de solución acuosa de ácido acético al 5% (v/v). En un tubo de ensayo adicionar 0,8 ml de Reactivo 1 y 0, ml de Reactivo. Mezclar y transferir del Reactivo de Trabajo a otro tubo de ensayo. Rotular los tubos como blanco y muestra. Homogeneizar y determinar las absorbancias de los replicados del Estándar a 405 nm ( nm) ajustando el cero con el blanco. El color es estable 60 minutos. Cálculos. Valor del estándar en U/L = 15 Absorbancia de la Prueba Gamma GT (U/L) = x 15 Absorbancia del Estándar Ejemplo Absorbancia de la Prueba = 0,076 Absorbancia del Estándar = 0,156 0,076 Gamma GT (U/L) = x 15 = 61 0,156 Debido a la gran reproducibilidad que puede ser obtenida con la metodología, es posible utilizar el método del factor. Factor de calibración = 15 Absorbancia del Estándar Gamma GT (U/L) = Absorbancia de la Prueba x Factor 03 Español - Ref.: 105

4 Ejemplo 15 Factor = = 801 0,156 Gamma GT (U/L) = 0,076 x 801 = 61 El procedimiento sugerido para la medición es adecuado para fotómetros cuyo volumen mínimo de solución para la lectura es igual o mayor a 1,0 ml cuando se utiliza el método cinético continuo, o 1,5 ml en el caso del método cinético de tiempo fijo. Se debe hacer una verificación de la necesidad de ajuste del volumen de acuerdo al fotómetro utilizado. Los volúmenes de muestra y reactivo pueden ser modificados proporcionalmente sin perjuicio del desempeño del ensayo y el procedimiento de cálculo se mantiene inalterado. En caso de reducción de los volúmenes, es fundamental que se observe el volumen mínimo necesario para la lectura fotométrica. Volúmenes de muestra menores a 0,010 ml son críticos en aplicaciones manuales y deben ser usados con cautela porque aumentan la imprecisión de la medición. Calibración Calibraciones manuales Método Cinético Continuo Usar calibradores de la línea Calibra - Labtest. La actividad de la Gamma GT de los calibradores de la línea Calibra es trazable al material de referencia ERM-AD45/IFCC y al método de referencia de la IFCC. Intervalo de calibraciones Calibración en ó 3 puntos al cambiar de lote; Calibración en ó 3 puntos cuando el control interno de calidad lo indique. Método cinético de tiempo fijo Usar el Estándar Ref.: El valor atribuido al Estándar es trazable al material de referencia ERM-AD45/IFCC y al método de referencia de la IFCC. Calcular el factor de calibración al usar un nuevo lote de reactivos o cuando el control interno de calidad lo indique. Sistemas automáticos Blanco de reactivos: agua desionizada o solución de cloruro de sodio 150 mmol/l (0,85%); Usar calibradores de la línea Calibra - Labtest. La actividad de la Gamma GT en los calibradores de la línea es trazable al material de referencia ERM-AD45/IFCC y al método de referencia de la IFCC. Intervalo de calibraciones Calibración en ó 3 pontos al cambiar de lote; Calibración en ó 3 puntos cuando el control interno de calidad lo indique. Linealidad El resultado de la medición es lineal hasta las 700 U/L. Para valores mayores, diluir la muestra con NaCl 150 mmol/l (0,85%), realizar una nueva medición y multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución. Diluir la muestra de modo tal que el valor encontrado se situe entre 50 y 400 U/L Sugerimos la verificación de la linealidad metodológica y fotométrica al menos semestralmente utilizando muestras con valores de hasta 700 U/L. Control interno de la calidad. El laboratorio debe mantener un programa de control interno de calidad que defina claramente las reglas aplicables, objetivos, procedimientos, criterios para especificaciones de la calidad y límites de tolerancia, acciones correctivas y registro de las actividades. Para evaluar la imprecisión y desvíos de la calibración deben ser utilizados materiales de control. Se sugiere que las especificaciones para el coeficiente de variación y el error total se basen en los 4,5,6 componentes de la variación biológica (VB). Se sugiere utilizar los productos de la línea Qualitrol - Labtest para el control interno de la calidad en ensayos de química clínica. 7, Valores de referencia. Estos valores deben ser usados sólo como orientativos. Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango de valores de referencia en la población atendida. Los siguientes valores de la actividad de la Gamma GT se obtuvieron a temperatura de 37ºC. Gama GT (U/L) Gama GT (U/L) 0-6 meses 6-1 meses 1-1 años años Adultos 0-6 meses 6-1 meses 1-1 años años Adultos Conversión: Unidades Convencionales (U/L) x 16,7 = Unidades SI (nkat/l). Temperatura. La siguiente tabla permite convertir la actividad medida a una determinada temperatura al valor que se sería obtenido en la medición realizada a otras temperaturas. Temperatura de trabajo 5ºC 30ºC 37ºC Mujeres Hombres Factores de corrección de temperatura 5ºC 30ºC 37ºC ,37 1,79 0, ,30 0,56 0, Ejemplo. La actividad enzimática obtenida a 37ºC debe ser multiplicada por 0,77 para obtener la actividad a 30ºC o por 0,56 para obtener la actividad a 5ºC. Como estos factores pueden variar con los diferentes instrumentos, se sugiere que sean utilizados sólo como referencia para comparación de resultados. 04 Español - Ref.: 105

5 Características de desempeño 9 Estudios de recuperación. A dos muestras con valores de Gamma GT iguales a 95 y 485 U/L, se les adicionaron cantidades determinadas de la enzima obteniéndose los siguientes resultados: Actividad Inicial (U/L) Añadida (U/L) Esperada (U/L) Encontrada Recuperación (%) El error sistemático proporcional medio estimado es igual a 0,4 U/L para el nivel de decisión de 59 U/L y 1,3 U/L para el nivel de decisión de 181 U/L. Estudios de comparación de métodos. El método propuesto fue comparado con el método de referencia de la IFCC, habiéndose obtenido los siguientes resultados: Número de muestra Intervalo de concentraciones (U/L) Media de las estimativas (U/L) Ecuación de regresión Coeficiente de correlación Método Comparativo 80 14,7-44,0 Método Labtest 80 11,4-41,4 119,9 118,8 Método Labtest = 1,015 x Método Comparativo -,97 0,999 Utilizando la ecuación de regresión, el error sistemático total (bias) estimado es igual a -3,5% para un nivel de decisión igual a 59 U/L y -0,14% para un nivel de decisión igual a 181 U/L. Estos errores son menores al error sistemático analítico de la especificación óptima basada en la variación biológica, que es 5,4%. Estudios de precisión. Los estudios de precisión fueron realizados en el sistema Labmax 40 - Labtest, utilizando muestras con valores de actividad iguales a 59 y 181 U/L. Repetitividad - imprecisión intra-ensayo 1 1 N 0 0 N ,7 Media Reproducibilidad - imprecisión total Media DP (U/L) 0,7 1,0 DP (U/L) 1,5 3, ,8 CV (%) 1,13 0,57 CV (%),58 1,80 La imprecisión total obtenida para las muestras cumple con la especificación óptima para la imprecisión total basada en la variación biológica, que es 3,5%. Evaluación del error total. El error total (error aleatorio + error sistemático) estimado para un valor de 59 U/L es igual a 7,8% y para un valor de 181 U/L es igual a 3,1%. Los resultados indican que el método cumple con la especificación óptima para el error total ( 11,1%) basada en los componentes de la Variación Biológica (VB). Sensibilidad metodológica. Una muestra proteica que no contenía Gamma GT fue utilizada para calcular el límite de detección del ensayo habiéndose encontrado un valor igual a,48 U/L, equivalente al promedio de 0 ensayos más dos desviaciones estándar. Utilizando la absorbancia mínima detectable como parámetro, la sensibilidad fotométrica es de,54 U/L, correspondiendo a una diferencia de absorbancia igual a 0,001. Efectos de la dilución de la matriz. Dos muestras con valores iguales a 710 y 603 U/L, fueron utilizadas para evaluar la respuesta del sistema a las diluciones de la matriz con NaCl 150 mmol/l (0,85%). Usando factores de dilución que variaron de a 16, se encontró una recuperación media del 99,0%. Significado clínico 8. Prácticamente todos los tejidos humanos contienen Gamma GT y, a pesar de mostrar una mayor concentración en el tejido renal, esta enzima sérica parece originarse, principalmente, del sistema hepatobiliar. Por lo tanto, la Gamma GT es un sensible indicador de las enfermedades inflamatorias o lesiones hepáticas y está significativamente elevada en las desórdenes