2. Reactivo Conservar entre 2-8ºC.
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- Tomás Contreras Sandoval
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1 FOSFATASA ALCALINA Liquiform Instrucciones de Uso Ref.:79 Finalidad. Sistema para determinación en modo cinético de la Fosfatasa Alcalina en el suero. Uso professional. [Solamente para uso diagnóstico in vitro] Principio. La fosfatasa alcalina (FALC) del suero en ph alcalino hidrolisa el p-nitrofenilfosfato liberando p-nitrofenol y fosfato inorgánico, según la reacción expuesta a continuación: p-nitrofenilfosfato + H O FALC p-nitrofenol + fosfato La cantidad producida de p-nitrofenol, que tiene elevada absorbancia en 405 nm, es directamente proporcional a la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina en la muestra. Características del sistema. El substrato p-nitrofenil fosfato fue seleccionado porque es prontamente hidrolisado por la fosfatasa alcalina. El producto de la hidrólisis posee elevada absortividad molar, permitiendo utilizar pequeño volumen de muestra y corto tiempo de reacción, porque utiliza un tampón transfosforilante que aumenta la velocidad del sistema. El sistema se basa en el método de referencia de la AACC, que optimiza todas las condiciones de la reacción, incluyendo temperatura, ph, concentración de los reactivos y volumen fraccional de la muestra. Este método, con pequeñas modificaciones, está siendo considerado por varias organizaciones nacionales e internacionales, interesadas en establecer un método de referencia para la fosfatasa alcalina. Las sustancias utilizadas en la reacción se encuentran distribuidas adecuadamente en dos reactivos, al objeto de ofrecer mayor estabilidad en la forma líquida original y mantener las condiciones óptimas de la reacción, de modo a permitir la utilización directa de los reactivos en sistemas automáticos. La metodología monorreactiva puede ser aplicada utilizando un Reactivo de Trabajo estable por 30 días bajo refrigeración obteniéndose desempeño adecuado incluso en situaciones de baja demanda de la prueba. El sistema también permite preparar el volumen de Reactivo de Trabajo necesario para solamente una medición de la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina. El sistema es sencillo y utiliza medidas en modo cinético continuado, pudiendo ser fácilmente aplicado en ana-lizadores automáticos y semiautomáticos capaces de medir absorbancia en 405 nm. Metodología. Bowers y Mc Comb modificado. Reactivos 1. Reactivo Conservar entre -8ºC. Contiene tampón ph,4; HEDTA,0 mmol/l; sulfato de zinco 1, mmol/l; acetato de magnesio,5 mmol/l; azida sódica 8 mmol/l.. Reactivo - - Conservar entre -8ºC. Contiene p-nitrofenilfosfato 60 mmol/l y fenol 50 mmol/l. Cuando almacenados en las condiciones indicadas, los reactivos no abiertos son estables hasta la fecha de caducidad impresa em el rótulo. Durante el manejo, los reactivos están sujetos a contaminaciones de naturaleza química y microbiana que puedem provocar reducción de la estabilidad. Rastreabilidad del sistema - La absortividad molar del p-nitrofenol, producto de la reacción es usado como sistema de referencia para la calibración del ensaio. Precauciones y cuidados especiales Se deben aplicar cuidados habituales de seguridad en el manejo del reactivo. El Reactivo 1 contiene azida sódica, que es tóxica. Se debe tomar cuidado para evitar la ingestión y en caso de contacto con los ojos lavar inmediatamente con gran cantidad de agua y procurar auxilio médico. La azida puede formar compuestos altamente explosivos con tuberías de plomo y cobre. Así siendo, se deben utilizar grandes volúmenes de agua para deshacerse del reactivo. No utilizar el Reactivo de Trabajo cuando su absorbancia, medida contra el agua en 405 nm, sea igual o mayor que 1, o cuando se muestre turbio o con señales de contaminación. Materiales necesarios y no suministrados 1. Fotómetro con cubeta termostatizada capaz de medir con exactitud la absorbancia en 405 nm.. Pipetas para medir muestras y reactivos. 3. Cronómetro. Muestra Se debe crear una instrucción de trabajo que establezca procedimientos adecuados para la recogida, preparación y almacenamiento de la muestra. Subrayamos que los errores debidos a la muestra pueden ser mucho más grandes que los errores acaecidos durante el procedimiento analítico. 01 Español - Ref.: 79
