LDH Liquiform. 01 Español - Ref.: 86. Ref.:86. Instrucciones de Uso
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- Felisa Acosta Vera
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1 LDH Liquiform Instrucciones de Uso Ref.:86 Finalidad Sistema para la determinación de la Deshidrogenasa Láctica (LDH) en suero por método cinético. [Solamente para uso diagnóstico in vitro] Principio. La actividad de la LDH se determina de acuerdo con la siguiente reacción: Piruvato + NADH + H LDH Características del sistema. Lactato + NAD La LDH cataliza la conversión del piruvato a lactato en presencia de NADH. La disminución de la absorbancia a 340 nm debido a la oxidación del NADH es proporcional a la actividad de la LDH en la muestra. La LDH está presente prácticamente en todos los órganos y tejidos del organismo y su actividad catalítica en el suero se debe a la presencia de varias isoenzimas que pueden formar patrones diferentes dependientes del origen de la LDH presente en el suero. Por este motivo, las condiciones de la reacción fueron seleccionadas para obtener una relación adecuada entre la medición de la actividad y la concentración catalítica del patrón isoenzimático, a fin de minimizar las diferencias producidas por el comportamiento de las isoenzimas, obteniéndose velocidad máxima y reacción lineal en un intervalo amplio de la actividad enzimática. Como resultado de la optimización, hay una pequeña sensibilidad a las variaciones del ph, de la molaridad y del volumen de la muestra. La elección de la dirección de la reacción piruvato-lactato es ventajosa porque proporciona buena estabilidad del reactivo y mayor velocidad de la reacción. Las sustancias utilizadas en la reacción se encuentran distribuidas adecuadamente en dos reactivos para ofrecer mayor estabilidad en la forma líquida original y mantenimiento de las condiciones óptimas de la reacción, permitiendo la utilización directa de los reactivos en sistemas automáticos. La metodología monorreactivo puede ser aplicada utilizando un Reactivo de Trabajo estable por 10 días bajo refrigeración, obteniéndose un desempeño adecuado aún en situaciones de baja demanda de ensayos. El sistema también permite preparar el volumen de Reactivo de Trabajo necesario para una única medición de la actividad enzimática de la LDH. El sistema "LDH Liquiform" utiliza la medición en modo cinético y puede ser fácilmente aplicado en analizadores automáticos y semi-automáticos capaces de medir absorbancia a 340 nm. Metodología. Reactivos Material necesario y no suministrado Piruvato-Lactato. Reactivo 1 - Conservar entre - 8 ºC. Contiene: NADH 360 µ mol/l y azida sódica 0,095%. Reactivo - Conservar entre - 8 ºC. Contiene: tampón 50 mmol/l, ph 7,5; piruvato de sodio 6 mmol/l y azida sódica 0,095%. Los reactivos no abiertos, cuando almacenados en las condiciones indicadas, son estables hasta la fecha de expiración impresa en el rótulo. Durante su manipuleo están sujetos a contaminaciones de naturaleza química y microbiana que pueden provocar reducción de las estabilidades. Precauciones y cuidados especiales Un indicio de deterioro del Reactivo de Trabajo es cuando su absorbancia, medida contra agua a 340 nm, es menor que 0,800 o cuando se muestre turbio o con señales de contaminación. Se deben aplicar los cuidados habituales de seguridad en la manipulación de los reactivos. Los reactivos contienen azida sódica, que es tóxica. Se debe tomar cuidado para evitar la ingestión y en caso de contacto con ojos y piel, se debe lavar inmediatamente con gran cantidad de agua y buscar auxilio médico. La azida puede formar compuestos altamente explosivos con las tuberías de plomo y cobre. Utilizar grandes volúmenes de agua para descartar los reactivos. Fotómetro con cubeta termostatizada, capaz de medir con exactitud absorbancia a 340 nm. Pipetas para dispensar muestras y reactivos. Cronómetro. Muestra Debe utilizarse suero. Separar el suero hasta 1 hora después de la extracción. No utilizar muestra con hemólisis. La actividad enzimática es estable por 4 días entre 15-5 ºC. La variación biológica intraindividual de LDH medida en muestras recogidas con una diferencia mínima de una semana és igual a 8,6%. Como ninguna prueba conocida puede asegurar que muestras de sangre no transmitan infecciones, todas deberán ser consideradas como potencialmente infectivas. Por lo tanto, al manipularlas, se deben seguir las normas establecidas para bioseguridad. 01 Español - Ref.: 86