obstructivas de la vía biliar. La Gamma GT tiene mayor especificidad que la fosfatasa alcalina (ALP) y que la aspartato amino transferasa (AST) para evaluar desórdenes hepáticas. No está elevada en la enfermedad ósea y durante el embarazo como ocurre con la ALP, ni en las enfermedades del músculo esquelético como la aspartato amino transferasa. La Gamma GT es útil para diferenciar la colestasis mecánica y viral de la colestasis inducidas por drogas. En las dos primeras la Gamma GT y ALP están igualmente elevadas. En las colestasis inducidas por drogas la Gamma GT está mucho más elevada. Pacientes que hacen uso prolongado de drogas que inducen el sistema microsomal hepático, como el fenobarbital, fenitoina, carbamazepina, entre otras, presentan actividad sérica elevada de Gamma GT. En pacientes con cáncer, el aumento de actividad de Gamma GT es un indicador de presencia de metástasis hepática. En el alcoholismo crónico los niveles séricos de la Gamma GT disminuyen con la suspensión de la ingesta y se elevan con la exposición al mismo. En base a esta observación, la determinación de la Gamma GT está siendo usada para documentar el éxito de la terapia e identificar a los pacientes que retornan al habito después de su alta. Observaciones 1. La limpieza y secado adecuados del material utilizado son factores fundamentales para la estabilidad de los reactivos y obtención de resultados correctos.. El agua utilizada en el laboratorio debe tener la calidad adecuada a cada aplicación. Así, para preparar reactivos y usar en las mediciones, debe tener resistividad 1 megaohm.cm o conductividad 1 microsiemen/cm y concentración de silicatos <0,1 mg/l (agua tipo II). 05 Español - Ref.: 105

6 Para el enjuague del material de vidrio el agua puede ser del tipo III, con resistividad 0,1 megaohms o conductividad 10 microsiemens. En el enjuague final, utilizar agua tipo II. Cuando la columna desionizadora está con su capacidad saturada produce agua alcalina con liberación de varios iones, silicatos y substancias con gran poder de oxidación o reducción que deterioran los reactivos en pocos días o incluso horas, alterando los resultados de modo imprevisible. Por ello es fundamental establecer un programa de control de la calidad del agua. 3. Para una revisión de las fuentes fisiopatológicas y medicamentosas de interferencia en los resultados y en la metodología se sugiere consultar Referencias 1. Szasz, G. Clin Chem 1969;15: IFCC Reference Procedure for the Measurement of Catalytic Concentration of -Glutamyltransferase. Clin Chem Lab Med 00; 40: Kaplan LA, Pesce AJ: Methods in Clinical Chemistry, St. Louis: The C.V. Mosby Co., 1987; 11. Informaciones al consumidor [Términos y Condiciones de Garantía] Labtest Diagnóstica garantiza el desempeño de este producto, dentro de las especificaciones, hasta la fecha de expiración indicada en los rótulos, siempre que los cuidados de utilización y almacenamiento indicados en los rótulos y en estas instrucciones, sean seguidos correctamente. Labtest Diagnóstica S.A. CNPJ: / Av. Paulo Ferreira da Costa, Vista Alegre - CEP Lagoa Santa. Minas Gerais Brasil - Customer Service customerservice@labtest.com.br Revisión: Agosto, 013 Ref.: Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reproducción bajo previa autorización 4. Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular, Base de Datos de Variación Biológica. Disponible en:< (acceso desde 04/006). 5. < (acceso desde 08/007). 6. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem 1981;7: Soldin SJ, Brugnara C, Wong EC: Pediatric Reference Intervals, 5.ed. Washington: AACC Press, 005. P Burtis CA, Ashwood ER. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, Philadelphia: Saunders Company 1994; Labtest: Datos de archivo. Presentación Producto Gamma GT Liquiform Gamma GT Liquiform Labmax 560/400 Referencia 105-/ / / Contenido X 4 ml X 6 ml 1 X 3 ml X 40 ml X 10 ml 1 X 3 ml 4 X 7 ml 4 X 7 ml 1 X 3 ml Están disponibles aplicaciones para sistemas automáticos y semiautomáticos. El número de tests en aplicaciones automáticas depende de los parámetros de la programación. 06 Español - Ref.: 105