AMILASA CNPG Liquiform

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1 AMILASA CNPG Liquiform Instrucciones de Uso Ref.:14 Finalidad. Sistema para determinación de la α-amilasa en muestras de sangre, orina u otros líquidos biológicos. [Solo para uso diagnóstico in vitro] Principio. La alfa-amilasa hidroliza el sustrato -cloro-p-nitrofenil-α- D-maltotriosídeo (CNPG3), liberando -cloro-4-nitrofenol (CNP) y formando -cloro-4-nitrofenil-alfa-d-maltósido (CNPG), maltotriosa (G3) y glucosa (G). La velocidad de formación de -cloro-4-nitrofenol puede medirse fotométricamente y proporciona una medida directa de la actividad de la α-amilasa en la muestra. α-amilasa 10 CNPG3 9CNP + 1 CNPG + 9G3 + 1G Características del sistema. Los últimos métodos para la determinación de α-amilasa se basan en la producción de p-nitrofenol a partir de la hidrólisis de sustratos bien definidos de oligosacáridos, con grupos de bloqueo asociados al desecho de carbohidrato terminal. La acción hidrolítica de α-amilasa en esos oligosacáridos produce varias cadenas de tamaños distintos, y requieren el acoplamiento de las reacciones enzimáticas auxiliares para liberar el p-nitrofenol. En muchos casos, la presencia de trazas de amilasa como contaminante de las enzimas auxiliares disminuye en gran medida la estabilidad de esos sustratos. El ensayo propuesto utiliza un sustrato cromogénico, -cloro-p- nitrofenol, vinculado a matotriosa. La α-amilasa actúa directamente en ese sustrato, y libera una cantidad mayor que el 90% del cromóforo CNP, cuya velocidad de formación puede medirse en modo cinético. Se utiliza un sustrato en medio líquido, que no requiere el empleo de enzimas auxiliares para la formación del producto coloreado, así se obtiene una estabilidad prolongada del sustrato. El sistema Labtest es de fácil aplicación en analizadores automáticos y semiautomáticos, que son capaces de medir una reacción cinética en 405 nm. La alta linealidad del ensayo disminuye en gran medida el número de muestras que deben ser diluidas. Metodología. (CNPG3). Reactivo Sustrato -cloro-p-nitrofenil-α-d-maltotriosídeo Sustrato - Almacenar entre - 8 ºC Contiene tampón 100 mm, ph 6,; -cloro-p-nitrofenil-α-d- maltotriosídeo 560 µ M; cloruro de sodio 350mM; acetato de calcio 6,0 mm; tiocianato de potasio 900 mm y azida sódica 14,6 mm. El reactivo no abierto, cuando se almacena en las condiciones especificadas, es estable hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta. Durante el manejo de los reactivos están sujetos a contaminaciones de naturaleza química y microbiana que pueden causar la reducción de la estabilidad. Acciones como pipetear el sustrato con la boca, soplar en el sustrato, usar el material contaminado con saliva, sudor y mantener el envase destapado pueden contaminar el reactivo con cantidades microscópicas de saliva o sudor, que son capaces de dañar irreversiblemente el sustrato. Al igual que en toda reacción enzimática, la estricta observación del tiempo y de la temperatura de incubación es de gran importancia para la calidad de los resultados obtenidos. Los estudios de estabilidad han señalados que la absorbancia del sustrato, medida contra el agua, presenta un incremento de 0,0015 por mes. Elevaciones repentinas de la absorbancia del sustrato señalan contaminación y su utilización debe ser descontinuada. Los cuidados habituales de seguridad deben aplicarse en la manipulación de los reactivos. El reactivo contiene azida sódica que es tóxica. No beba y, en caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico. La azida puede formar compuestos altamente explosivos con tuberías de plomo o cobre. Por lo tanto, utilice grande volumen de agua para desechar el reactivo. El reactivo contiene asimismo tiocianato de potasio, que es venenoso. No ingerir Materiales necesarios y no fornecidos. 1. Fotómetro con cubeta con termostato capaz de medir, con precisión la absorbancia a 405 nm Precauciones y cuidados especiales Pipetas para medir muestras y reactivos. Cronómetro. Calibrador - Línea Calibra H - Ref. 80, Labtest. Muestra Usar suero, plasma (heparina), orina y líquidos (ascítico, duodenal o pleural). Las muestras que contienen citrato EDTA u oxalato producen resultados falsamente disminuidos. La actividad enzimática es estable 7 días entre 15-5 ºC y varios meses entre - 8 ºC. No use muestras con signos de contaminación microbiana. Las muestras de orina deben recogerse en intervalo de a 4 horas. 01 Español - Ref.: 14