2 Para deshacerse de los reactivos y del material biológico sugerimos aplicar las normativas locales, regionales o nacionales de protección ambiental. Valores de bilirrubina mayores de 10 mg/dl producen resultados falsamente elevados. Valores de triglicéridos mayores de 1800 mg/dl producen valores falsamente disminuidos. Muestras con hemólisis no deben ser utilizadas porque se obtienen resultados falsamente elevados. Preparo del reactivo de trabajo. El conjunto de un frasco de Reactivo 1 y un frasco de Reactivo permite preparar el Reactivo de Trabajo. Transferir el contenido de un frasco de Reactivo a un frasco de Reactivo 1 y homogeneizar por inversión. Anotar la fecha de expiración. El Reactivo de Trabajo es estable 1 día entre 15-5 ºC y 10 días entre - 8 ºC, cuando no hubiera contaminación química microbiana. Para preservar su desempeño los reactivos deben permanecer fuera de la heladera solo el tiempo necesario para obtener el volumen que será utilizado. Evitar la exposición a la luz solar directa. Identificar el frasco de Reactivo de Trabajo para evitar confusión com otros frascos de Reactivo 1. Opcionalmente, se puede preparar un menor volumen del Reactivo de Trabajo, utilizando la proporción de 4 volúmenes de Reactivo 1 y 1 (un) volumen de Reactivo. El Reactivo de Trabajo contiene: tampón ph 7,5; piruvato de sódio 1, mmol/l; NADH 300 µ mol/l y azida sódica 0,095%. Ver Observaciones 1, y En un tubo rotulado Test, pipetear 1,0 ml de Reactivo de Trabajo. Adicionar 0,00 ml de muestra, homogeneizar y transferir inmediatamente a una cubeta termostatizada a 37 ± 0, ºC. Incubar 1 minuto. 3. Interferencias Procedimiento Hacer una lectura de la absorbancia inicial (A 1), disparando simultáneamente el cronómetro. Repetir la lectura después de minutos (A ). Para verificar la linealidad de la reacción, hacer también una lectura com intervalo de 1 minuto y verificar si la diferencia de absorbancia por minuto es constante. Calcular la A/minuto, restando A de A y dividiendo por. 1 Si la absorbancia inicial (A 1) es igual o menor que 0,800 es un indicativo de que la muestra tiene actividad elevada de la LDH. En este caso, diluir la muestra y repetir la medición (ver Linealidad). Los fotómetros semi-automáticos pueden dar el mensaje: sustrato agotado. El procedimiento sugerido para la medición es adecuado para fotómetros cuyo volumen mínimo de solución para lectura es igual o mayor que 1,0 ml. Se debe hacer una verificación de la necesidad de ajuste del volumen para el fotómetro utilizado. Los volúmenes de muestra y reactivo pueden ser modificados proporcionalmente sin perjuicio para el desempeño de la prueba manteniéndose lo cálculo inalterado. Volúmenes de muestra menores a 0,01 ml son críticos en aplicaciones manuales y deben ser utilizados con cuidado porque aumentan la imprecisión de la medición. Cálculos. Vea linealidad. Es práctica habitual calcular los resultados de la actividad enzimática utilizando un factor obtenido en condiciones óptimas de reacción las que incluyen: Longitud de onda: 340 nm ± 0, nm. Cubeta termostatizada a 37 ± 0, ºC con 1,0 cm de espesor de solución. Ancho medio de banda 8 nm. Luz espuria 0,1 %. Como en la mayoría de las veces no es posible trabajar bajo estas condiciones, las buenas prácticas de laboratorio recomiendan realizar la calibración del ensayo utilizando un calibrador de enzimas indicado por el fabricante del reactivo. Labtest recomienda la línea Calibra para calibración del sistema LDH Liquiform. A Test = (A - A )/ Actividad de la Desidrogenasa Láctica = A Test x 8095 El factor 8095 fue obtenido en las condiciones propuestas arriba. Calcular nuevamente el factor cuando se haga cualquier modificación en un de los parámetros utilizados para calcular el factor. Vea método para cálculo del factor. Ejemplo A1 Test = 1,40 A Test = 1,30 A Test = (1,40-1,30)/ = 0,059 Actividad de la Desidrogenasa Láctica (U/L) = 0,059 x 8095 = 478 Factor = VT x 1000 ε x VA x d VT = volumen total del ensayo (1,0 ml) VA = volumen de muestra (0,0 ml) 1000 = conversión de U/mL para U/L d = camino óptico de la cubeta (1 cm) ε = Absortividad milimolar del NADH (6,30) Ejemplo 1 Método para cálculo del factor 1,0 x 1000 Factor = = ,30 x 0,0 x 1 Calibracion. La absortividade milimolar del NADH es utilizada como sistema de referencia para la calibracion del ensayo. La calibracion del fotómetro utilizado es rastreable al Standard Reference Material (SRM) 931 del National Institute of Standards and Technology (NIST). 0 Español - Ref.: 86