2 La muestra de sangre debe ser obtenida después de como mínimo 8 horas en ayunas. Suero o plasma (heparina). La muestra es estable 7 días entre -8ºC. Cuando la muestra es almacenada a temperatura ambiente, se obtienen resultados falsamente elevados. Como ninguna prueba conocida puede asegurar que muestras de sangre no transmiten infecciones, todas deben ser consideradas como potencialmente infectantes. Así siendo, al manejarlas se debe seguir las normativas establecidas para bioseguridad. Para deshacerse de los reactivos y el material biológico sugerimos aplicar las normativas locales, regionales o nacionales de protección ambiental. Interferencias Citrato, fluoruro, oxalato y EDTA son inhibidores de la actividad de la fosfatasa alcalina porque forman complejos con el magnesio. Valores de Bilirrubina de hasta 3 mg/dl no interfieren en la reacción. Muestras ligeramente hemolisadas con hemoglobina de hasta 30 mg/dl pueden ser toleradas, pero hemólisis más acentuadas no se deben aceptar porque producen resultados falsamente disminuidos. Valores de Triglicéridos por encima de 1800 mg/dl producen resultados falsamente elevados. Para evaluar la concentración aproximada de la hemoglobina en una muestra hemolisada se puede proceder como expuesto a continuación: Diluir 0,05 ml de la muestra en,0 ml de NaCl 150 mmol/l (0,85%) y medir la absorbancia en 405 ó 415 nm, ajustando el cero con agua desionizada o destilada. Hemoglobina(mg/dL) Absorbancia x 601 Hemoglobina(mg/dL) Absorbancia x 467 Preparo del reactivo de trabajo. El conjunto de un frasco de Reactivo 1 y un frasco de Reactivo, permite preparar el Reactivo de Trabajo. Transferir el contenido de un frasco de Reactivo a un frasco de Reactivo 1 y homogeneizar por inversión. Apuntar la fecha de expiración. Estable por 5 días entre 15-5ºC y 30 días entre -8ºC, cuando no ocurra contaminación química o bacteriana. Identificar el frasco del Reactivo de Trabajo para evitar confusión con otros frascos del Reactivo 1. Para preservar el desempeño, el Reactivo de Trabajo debe permanecer fuera del frigorífico solamente el tiempo necesario para obtenerse el volumen a ser utilizado. Evitar exposición a la luz solar directa. Opcionalmente, se puede preparar menos cantidad del Reactivo de Trabajo utilizando la proporción 4 volúmenes del Reactivo 1 y 1 (un) volumen del Reactivo. Ejemplo. Para preparar 1 ml del Reactivo de Trabajo mezsclar 0,8 ml del Reactivo 1 com 0, ml del Reactivo. Para evaluar la linealidad de la reacción verificar se las absorbancias medidas en intervalos de 1 minuto son comparables. El Reactivo de Trabajo contiene tampón ph,4, sulfato de zinco 1,0 mmol/l, fenol mmol/l, HEDTA 1,6 mmol/l, acetato de magnesio,0 mmol/l, p-nitrofenil fosfato 1 mmol/l, azida sódica 6,4 mmol/l. Procedimiento 1. En un tubo rotulado Prueba pipetear 1,0 ml del Reactivo de Trabajo.. Añadir 0,0 ml de la muestra, homogeneizar y transferir inmediatamente para la cubeta termostatizada a 37 0,ºC. Esperar 1 minuto. 3. Hacer la lectura de la absorbancia inicial (A ), disparando simultáneamente el cronómetro. Repetir la lectura después de minutos (A ). Para evaluar la linealidad de la reacción verificar si las absorbancias medidas en intervalos de 1 minuto son comparables. Calcular el ( A/minuto) restando A de A y dividiendo por. Cálculos. Ver linealidad. Es práctica habitual calcular los resultados de la actividad enzimática utilizando un factor obtenido en condiciones óptimas de reacción las que incluyen: Longitud de onda: 405 nm 0, nm. Cubeta termostatizada a 37 0,ºC con 1,0 cm de espesor de solución. Ancho medio de banda 8 nm. Luz espuria 0,1 %. Como en la mayoría de las veces no es posible trabajar bajo estas condiciones, las buenas prácticas de laboratorio recomiendan realizar la calibración del ensayo utilizando un calibrador de enzimas indicado por el fabricante del reactivo. Labtest recomienda la línea Calibra para calibración del sistema Fosfatase Alcalina Liquiform. A Prueba = A -A Actividad de la Fosfatasa Alcalina = A Prueba x 764. El factor 764 fue calculado para las condiciones propuestas arriba. Recalcular el factor cuando sea efetuada cualquier modificación en uno de los parámetros utilizados para calcularlo. Ver método para cálculo del factor. Ejemplo A Prueba = 0,6 A Prueba = 0,660 0,660-0,6 A/minuto = = 0,05 Fosfatasa Alcalina (U/L) a 37ºC = 0,05 x 764 = 69 0 Español - Ref.: 79