2 Cuando se determina la amilasa en la muestra de orina, se debe también determinar la creatinina en la misma muestra. El resultado deberá informarse como Relación Amilasa/Creatinina (U/g) con el objetivo de compensar las variaciones de la actividad de amilasa en las muestras obtenidas en cada micción. Las muestras de orina deben almacenarse entre - 8 ºC. No añada preservativo. Se debe generar un Procedimiento Operativo Estándar (POP) para la recogida, preparación y almacenaje de la muestra. Se hace hincapié en que los errores debido a la muestra, pueden ser mucho mayores que los errores que sobrevienen durante el procedimiento analítico. Puesto que ninguna prueba conocida puede asegurar que las muestras de sangre no transmiten infecciones, todas ellas deben considerarse como potencialmente infecciosos. Por lo tanto, al manejarlas, se deben cumplir las normas establecidas para la bioseguridad. Para desechar los reactivos y el material biológico, se sugiere la aplicación de las normas locales, estaduales o federales de protección ambiental. Interferencias Valores de bilirrubina hasta 10 mg/dl, hemoglobina hasta 0 mg/dl y triglicéridos hasta 1800 mg/dl no interfieren significativamente en la reacción. Fármacos colinérgicos, narcóticos (morfina) y alcohol producen resultados falsamente elevados de la amilasa sérica. La presencia de macroamilasa en la muestra de suero, que es resultante de la composición de la amilasa con proteínas de alto peso molecular, puede producir resultados falsamente elevados en la ausencia de la pancreatitis. En estos casos no se observa aumento de actividad de la amilasa en la orina. Procedimiento Parámetros para los analizadores automáticos Parámetros Tipo de Reacción Dirección de Reacción λ de Onda primario λ de Onda secundario Temperatura Calibración Modelo de Calibración* Volumen de Muestra** Volumen de R1** Lectura 1 (Absorbancia 1) Lectura (Absorbancia ) Aplicación Cinética Creciente 405 nm 700 nm 37 ºC puntos Punto 0: Blanco (Agua desionizada/salina) Punto 1: Calibrador 1 Lineal 4 µ L 0 µ L 150 segundos tras la adición de R1 + muestra 70 segundos tras la adición de R1 + muestra *La definición del modelo de calibración debe adecuarse a cada modelo del equipamiento. En caso de dudas, por favor, póngase en contacto con el Servicio de Apoyo al Cliente Labtest. **Los volúmenes de las muestras y de los reactivos pueden modificarse proporcionalmente sin afectar el rendimiento de la prueba. En caso de reducción de los volúmenes, es fundamental que se observe el volumen mínimo requerido para la medición fotométrica. Procedimiento manual Condiciones óptimas de reacción: Longitud de onda: 405 nm; Cubeta termostatizada a 37 ± 0, ºC con 1,0 cm de espesor de solución; Banda de pasaje nm; Luz espuria 0,1. Si se cumple las condiciones óptimas de reacción mencionadas previamente, se puede optar por la utilización del factor 689. Tome tubos de ensayo y proceda de la siguiente manera: *Se recomienda la utilización de calibrador Calibra H - Labtest. 1. Tras la adición del reactivo, homogeneizar y transferir inmediatamente para la cubeta de reacción termostatizada a 37 ± 0, ºC. Esperar 30 segundos.. R1: 0 µ L Muestra: 4 µ L Prueba Calibrador Muestra 0,0 ml ---- Calibrador* ,0 ml Reactivo 1 1,0 ml 1,0 ml Realizar la lectura de la absorbancia inicial (A1) en 405 nm disparando al mismo tiempo el cronómetro. Repetir la lectura después de minutos (A). Al igual que con toda la medición de la actividad enzimática, la estricta observación del tiempo y de la temperatura de incubación es de gran importancia para la calidad de los resultados obtenidos. Con el objetivo de evaluar la linealidad de la reacción, se debe registrar la absorbancia con intervalos de 1 minuto, y verificar si las diferencias de absorbancia en cada minuto son equivalentes. Cálculos. 37 ºC nm,5 A1 4,5 mim Como en la mayoría de las veces no se puede trabajar bajo condiciones óptimas de reacción, las buenas prácticas del laboratorio recomiendan realizar la calibración del ensayo con el empleo del calibrador indicado por el fabricante del reactivo. Labtest indica el calibrador Calibra H - Ref. 80 para calibración del sistema Amilasa CNPG. A 0 Español - Ref.: 14