3 Calibraciones manuales: Verificar el factor de calibracion cuando el instrumento sea sometido al mantenimiento o en las modificaciones de aplicación. Sistemas automáticos Blanco de reactivo: agua o solución de NaCl 150 mmol/l (0,85%); Usar de la linea Calibra - Labtest. La actividade del LDH en estos calibradores son trazables a la absortividade milimolar del NADH. Intervalos de calibración Calibración de o 3 puntos al cambiar de lote; Calibración de o 3 puntos cuando el control de calidad interno lo indique. Linealidad El resultado de la medición es lineal hasta 000 U/L. Para valores más altos, diluir la muestra con solución fisiológica, realizar una nueva determinación y multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución. Control interno de la calidad. El laboratorio debe mantener un programa de control interno de calidad que defina con claridad los reglamentos aplicables, objetivos, procedimientos, criterios para especificaciones de la calidad y límites de tolerancia, acciones correctivas y registro de las actividades. Controles deben ser utilizados para evaluar la imprecisión e desviaciones de calibración. Se sugiere que las especificaciones para el coeficiente de variación máximo y el error 6,7,8 total sean basados en los componentes de la variación biológica (VB). Se sugiere utilizar los sueros controles de la línea Qualitrol de la Labtest para el control interno de la calidad en ensayos del laboratorio clínico. Intervalo de referencia. Los intervalos deben ser usados sólo como orientación. Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango de valores de referencia en la población atendida. Suero o Plasma Adultos: 00 a 480 U/L Conversión: Unidades Convencionales (U/L) x 0,0167 = Unidades SI ( µ kat/l) Características del desempeño Exactitud. 1 a 3 años 4 a 9 años 10 a 13 años En dos muestras con concentraciones de LDH iguales a 0 y 480 U/L se añadieron cantidades diferentes de enzima, obteniéndose recuperaciones de entre el 97 y el 107%. El error sistemático proporcional medio, obtenido en un valor de 500 U/L, fue igual a 10,0 U/L ó,0%. Especificidad. 9 Niños y e Adolescentes (U/L) El método propuesto fue comparado con un método similar utilizando 40 muestras con valores situados entre 177 y 1944 U/L. La comparación resultó en la ecuación de regresión y = 1,03x - 17,6 y un coeficiente de correlación r = 0,999. El error sistemático total (constante y proporcional) verificado en el nivel de decisión (500 U/L) fue igual a 6,1 U/L ó 1,% a a a 500 Como las muestras fueron seleccionadas aleatoriamente en pacientes ambulatorio y pacientes hospitalizados, se puede inferir que el método tiene una especificidad metodológica adecuada. Repetitividad - Imprecisión intra-ensayo Muestra 1 Muestra Sensibilidad metodológica. Una muestra proteica que no contenía LDH fue utilizada para calcular el límite de detección del ensayo habiéndose encontrado un valor igual a 8,9 U/L, equivalente a la media de 0 ensayos más dos desviaciones estándares. Utilizándose la absorbancia mínima detectable como parámetro, el límite de detección fotométrica es 8,1 U/L, correspondiendo a una diferencia de absorbancia igual a 0,001. Efectos de la dilución de la matriz. Dos muestras con valores iguales a 1077 y 1333 U/L fueron utilizadas para evaluar la respuesta del sistema en las diluciones de la matriz con solución fisiológica. Usando factores de dilución que variaron de a 8 se hallaron recuperaciones de entre un 10 al 109%. Significado clinico. Niveles séricos elevados de LDH se observan en una variedad de condiciones. Los valores más elevados se encuentran en pacientes con anemia megaloblastica, carcinomas, shock grave y delirium tremens. Elevaciones moderadas ocurren en pacientes con infarto de miocardio, infarto pulmonar, anemia hemolítica, leucemia, mononucleosis infecciosa y en los pacientes con distrofia muscular progresiva. Ligeras elevaciones se encuentran en pacientes con hepatitis aguda, en las ictericias obstructivas y en la cirrosis. También la LDH