HDL LD. 01 Español - Ref.: 128. Ref.:128. Instrucciones de Uso. Finalidad. Metodología. Reactivo. Princípio
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- Javier Belmonte Tebar
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1 HDL LD Instrucciones de Uso Ref.:128 Finalidad. Sistema para determinación cuantitativa y directa de la lipoproteína de alta densidad del colesterol (HDL) en muestras de suero y plasma. [Solamente para uso diagnóstico in vitro.] Princípio. El método está basado en una modificación de los métodos clásicos de co-precipitación utilizando cantidades optimizadas del ácido polivinil sulfónico (PVS) y polietilenoglicol metil eter (PEGME) asociados al uso de detergentes selectivos. En la primera etapa de la reacción LDL, VLDL y quilomicrones (CM), reaccionan con PVS y PEGME y la reacción resulta en inaccesibilidad del LDL, VLDL y quilomicrones para las enzimas colesterol oxidasa (CHOD) y colesterol esterasa (CHER). Después de añadirse el reactivo 2, las enzimas CHOD y CHER reaccionan específicamente con el HDL presente en las muestras, produciendo H2O2 que es detectado por la reacción de Trinder. La intensidad del color formado es directamente proporcional a la concentración de colesterol HDL en la muestra. HDL + LDL + VLDL + CM PVS / PEGME HDL + CHOD + CHER 2H O + 4-AA + TODB Características del sistema. HDL+ (LDL + VLDL + CM) PVS/PEGME Ácido graso + H O Quinoneimina + 5H O Debido a la importancia de la medición exacta del colesterol HDL, es deseable utilizar un método de referencia. El método de referencia que combina la ultracentrifugación con precipitación química para separar HDL, dosificando el colesterol con el método de Abell-Kendall es intensivo en tiempo y operaciones y posee aplicaciones limitadas en el laboratório clínico. El sistema HDL LD es un método homogéneo líquido para medición directa del colesterol HDL y consiste en un proceso sencillo, de fácil ejecución y presenta características de precisión y exactitud que cumplen los requisitos de desempeño propuestos por el Programa Nacional de 1 Educación en Colesterol (NCEP-EUA), en vigor desde La especificidad es conseguida por la acción selectiva del surfactante presente en el Reactivo 1 que resulta en inaccesibilidad del LDL, VLDL y quilomicrones para las enzimas colesterol oxidasa (CHOD) y colesterol esterasa (CHER), que reaccionarán específicamente con el colesterol HDL. Valores de triglicéridos hasta 400 mg/dl, bilirrubina hasta 40 mg/dl, bilirrubina conjugada hasta 30 mg/dl, hemoglobina hasta 1000 mg/dl y ácido ascórbico hasta 10 mm no interfieren significativamente en la reacción La flexibilidad del método lo hace facilmente aplicable en analizadores automáticos capaces de procesar reacción de punto final con dos reactivos y medición en 600 nm. Metodología. Reactivo 1. - Surfactante selectivo 1 Reactivo 1: Almacenar entre 2 y 8 ºC. Listo para uso. Contiene tampón MES ph 6,5 500 mm, TODB N,N-Bis (4-sulfobutil)-3-metilanina 50 mm, ácido polivinil sulfónico 50 g/l, polietilenoglicol metil ester 50 g/l, cloruro de magnésio 50 mm, conservante y surfactante Reactivo 2: Almacenar entre 2 y 8 ºC. Listo para uso. Contiene tampón MES ph 6,5 500 mm, colesterol esterasa 100 U/L, colesterol oxidasa 100 U/L, 4-aminoantipirina 50 mm, peroxidasa 100 U/L EDTA 10 mm, conservante y surfactante CAL Calibrador: Almacenar entre 2-8 ºC. Reactivo liofilizado. Concentración en el rótulo del frasco. Preparación que contiene colesterol HDL humano y conservante1%. Después de la reconstitución, el calibrador es estable por 7 días entre 2-8 ºC y 30 días a -20 ºC. La calibración es válida solamente para el mismo lote de reactivos y calibrador. Calibrador y reactivos de lotes diferentes no deben intercambiarse. Los reactivos no abiertos, almacenados en las condiciones indicadas, son estables hasta la fecha de caducidad impresa en el rótulo. Los Reactivos 1 y 2 mantenidos en bandeja refrigerada en el equipo son estables por 60 días. Este periodo de estabilidad puede ser modificado en función de las características y condiciones de mantenimiento del equipo. Por lo tanto, se sugiere que el control de calidad sea utilizado para monitorear el desempeño de los reactivos. Después de abiertos, los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en el rótulo, pero solamente si almacenados bien cerrados en temperatura entre 2-8 ºC y no sometidos a contaminaciones química o microbiana. Precauciones y cuidados especiales La calibración es válida solamente para el mismo lote de reactivos y calibrador. Calibrador y reactivos de lotes diferentes no deben intercambiarse. Los cuidados habituales de seguridad deben ser aplicados en la manipulación de los reactivos, los cuales no deben ser pipeteados con la boca. 01 Español - Ref.: 128