3 Método para cálculo del factor VT x 00 Factor = xvaxd Adultos (U/L) Niños* (U/L) *(Incluyendo adolescentes de hasta 16 años) 37 ºC VT = volumen total del ensayo (1,0 ml) VA = volumen de la muestra (0,0 ml) 00 = conversión de U/mL para U/L d = espesor de la solución (1 cm) = absortividad milimolar del p-nitrofenol en 405 nm (18,45) Ejemplo Conversión de U/L para Unidades SI: kat/l = U/L x 0,0167 Temperatura. La tabla expuesta a continuación permite convertir la actividad medida a una determinada temperatura para el valor que sería obtenido en la medición realizada a otras temperaturas. 1,0 x 00 Factor = = ,45 x 0,0 x 1 Calibración Temperatura de trabajo 5ºC 30ºC 37ºC Factores de corrección de la temperatura 5ºC 0,69 0,48 30ºC 37ºC 1,45,08 1,43 0,70 Calibraciones manuales Usar calibradores de la línea Calibra - Labtest. Intervalo de calibraciones Calibración en ó 3 puntos al cambiar de lote; Calibración en ó 3 puntos cuando el control interno de calidad lo indique. Sistemas automáticos Blanco de reactivos: agua desionizada o solución de cloruro de sodio 150 mmol/l (0,85%); Usar calibradores de la línea Calibra - Labtest. Intervalo de calibraciones Calibración en ó 3 puntos al cambiar de lote; Calibración en ó 3 puntos cuando el control interno de calidad lo indique. Linealidad La reacción es lineal hasta 1500 U/L. Para valores mayores, diluir la muestra 1: con NaCl 150 mmol/l (0,1 ml de suero + 0,9 ml de NaCl 150 mmol/l), repetir la determinación y multiplicar el resultado obtenido por. Sugerimos la verificación de la linealidad metodológica y fotométrica como mínimo a cada seis meses, utilizando muestras con actividades de hasta 1500 U/L. Control interno de la calidad. El laboratorio debe mantener un programa de control interno de calidad que defina con claridad los reglamentos aplicables, objetivos, procedimientos, criterios para especificaciones de la calidad y límites de tolerancia, acciones correctivas y registro de las actividades. Controles deben ser utilizados para evaluar la imprecisión e desviaciones de calibración. Se sugiere que las especificaciones para el coeficiente de variación máximo y el error total sean basados en los componentes de la variación biológica (VB). Intervalo de referencia. Estos valores pueden ser usados tan solamente a modo de orientación. Se recomienda que cada laboratorio establezca su propia banda de valores de referencia de la población atendida. Ejemplo: la actividad enzimática obtenida a 37ºC debe ser multiplicada por 0,70 para obtenerse la actividad a 30ºC o por 0,48 para obtenerse la actividad a 5ºC. Características del desempeño Exactitud. En muestras con concentraciones de Fosfatasa Alcalina iguales a 59 y 00 U/L se añadieron cantidades diferentes del analito obteniéndose recuperación de entre 94 y %. Especificidad. El método propuesto fue comparado con método similar utilizando 40 muestras de suero con valores situados entre 47 y 707 U/L. La evaluación estadística de los resultados resultó en la ecuación de la regresión: y = 1,091x-,96 y un coeficiente de correlación (r) igual a 0,999. El error sistemático total (constante y proporcional) verificado en el nivel de decisión (0 U/L), fue igual a U/L ó,0%. Como las muestras fueron seleccionadas aleatoriamente en pacientes de ambulatorio y pacientes hospitalizados, se puede inferir que el método tiene una especificidad metodológica adecuada. Repetitividad - Imprecisión intra-ensayo Muestra 1 Muestra Muestra 3 N Media Reproducibilidad - Imprecisión Total Muestra 1 Muestra Muestra 3 N Media DP 1,1 1,6,4 DP,0,8 6,3 CV (%) 1, 0,9 0,5 CV (%), 1,6 1,4 Sensibilidad metodológica. Una muestra proteica que no contenía fosfatasa alcalina fue utilizada para calcular el límite de detección del ensayo, habiendo sido encontrado un valor igual a,4 U/L, equivalente a la media de 0 ensayos más dos desviaciones estándar. 03 Español - Ref.: 79