se usa como un marcador de hemólisis intra-vascular. Niveles aumentados se observan en la mayoría de los pacientes con infarto de miocardio. Aunque el grado de elevación no sea tan grande como el de la CK, ella persiste por 10 a 14 días. La separación de las isoenzimas es de gran valor para el diagnóstico del infarto del miocardio. Una relación LDH 1 / LDH mayor que 1 es un dato seguro para el diagnóstico del infarto de miocardio. Recordamos qué en la anemia megaloblastica la relación LDH / LDH es también mayor que 1. La mayoría de los pacientes con infarto pulmonar tienen niveles aumentados de la LDH generalmente dentro de las 4 horas del inicio del dolor. El hallazgo de CK total y CK-MB en los valores de referencia, y niveles elevados de LDH dentro de 1 a días después de un episodio de dolor toráxico es una fuerte evidencia de infarto pulmonar. Observaciones 1. N 0 0 Valor Medio Reproducibilidad - Imprecisión total Muestra 1 Muestra N Valor Medio DS 3,6 9,5 DS 14,8 33,5 CV (%) 1,0 1,35 CV (%) 4,78 4,71 La limpieza y secado del material utilizado son factores fundamentales para la estabilidad de los reactivos y obtención de resultados correctos. 03 Español - Ref.: 86
4 . El laboratorio clínico tiene como objetivo fornecer resultados exactos y precisos. La utilización de agua de calidad inadecuada es una causa potencial de errores analíticos. El agua utilizada en el laboratorio debe tener la calidad adecuada para cada aplicación. Así, para preparar reactivos y usar en las mediciones y para su uso en enjuague final de la vidrería, debe tener resistividad 1 megaohm.cm o conductividad 1 microsiemens/cm y concentración de silicatos <0,1 mg/l. Cuando la columna desionizadora está con su capacidad saturada, se produce agua alcalina con liberación de varios iones, silicatos y sustancias con gran poder de oxidación o reducción que deterioran los reactivos en pocos días o incluso horas, alterando los resultados de modo imprevisible. Por lo cual es fundamental establecer un programa de control de la calidad del agua. 3. Como ocurre en toda reacción enzimática, la rigurosa observacióndel tiempo y de la temperatura de incubación es de grande importancia para la calidad de los resultados obtenidos. 4. Para una revisión de las fuentes fisiopatológicas y medicamentosas de interferencia en los resultados y en la metodologia, se sugere consultar: < Referencias 1. Bergmeyer HU. Methods of Enzimatic Analisys, 3 ed, vol 3, Deerfiled Beach: Verlag Chemie, 1983: Henry RJ, Canon DC, Winkelman JW. Clinical Chemistry, Principles and Technics, nd ed. New York, Harper & Row, Inmetro - Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark eds, Rio de Janeiro, Recommendations of the German Society for Clinical Chemistry, Z.Klin.Chem.Klin.Biochem,197;10: Tonks DB Quality Control in Clinical Laboratories, Warner-Chilcott Laboratories, Diagnostic Reagents Division, Scarborough, Canada, Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular, Base de Datos de Variación Biológica. Disponível em:< ticle/ar ticleview/330/1/170> (acesso em 04/006). 7. Basques JC. Especificações da Qualidade Analítica. Labtest Diagnóstica Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem 1981;7: Meites S.: Pediatric Clinical Chemistry: Reference (Normal) Values, 3a. edição, AACC Press: Washington, 1989: Labtest: Dados de Arquivo. Presentación Producto LDH Liquiform El número de pruebas en aplicaciones automáticas depende de los parámetros de programación. Están disponibles las aplicaciones para sistemas automáticos. Informaciones al consumidor [Términos y Condiciones de Garantía] Labtest Diagnóstica garantiza el desempeño de este producto dentro de las especificaciones hasta la fecha de expiración indicada en los rótulos, siempre que los cuidados de utilización y almacenamiento indicados en los rótulos y en estas instrucciones sean seguidos correctamente. Labtest Diagnóstica S.A. Referencia 86-/ /100 CNPJ: / Av. Paulo Ferreira da Costa, Vista Alegre - CEP Lagoa Santa. Minas Gerais Brasil - Servicio de Apoyo al Consumidor sac@labtest.com.br 1 1 Contenido X 4 ml X 6 ml 1 X 80 ml 1 X 0 ml Edición: Julio, 011 Ref.: 4014 Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reproducción bajo previa autorización 04 Español - Ref.: 86
5 05 Español - Ref.: 86
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