3 A/minuto Prueba o Calibrador = (A -A )/ Factor = A/min Calibrador Amilasa (U/L) = A/min Prueba x Factor Ejemplo Actividad del Calibrador Calibrador A = 0,158 A = 0,90 1 0,158-0,90 A/min Prueba = = 0,066 Prueba A = 0,09 A = 0,13 1 0,13-0,09 A/min Calibrador = = 0,0 Actividad del Calibrador (U/L) = Factor = = ,066 Actividad de la Amilasa (U/L) = 0,040 x 687 = 136 U/L Amilasa en orina/hora Amilasa en Orina (U/h) = Relación Amilasa/Creatinina Relación Amilasa Creatinina (U/g) = Calibración. Amilasa (U/L)x volumen orina (ml) 1000 x tiempo de recogida (h) Amilasa (U/L)x100 Creatinina (mg/dl) Usar calibrador Calibra H - Ref. 80, Labtest. Intervalo de calibraciones Cuando indica el control interno de la calidad. Si se utiliza un nuevo lote de reactivos. Si se utiliza nuevos envases de reactivos de un mismo lote, y en caso de que se realice una nueva calibración durante la utilización del envase anterior. Linealidad 1 La reacción es lineal hasta 1700 U/L. Para valores mayores, se debe disolver la muestra con NaCl 150 mmol/l (0,85%). Realizar una nueva medición y multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución. Control interno de calidad. El laboratorio debe mantener un programa de control interno de la calidad que defina claramente los reglamentos aplicables, objetivos, procedimientos y criterios para los pliegos de la calidad y límites de tolerancia, acciones correctivas y registro de las actividades. Materiales de control deben utilizarse para monitorear la inexactitud de la medición y desviaciones de la calibración. Se propone que los pliegos para el coeficiente de variación y error total se 1,,3 basen en los componentes de la variación biológica (VB). Relación depuración de amilasa/depuración de creatinina. En la mayoría de los casos de pancreatitis aguda sobreviene elevaciones concomitantes de amilasa sérica y urinaria, pero en ciertos casos la elevación de la amilasa urinaria no es acompañada por una elevación paralela de la amilasa sérica. Por lo tanto, la evaluación de la depuración de amilasa/depuración de creatinina, expresada en porcentual, ofrece mayor valor de diagnóstico en los casos de pancreatitis aguda y pancreatitis recurrente. Determinar la actividad de amilasa y la concentración de creatinina en el suero y en una muestra de orina y aplicar los resultados en la siguiente fórmula. Amilasa en la orina (U/L) x Creatinina en el suero (mg/dl) Relación (%)= x 100 Amilasa en el suero X Creatinina en la Orina (mg/dl) Intervalo de referencia. Estos valores deben usarse apenas como guía. Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio intervalo de referencia en la población atendida. Suero/Plasma 5 a 15 U/L Orina Hasta 30 U/h Relación Amilasa urinaria/creatinina urinaria Hasta 400 U/g Depuración de Amilasa/Depuración de Creatinina 1,0 a 4,0% Conversión de U/L para Unidades SI: µ Kat/L = U/L x 0,0167 Caracterización de Rendimiento Exactitud. En tres muestras con valores de 18, 54 y 886 U/L se han añadido cantidades distintas de analito en el que se obtiene recuperaciones entre 104,8 y 107,6%. El error sistemático total medio obtenido fue de 6,4%, lo que cumple con la especificación deseable basada en los componentes de la Variación Biológica de error total que es ± 7,4% Español - Ref.: 14

4 Estudios contrastivos de métodos. El método propuesto ha sido contrastado con otro producto de metodología análoga, y se obtuvieron los siguientes resultados: Número de muestras Intervalo de concentraciones (U/L) Ecuación de regresión Coeficiente de correlación Con la utilización de la ecuación de regresión, el error sistemático (sesgo) estimado, es igual a,55% para una muestra con actividad de amilasa igual a 50 U/L, 0,46% para una muestra con actividad de amilasa igual a 1 U/L y 0,14% para una muestra con actividad de amilasa igual a 0 U/L. Estos errores son menores que el error sistemático analítico de la especificación deseable basada en la variación biológica que es ± 7,4%. Estudios de precisión. Método Contrastivo Los estudios de precisión se han realizado con la utilización de muestras con valores de actividades iguales a 5, 1 y U/L. La imprecisión total obtenida para las muestras cumple con la especificación deseable para la imprecisión total basada en la variación 6 biológica que es 4,4%. El error total (error aleatorio + error sistemático) estimado en las actividades de 50, 1 y 0 U/L son iguales a 6,, 3,48 y,85%, respectivamente. Los resultados señalan que el método cumple con la especificación deseable para el error total ( ± 14,6%) basada en los componentes deseables de la Variación Biológica. 