4 Efectos de la dilución de la matriz. Una muestra con valor igual a 850 U/L fue utilizada para evaluar la respuesta del sistema en las diluciones de la matriz con NaCl 150 mmol/l. Usando factores de dilución que variaron de a 8 se encontraron recuperaciones de entre 1 y 4%. Significado clinico. La fosfatasa alcalina es producida por muchos tejidos, principalmente por los huesos, hígado, intestinos y placenta, y es excretada por la bilis. El dosaje sérico de esta enzima es particularmente útil en la investigación de las enfermedades hepatobiliares y óseas. Niveles elevados de fosfatasa alcalina aparecen en pacientes con enfermedades óseas caracterizadas por el aumento de la actividad osteoblástica como la osteítis deformante, raquitismo, osteomalacia, hiperparatiroidismo, metástasis ósea, sarcoma osteogénico y enfermedad de Paget. Niveles elevados de fosfatasa alcalina se dan también en pacientes con enfermedades obstructivas de las vías biliares, metástasis hepáticas, dolencias granulomatosas y en la cirrosis hepática. En las enfermedades hepatocelulares como la hepatitis viral aguda, en general se observa un ligero aumento de la enzima. Niveles disminuidos de la fosfatasa alcalina se encuentran en la desnutrición crónica, en la hipofosfatasemia y, ocasionalmente, en el hipotireoidismo y anemia perniciosa. Observaciones 1. La limpieza y secado adecuadas del material utilizado son factores fundamentales para la estabilidad de los reactivos y obtención de resultados correctos.. El laboratorio clínico tiene como objetivo fornecer resultados exactos y precisos. La utilización de agua de calidad inadecuada es una causa potencial de errores analíticos. El agua desionizada o destilada utilizada en el laboratorio debe tener la calidad adecuada para cada aplicación. Así, para preparar reactivos y usar en las mediciones y para su uso en enjuague final de la vidrería, debe tener resistividad 1 megaohm.cm o conductividad 1 microsiemens/cm y concentración de silicatos <0,1 mg/l. Cuando la columna desionizadora está con su capacidad saturada, se produce agua alcalina con liberación de varios iones, silicatos y sustancias con gran poder de oxidación o reducción que deterioran los reactivos en pocos días o incluso horas, alterando los resultados de modo imprevisible. Por lo cual es fundamental establecer un programa de control de la calidad del agua. 3. Como ocurre en toda medición de la actividad en-zimática, la rigurosa observación del tiempo y de la temperatura de incubación es de gran importancia para la calidad de los resultados obtenidos. 4. Para una revisión de las fuentes fisiopatológicas y medicamentosas de interferencia en los resultados y en la metodología, se sugiere consultar Young DS, Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, 3ª edición, Washington: AACC Press, Referencias 1. IFCC Methods for the measurement of catalytic concentration of enzymes-part 5, IFCC method for Alkaline Phosphatase. J Clin Chem Clin Biochem 1983;1: McComb RB, Bowers GN, Upretti A. Clin Chem 1981;7: Tietz NW, Burtis CA, Ducan P et al. Clin Chem 1983;9: Tonks DB Quality Control in Clinical Laboratories, Warner-Chilcott Laboratories, Diagnostic Reagents Division, Scarborough, Canada, (acceso en 5//07). 6. Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular, Base de Datos de Variación Biológica. Disponível em:< (acceso en 04/006). 7. Labtest: Dados de Arquivo. Presentación Producto Fosfatasa Alcalina Liquiform Fosfatasa Alcalina Liquiform Labmax 560/400 Están disponibles las aplicaciones para sistemas automáticos. El número de pruebas en aplicaciones automáticas depende de los parâmetros de programación. Informaciones al consumidor [Términos y Condiciones de Garantia] A Labtest Diagnóstica garantiza la correcta performance del equipo hasta su fecha de vencimento se ha sido conservado de acuerdo a las instrucciones que figuram en el rótulo. Labtest Diagnóstica S.A. CNPJ: / Av. Paulo Ferreira da Costa, Vista Alegre - CEP Lagoa Santa. Minas Gerais Brasil - Customer Service customerservice@labtest.com.br Revisión: Mayo, 013 Ref.: Referencia 79-4/ / Contenido 4 x 4 ml 4 x 6 ml 4 x 39 ml 4 x 11 ml Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reproducción bajo previa autorización 04 Español - Ref.: 79
5 05 Español - Ref.: 79
6 Símbolos utilizados com produtos diagnósticos in vitro Símbolos usados con productos diagnósticos in vitro Symbols used with ivd devices Adições ou alterações significativas Período após abertura Instalar até Instalar hasta Install before Ref.: Español - Ref.: 79
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