2 -Trombina Bovina - Almacenar entre 2-8º. 3 -Plasma Referencia - Almacenar entre 2-8º. FIBRINOGEN Instrucciones de Uso. 01 Español - Ref.

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1 FIBRINOGEN Instrucciones de Uso Ref.:506 Finalidad. Sistema para la determinación cuantitativa de fibrinógeno en plasma. Uso profesional [Solamente para uso diagnóstico in vitro]. Principio. Una cantidad estandarizada de trombina se adiciona a una muestra de plasma citratado diluido y se mide el tiempo de coagulación. En presencia de una concentración elevada de trombina, el tiempo de coagulación del plasma citratado diluido es inversamente proporcional a la concentración de fibrinógeno. Para obtener la concentración de fibrinógeno, se compara el tiempo de coagulación de un plasma con los tiempos de coagulación de una serie de diluciones de un plasma que contiene una concentración conocida de fibrinógeno. Característica del sistema. El sistema Fibrinógeno está formado por un Tampón, una Trombina Bovina y un Plasma Referencia y 1 utiliza el método del tiempo de trombina descrito por Clauss para la determinación de la concentración de fibrinógeno en plasma citratado. Fibrinógeno tiene la propiedad de medir la concentración del fibrinógeno coagulable utilizando la característica funcional del analito y permite la obtención de información de importante uso clínico. El reactivo 1 contiene una suspensión de polímero coloidal tamponado que promueve la detección de la formación de coágulos por instrumentos automatizados semiautomática mismo en concentraciones de fibrinógeno disminuidas. El método puede ser utilizado en procedimientos manuales y puede ser aplicado en coagulómetros con sistema de detección de punto final de coagulación por medios mecánicos o foto-ópticos. 1 Metodologia. Coagulometría - Tiempo de trombina-clauss. Reactivo 1. - Tampón - Almacenar entre 2-8º Contiene. imidazol 50 mmol/l, azida sódica 0,095%, polímero coloidal y estabilizadores. 2 -Trombina Bovina - Almacenar entre 2-8º Contiene. trombina 102,35 unidades NIH/mL, albumina 0,9%, tampón Tris 123 mmol/l y estabilizadores. 3 -Plasma Referencia - Almacenar entre 2-8º Contiene tampón HEPES 50 mmol/l, plasma humano, azida sódica 14,6mM y estabilizadores. Ver la concentración de fibrinógeno en el rótulo del frasco. Los reactivos no abiertos, almacenados en las condiciones indicadas, son estables hasta la fecha de expiración impresa en los rótulos. Preparación de los reactivos R1. Tampón - Listo para uso. Reactivo ligeramente turbio. Homogeneizar antes de usar. Una vez abierto, el reactivo es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, pero sólo cuando se almacena cerrado herméticamente de temperatura entre 2-8º C y no se somete a la contaminación química o microbiana. R2. Trombina Bovina - Adicionar el volumen exacto de agua tipo II indicado en el rótulo. Recolocar la tapa, homogeneizar suavemente y dejar en reposo durante 15 minutos entre 15-25º No agitar por inversión o vigorosamente. Antes de utilizar, homogeneizar suavemente. El reactivo reconstituido es estable por 7 días entre 2-8º C, 24 horas entre 15-30º C y 30 días si es congelado en las primeras 4 horas después de la reconstitución. Descongelar rápidamente a 37º No recongelar. R3. Plasma Referencia - Reconstituir con 1,0 ml de agua tipo II. Recolocar la tapa, homogeneizar suavemente hasta la disolución completa. No agitar vigorosamente. Antes de utilizar, homogeneizar suavemente. El plasma reconstituido es estable 8 horas entre 2-8º C Los reactivos deben ser manipulados de acuerdo a las buenas prácticas de laboratorio para evitar contaminaciones de naturaleza química y microbiana que pueden provocar reducción de su estabilidad. Para preservar el desempeño, mantener los reactivos fuera de la temperatura de almacenamiento (2-8º C) solamente el tiempo mínimo necesario para obtener el volumen a ser utilizado. Precauciones y cuidados especiales Los cuidados habituales de seguridad deben ser aplicados en la manipulación del reactivo. El Plasma Referencia contiene derivados de sangre humana y fue testeado para detectar la presencia de HBsAg, anticuerpos anti-hiv- 1/HIV-2 y anti-hcv, presentando resultados negativos. A pesar