40 Amilasa CNPG Método Labtest = 1,0104x Método Contrastivo - 1,80 0,996 Repetitividad - imprecisión intra-ensayo Muestra 1 Muestra Muestra 3 N Media 5 1 Reproducibilidad - imprecisión total Muestra 1 Muestra Muestra 3 N Media 5 1 DE (U/L) 0,77 1,60,71 DE (U/L) 0,89 1,68,47 CV (%) 1,55 1,09 0,54 CV (%), 1,83 1,64 Sensibilidad metodológica. Una muestra de proteína que contiene 47 U/L relativa a la actividad de amilasa se ha utilizado para calcular el límite de detección del ensayo, una vez que se ha encontrado un valor igual a,4 U/L, equivalente a 3 veces la desviación estándar de replicaciones de la muestra. Efectos de la dilución de la matriz. Dos muestras con valores iguales a 1613 y 169 U/L se han utilizados para evaluar la respuesta del sistema en las diluciones de la matriz con NaCl 150 mmol/l (0,85%). Con la utilización de factores de dilución que variaron de a 4 se han encontrado recuperaciones entre el 105 y el 114%. Los resultados señalan que el método cumple con la especificación deseable para el error total ( ± 14,6%) basada en los componentes deseables de la Variación Biológica. Significancia clínica. La amilasa sanguínea tiene origen en dos fuentes principales: páncreas y glándulas salivares. Otras fuentes potenciales de amilasa sérica son los órganos de la reproducción y el hígado. La elevación de la amilasa sérica no es un hecho especifico de la pancreatitis, ya que niveles elevados también ocurren en el infarto mesentérico, embarazo ectópico roto, uremia, colelitiasis, parotiditis epidérmica y en individuos portadores de macro-amilasemia. En esta última condición, la amilasa no aparece en la orina. Drogas como morfina y analgésico análogo, diuréticos tiazídicos, provocan elevaciones transitorias de la amilasa sérica. La determinación de la amilasa sérica y urinaria son las pruebas más útiles para el diagnóstico de la pancreatitis.y en muchos casos la relación entre las depuraciones de creatinina y amilasa puede ser útil en el diagnóstico de la pancreatitis aguda. En este caso, el valor de la relación es de entre 7,0 y 15,0%. Observaciones 1. La limpieza y secado del material utilizado son factores fundamentales para la estabilidad de los reactivos y obtención de resultados correctos.. El laboratorio clínico tiene como objetivo fornecer resultados exactos y precisos. La utilización de agua de calidad inadecuada es una causa potencial de errores analíticos. El agua deionizada o destilada utilizada en el laboratorio debe tener la calidad adecuada para cada aplicación. Así, para preparar reactivos y usar en las mediciones y para su uso en enjuague final de la vidrería, debe tener resistividad 1 megaohm.cm o conductividad 1 microsiemens/cm y concentración de silicatos <0,1 mg/l. Cuando la columna desionizadora está con su capacidad saturada, se produce agua alcalina con liberación de varios iones, silicatos y sustancias con gran poder de oxidación o reducción que deterioran los reactivos en pocos días o incluso horas, alterando los resultados de modo imprevisible. Por lo cual es fundamental establecer un programa de control de la calidad del agua. Referências 1. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem 1981;7: Ricos C, Desirable Specifications for Total Error, Imprecision, and Bias, derived from intra- and inter-individual biologic variation. Disponível em: (acesso em 4/01/1). 04 Español - Ref.: 14

5 3. Basques JC. Especificações da Qualidade Analítica. Labtest Diagnóstica Labtest: Dados de arquivo. 5. Genzyme Diagnostics. α-amylase Teste Reagent, Kaufman RA, Tietz NW.ClinChem 1980;6: Pesce AJ Kaplan LA. Methods in Clinical Chemistry, St, Louis: The C.V. Mosby Co., 1987; Roseblum JL. Clin Chem 199;38:9. Presentación Producto Referencia Contenido Amilasa CNPG Liquiform 14-/30 Están disponibles aplicaciones para sistemas automáticos y semiautomáticos. 1 x 30 ml Informaciõnes al consumidor [Términos y Condiciones de Garantía] Labtest Diagnóstica garantiza el desempeño de este producto dentro de las especificaciones hasta la fecha de expiración indicada en los rótulos, siempre que los cuidados de utilización y almacenamiento indicados en los rótulos y en estas instrucciones sean seguidos correctamente. Labtest Diagnóstica S.A. CNPJ: / Av. Paulo Ferreira da Costa, Vista Alegre - CEP Lagoa Santa. Minas Gerais Brasil - Servicio de Apoyo al Consumidor Revisión: Abril, 13 Ref.: sac@labtest.com.br Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reproducción bajo previa autorización El número de tests en aplicaciones en los sistemas automáticos depende de los parámetros de programación. 05 Español - Ref.: 14

6 06 Español - Ref.: 14