de haberse utilizados ensayos validados y aprobados, ninguno de ellos puede asegurar que productos derivados de sangre humana estén libres de agentes infecciosos. Por lo tanto, este reactivo debe ser considerado como siendo potencialmente infectivo debiendo aplicarse las normas de bioseguridad para su manipulación. El R1 - Tampón contiene azida sódica que es tóxica. No ingerir y, en caso de contacto con los ojos, lavar inmediatamente con abundante cantidad de agua y procurar auxilio médico. La azida puede formar compuestos altamente explosivos con las cañerías de plomo y cobre. Por lo tanto, utilizar gran cantidad de agua para descartar el reactivo. 01 Español - Ref.: 506

2 Material necesario y no provisto 1. Baño de María mantenido a temperatura constante (37º C); 2. Pipetas para medir muestras y reactivo; 3. Cronómetro o coagulómetro (mecánico o foto-óptico). Influencias pre-analíticas. El fibrinógeno puede estar aumentado en mujeres que usan anticonceptivos orales, en fumadores y en mujeres embarazadas. Como el fibrinógeno es una de las proteínas de fase aguda, se pueden encontrar valores elevados en los procesos inflamatorios. Pueden ocurrir reducciones del fibrinógeno con el uso de clofibrato y dextrán, en el alcoholismo crónico y por efecto del EDTA. No fueron relatados efectos con el uso de warfarina. La heparina en dosis terapéuticas no actúa como interferente, pero en dosis elevadas produce resultados disminuidos. El congelamiento y descongelamiento del plasma que contiene células puede generar membranas celulares damnificadas que modifican los resultados de modo imprevisible. La presencia de productos de degradación del fibrinógeno pueden prolongar los tiempos de coagulación del procedimiento de medición, principalmente cuando la concentración de fibrinógeno es menor a 150mg/dL. Niveles elevados de paraproteínas, anticuerpos antitrombina y drogas que activan el sistema fibrinolítico pueden interferir con la dosificación de 2 fibrinógeno. Muestra Usar plasma recogido en citrato trisódico anhidro 3,2% (109 mmol/l) Se debe crear un Procedimiento Operativo Estándar (POE) que establezca procedimientos adecuados para la toma, preparación y almacenamiento de la muestra. Destacamos que los errores debidos a la muestra pueden ser mayores que los errores ocurridos durante el procedimiento analítico. Considerando que a calidad de la muestra es fundamental para la exactitud de los resultados, se recomienda la utilización de los 3-5 procedimientos que siguen. 1. Obtener la sangre por punción venosa y evitar el agarrotamiento prolongado, la hemólisis, la formación de burbujas y la aspiración de líquido tisular (factor lll). La aguja debe penetrar directamente en la vena en la primera tentativa (punción venosa no traumática). La sangre debe fluir libremente sin que sea necesario aplicar demasiada fuerza al émbolo. No realizar la determinación de la concentración de fibrinógeno en muestras cuya punción fuera difícil (punción venosa traumática). 2. Recoger la muestra con jeringa de plástico y centrifugar en tubos de plástico. Después de sacar la aguja, utilizar la porción central de la muestra en la jeringa, dejando las porciones anterior y posterior para otros ensayos. 3. En los sistemas de recolección al vacío, usar tubo de plástico o de vidrio siliconado. Tomar 2 muestras cuando la recogida se destine solamente a ensayos de coagulación. La primera en un tubo sin anticoagulante o en un tubo conteniendo citrato (tapa azul) que debe ser despreciada. La segunda muestra recogida en tubo conteniendo citrato (tapa azul) debe ser utilizada para la realización de los ensayos. En el caso de una recogida múltiple, la muestra para los ensayos de coagulación debe ser obtenida después de la toma de la muestra en tubo sin anticoagulante y antes de la recogida en tubo contiendo EDTA. 4. Mezclar 9 partes de sangre con 1 parte de citrato o 3 ml de sangre y 1 gota de Trombstab (Labtest Ref. 45). Homogeneizar 3 o 4 veces por inversión suave. 5. En pacientes que presentan un hematocrito mayor a 55% la relación entre los volúmenes de sangre y de anticoagulante debe ser ajustada para garantizar la exactitud del resultado. Para calcular el volumen de anticoagulante necesario en función del hematocrito y del volumen de sangre, utilizar la siguiente fórmula: Volumen de anticoagulante (ml) = 0,00185 x volumen de sangre (ml) x (100 - hematocrito) Ejemplo. Para un hematocrito de 60% usar 0,22 ml de citrato y completar a 3,0 ml con sangre. Para usar Trombstab (Labtest Ref. 45), adicionar 2 gotas a 0,5 ml de agua y usar en la proporción indicada por el cálculo. 6. Centrifugar hasta 1 hora después de la recogida a 3000 rpm o a 1500 g durante 15 minutos. No es necesario remover el plasma del tubo. Mantener el tubo tapado hasta la realización del examen para evitar cambios del ph de la muestra que pueden interferir en los resultados. 7. Mantener las muestras entre 2-24º C y realizar la determinación de la concentración de fibrinógeno hasta 4 horas después de la recolección. En caso de que exista posibilidad de congelamiento rápido, el plasma, separado de las células, puede ser congelado a 20º C negativos por 2 semanas o a 70º C negativos por 6 meses. Se sugiere congelar el material en alícuotas de 0,5 ml y, para evitar la evaporación del material durante el período de almacenamiento, utilizar frascos adecuados para congelamiento ( criotubos ). Las muestras deben ser descongeladas rápidamente a 37º C y ensayadas inmediatamente. 8. La presencia de coágulos implica el rechazo de la muestra. Las muestras de sangre deben ser consideradas como potencialmente infecciosas. Por lo tanto, al manipularlas se deben seguir las normas establecidas para bioseguridad. Para descartar los reactivos y el material biológico, sugerimos aplicar las normas locales, estatales o federales de protección ambiental. Interferencias Muestras ictéricas, lipémicas y hemolisadas pueden modificar los resultados de modo imprevisible. Procedimiento 2 El siguiente procedimiento se aplica a la técnica manual. El reactivo puede ser empleado para la determinación del fibrinógeno utilizando equipos automáticos y semiautomáticos. Se recomienda seguir exactamente las instrucciones de operación propuestas por los fabricantes. 02 Español - Ref.: 506

3 Atención. R1 (Tampón) debe ser bien mezclado antes de preparar las diluciones. Curva de calibración. Preparar diluciones del Plasma Referencia de acuerdo con la siguiente tabla: 1. Preparar diluciones 1:10 de los plasmas [ ml de muestra + 0,9 de R1(Tampón) ]. 2. Realizar el ensayo en tubos de vidrio rigurosamente limpios. 3. La temperatura del Baño de María debe estar entre 36,0 y 38,0º 4. Incubar 0,2 ml del plasma diluido por 4 a 6 minutos. R3 - Plasma Referencia Dilución Volumen (ml) 1:5 1:10 1:15 1:20 1:30 R1 - Tampón (ml) 0,4 0,9 1,4 1,9 2,9 Factor de dilución 10/5 = 2,0 10/10 = 1,0 10/15 = 0,67 10/20 = 0,5 10/30 = 0,33 5. Añadir ml de R2 (Trombina bovina) no calentada y disparar simultáneamente el cronómetro. 6. Extraer el tubo, inclinarlo constantemente a intervalos menores a 1 segundo y observar la formación de un coágulo que interrumpe el movimiento del líquido. Detener inmediatamente el cronómetro y registrar el tiempo. Estimar la concentración del fibrinógeno, utilizando la curva de calibración. La dilución 1:10 del R3 (Plasma Referencia) representa el 100% de la concentración designada para el mismo. Los factores de dilución indicados en la tabla de arriba representan la relación entre la dilución 1:10 del R3 (Plasma Referencia) y las otras diluciones. Medir, por duplicado, los tiempos de coagulación de cada dilución del R3 (Plasma Referencia) con exactitud de una décima ( segundos) y obtener el promedio de los tiempos. Construir un gráfico en un papel loglog aplicando los valores de concentración en el eje x (abscisa) y los tiempos de coagulación en el eje y (ordenadas). Para obtener los valores de concentración de pacientes y controles, leer los resultados directamente en la curva de calibración. Ejemplo. Concentración de fibrinógeno en el plasma de referencia: 304 mg/dl R3 - Plasma Referencia Dilución Volumen (ml) R1 - Tampón (ml) Factor de dilución Fibrinogênio (mg/dl) Tiempo en (segundos) 1:5 0,4 10/5 = 2,0 304 x 2 = ,0 1:10 0,9 10/10 = 1,0 304 x 1 = ,0 1:15 1,4 10/15 = 0, x 0,67 = ,0 1:20 1,9 10/20 = 0,5 304 x 0,50 = ,5 1:30 2,9 10/30 = 0, x 0,33 = ,8 100,0 CURVA DE CALIBRACIÓN Tiempo (segundos) 10,0 1, Fibrinogênio (mg/dl) 03 Español - Ref.: 506

4 Rastreabilidad. La concentración de fibrinógeno presente en el Plasma de Referencia Ref es trazable a la World Health rd Organization (WHO) - 3 INTERNATIONAL STANDARD FIBRINÓGENO PLASMA - 09/264 Desempeño del sistema. El resultado del paciente y del control solamente deben ser leídos en la curva de calibración si el tiempo en segundos estuviera contenido entre el menor y el mayor tiempo de coagulación en la curva de calibración. Si el tiempo de coagulación de la muestra es menor que el tiempo de coagulación de la dilución 1:5 de la curva de calibración, repetir el ensayo diluyendo la muestra 1:30, leer el resultado en la curva de calibración y multiplicarlo por 3. Cuando el tiempo de coagulación de la muestra es mayor que el tiempo de coagulación de la dilución 1:30 de la curva de calibración, repetir el ensayo diluyendo la muestra 1:3, leer el resultado en la curva de calibración y multiplicarlo por 0,3. No utilizar una dilución inferior a 1:3 porque la presencia de interferentes puede producir resultados inexactos. Si el tiempo de coagulación de la dilución 1:3 es mayor que el mayor tiempo de coagulación de la curva de calibración, el resultado debe ser reportado como menor que la menor concentración de la curva de calibración. Sensibilidad. La sensibilidad del sistema se define por la dilución 1:30 empleada en el plasma de referencia utilizado en la calibración. Por ejemplo. Plasma Referencia: 300 mg/dl de fibrinógeno La sensibilidad para el sistema. 100 mg/dl Control interno de la calidad. El laboratorio debe mantener un programa de control interno de calidad que defina claramente: regulaciones aplicables, objetivos, procedimientos, criterios para especificaciones de calidad y límites de tolerancia, acciones correctivas y registro de las actividades. Se deben usar materiales de control para evaluar la imprecisión y desvíos de la calibración. Se sugiere utilizar las 6 especificaciones CLIA para el cálculo del error total. Intervalo de referencia. Los intervalos deben ser usados solo como orientación. Se recomienda que cada laboratorio establezca, en la población atendida, sus propios intervalos de referencia. Fibrinógeno. 150 a 350 mg/dl Conversión. Unidades convencionales (mg/dl) x 0,01 = Unidades SI (g/l). Características de desempeño 7 Estudios de comparación. El método propuesto fue comparado con un método similar, obteniéndose los siguientes resultados: Método Comparativo Método Labtest Número de muestras Fibrinógeno (mg/dl) Media de las estimativas (mg/dl) Ecuación da regresión Coeficiente de correlación Método Labtest = 0,966 x Método Comparativo + 16,66 0,996 Utilizando la ecuación de regresión, el error sistemático total estimado para una concentración de 150 mg/dl es igual al 7,8% y para una concentración de 300 mg/dl es igual al 2,2%. Estudios de precisión. Los siguientes resultados fueron obtenidos en los estudios de precisión: Repetitividad - imprecisión intra-ensayo Muestra 1 Muestra 2 Evaluación del error total. El error total (error aleatorio + error sistemático) estimado para una concentración de 150 mg/dl es igual al 16,1% y para una concentración de 300 mg/dl es igual al 7,3%. Los resultados indican que el método cumple con la especificación CLIA 6 para el error total (20,0%). Significado clinico 2,8. n Media Reproducibilidad - imprecisión total Muestra 1 Muestra 2 n 5 5 Media DP 4,17 6,80 DP 6,72 7,52 CV (%) 2,86 2,38 CV (%) 4,28 2,60 En la deficiencia congénita de fibrinógeno ocurre una disminución en su síntesis y el proceso de la coagulación no completa su fase final porque no se produce la conversión de fibrinógeno en fibrina. Aunque no haya formación de fibrina, el sangrado en pequeños vasos es minimizado por vaso-constricción y formación de trombo plaquetario. Tampoco ocurre alteración en el sangrado menstrual. La disfunción muchas veces se manifiesta al nacer por sangrado del cordón umbilical y se asemeja clínicamente a la deficiencia del factor VIII (hemofilia A) siendo, sin embargo, menos grave porque no ocurren hemartrosis como en la hemofilia. Los episodios hemorrágicos pueden darse como consecuencia de traumatismos, sea en articulaciones o tejidos blandos. Los ensayos que dependen de la formación de fibrina como el tiempo de coagulación, tiempos de protrombina y trombina se ven alterados y la determinación de fibrinógeno revela cantidades muy reducidas o ausencia completa del analito. La deficiencia adquirida de fibrinógeno puede ocurrir por coagulación intravascular diseminada (CID) siendo muy común durante o inmediatamente al parto y se manifiesta por hemorragia generalizada e incoagulabilidad de la sangre. Las causas más frecuentes son desprendimiento prematuro de la placenta, embolia por líquido amniótico y retención del feto muerto. La CID también se da en las neoplasias, destrucción de órganos internos (pancreatitis aguda necrohemorrágica), sepsis (30-40%), insuficiencia hepática grave, reacciones anafilácticas graves, traumas (politraumas, traumas neurológicos, traumas con embolia grasosa) y anormalidades vasculares. La determinación de fibrinógeno utilizando el tiempo de trombina es un buen indicador de la deficiencia de fibrinógeno en esas patologías. El fibrinógeno puede también estar disminuido en la cirrosis y colestasis hepáticas. 04 Español - Ref.: 506

5 Como el fibrinógeno es una proteína de fase aguda, puede aumentar en las primeras 12 horas que siguen al inicio de un proceso inflamatorio. Valores continuadamente elevados de fibrinógeno están relacionados con riesgo elevado de trombosis arterial y venosa (estado pre-trombótico o estado de hipercoagulabilidad) y pueden ser un factor independiente de riesgo para la enfermedad arterial coronaria. Observaciones 1. La limpieza y secado adecuados del material utilizado son factores fundamentales para la estabilidad de los reactivos y obtención de resultados correctos. 2. El agua utilizada en el laboratorio debe tener la calidad adecuada a cada aplicación. Así, para preparar reactivos y usar en las mediciones, debe tener resistividad 1 megaohm o conductividad 1 microsiemen y concentración de silicatos < mg/l (agua tipo II). Para el enjuague del material de vidrio el agua puede ser del tipo III, con resistividad megaohms o conductividad 10 microsiemens. En el enjuague final, utilizar agua tipo II. Cuando la columna desionizadora está con su capacidad saturada produce agua alcalina con liberación de varios iones, silicatos y substancias con gran poder de oxidación o reducción que deterioran los reactivos en pocos días o incluso horas, alterando los resultados de modo imprevisible. Por ello es fundamental establecer un programa de control de la calidad del agua. 3. Para una revisión de las fuentes fisiopatológicas y medicamentosas de interferencia en los resultados y en la metodología se sugiere consultar Referencias 1. Clauss A. Acta Haemat 1957;17: NCCLS. Procedure for the determination of fibrinógeno in plasma; Approved guideline - Second edition. NCCLS Document H30-A2, International Committee for Standardization in Hematology.Thromb Haemostas 1976;36: NCCLS. Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture; Approved Standard-Fifth Edition. NCCLS document H3-A5, CLIA Requirements for Analytical Quality. Disponible en < 7. Labtest: Datos de archivo. 8. Leavell BS, Thorup, Jr AO. Fundamentals of Clinical Hematology. 2a. edição, WB Saunders Co:Philadelphia, Presentación Producto Referencia Contenido Fibrinogen 506-4/2 Informaciones al consumidor [Términos y Condiciones de Garantía] 1 x 100 ml 4 x 2 ml 1 x 1 ml Labtest Diagnóstica garantiza el desempeño de este producto, dentro de las especificaciones, hasta la fecha de expiración indicada en los rótulos, siempre que los cuidados de utilización y almacenamiento indicados en los rótulos y en estas instrucciones, sean seguidos correctamente. Labtest Diagnóstica S.A. CNPJ: / Av. Paulo Ferreira da Costa, Vista Alegre - CEP Lagoa Santa. Minas Gerais Brasil - Customer Service customerservice@labtest.com.br Edición: Julio, 2016 Ref.: Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reproducción bajo previa autorización 4. NCCLS. Collection, Transport, and Processing of Blood Specimens for Testing Plasma-Based Coagulation Assays; Approved Guideline - Fourth Edition. NCCLS document H21-A4, Español - Ref.: 506

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