2 El Calibrador está preparado a partir de derivados de sangre humana y fue ensayado para determinar la presencia de HBsAg, anticuerpos anti-hcv y anti-hiv presentando resultados negativos. A pesar de haber sido utilizados tests validados y aprobados, ninguno de ellos puede asegurar que productos derivados de la sangre humana estén libres de agentes infectivos. Por lo tanto, los cuidados habituales de seguridad deben ser aplicados en la manipulación del producto, que no debe ser pipeteado con la boca. Se recomienda manipularlo como siendo potencialmente infectivo. Material necesario y no provisto 1. Analizador capaz de medir con exactitud absorbancia entre 560 y 600 nm. 2. Incubadora o baño-maría mantenido en temperatura constante (37 ºC) Pipetas para medir muestras, calibrador, controles y reactivos. Cronómetro. Muestra Usar suero o plasma (EDTA, citrato, heparina litio). Las muestras de suero o plasma no deben permanecer entre 15 y 30 ºC por más de 14 horas. Cuando no sea posible realizar las mediciones en hasta 14 horas después de la recolección, las muestras pueden ser almacenadas entre 2 y 8 ºC por 7 días y por 30 días a 20 ºC negativos. Cuando haya necesidad de preservación por periodos más largos, las muestras deben ser almacenadas en temperatura 70 ºC negativos. Evitar repetidos congelamientos y descongelamientos. Muestras descongeladas deben ser bien mezcladas antes de la utilización. No utilizar vórtex o similar. No usar muestras con señales de contaminación microbiana. Se debe crear un Procedimiento Operacional Estándar (POE) para la recolección, preparación y almacenamiento de la muestra. Destacamos que los errores debidos a la muestra pueden ser mucho mayores que los errores ocurridos durante el procedimiento analítico. Como ningún ensayo conocido puede asegurar que las muestras de sangre no transmitan infecciones, todas ellas deben ser consideradas como potencialmente infectivas. Por lo tanto, al manipularlas se debe seguir las normas establecidas para bioseguridad. Para descartar los reactivos y el material biológico, sugerimos aplicar las normas locales, estatales o federales de protección ambiental. Interferencias Concentraciones de bilirrubina no conjugada hasta 40 mg/dl, bilirrubina conjugada hasta 30 mg/dl, hemoglobina hasta 1000 mg/dl, ácido ascórbico hasta 10 mm y triglicéridos hasta 400 mg/dl no interfieren significativamente en la reacción. Preparo del calibrador. Añadir 1,0 ml de agua desionizada o destilada (verificar Observación no. 2) al contenido del frasco del calibrador. Reposar durante 5 minutos y homogeneizar por inversión, con suavidad, hasta completa disolución del material. Evitar la formación de espuma. Después de la reconstitución, el calibrador es estable 7 días, almacenado entre 2-8 ºC bien cerrado, cuando no hubiera contaminación química o microbiana. Estable 30 días a 20 ºC negativos cuando almacenado en recipiente apropiado para congelamiento. Para evitar congelamientos y descongelamientos repetidos, se sugiere separar el material en partes. Antes de utilizarlo, homogeneizar con suavidad. No utilizar vórtex o similar. Una vez descongelada, no congelar nuevamente. Calibración. El Calibrador es trazable al Standard Reference Material (SRM) 1951 de National Institute of Standards and Technology (NIST). Se debe utilizar calibración de 2 puntos. Intervalo de calibraciones: Cuando el control de calidad lo indique; Cuando se utilice un nuevo lote de reactivos; Cuando se utilicen nuevos frascos de reactivos de un mismo lote, en caso de que una nueva calibración haya sido realizada durante la utilización del frasco anterior. La calibración es válida solamente para el mismo lote de reactivos y calibrador. Calibrador y reactivos de lotes diferentes no deben intercambiarse. Parámetros para realización de la prueba - Sistemas Automáticos * Los volúmenes de muestra y reactivos pueden ser modificados proporcionalmente sin perjuicio para el desempeño de la prueba. En caso de reducción de los volúmenes es fundamental que se observe el volumen mínimo necesario para la medición fotométrica. Parámetros para sistemas automáticos Parámetros Tipo de Reacción λ de Onda Temperatura Calibración Modelo de la Calibración Volumen de Muestra Volumen de R1* Volumen de R2* Lectura 1 (A1) Adición de R2 Lectura 2 (A2) Aplicación Punto final 600 nm 37 ºC 2 puntos Punto 1: Blanco (agua desionizada o solución de cloruro de sodio 150 mmol/l (0,85%) Punto 2: Calibrador Ref Linear 3 µ L 225 µ L 75 µ L Después de 300 segundos de incubación a 37 ºC de R1 + Muestra Después de 300 segundos decurridos de la adición de R1 + Muestra Después de 300 segundos de incubación a 37 ºC de R1 + Muestra + R2 02 Español - Ref.: 128
3 Esquema de reacción R1: 225 µ L Muestra: 3 µ L R2: 75 µ L Colesterol HDL (mg/dl) <40 60 Bajo (deseable) 0 min 5 min 37 ºC 37 ºC 10 min Clasificación ATP III - Niños y Adolescentes 3 Colesterol Total (mg/dl) - Edad: 2 a 19 años < a Limítrofe Cálculos. A = A2 - A1 Ver ítem Intervalo Operativo Concentración de A muestra - A blanco X Calibrador Colesterol HDL en la muestra : (mg/dl) A calibrador - A Blanco Intervalo operativo. La reacción es linear entre 1,06 y 184,8 mg/dl. Para concentraciones superiores a 184,8 mg/dl, diluir la muestra con NaCl 150 mmol/l (0,85%), realizar nueva determinación y multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución. Controle interno de calidad. El laboratorio debe mantener un programa de control interno de calidad que defina claramente los reglamentos aplicables, objetivos, procedimientos, criterios para especificaciones de calidad y límites de tolerancia, acciones correctivas y registro de las actividades. Deben utilizarse materiales de control para monitorear la imprecisión de la medición y los desvíos de la calibración. Se recomienda utilizar las preparaciones estalizadas de la Línea Qualitrol de Labtest para control interno de calidad en ensayos de química clínica. Valores deseables o recomendados. Los valores a continuación sustituen los valores de referencia y fueron determinados a partir de datos epidemiológicos tratados estadísticamente, que relacionan las concentraciones del colesterol con la prevalencia de Dolencia Coronariana Isquémica (DCI). Clasificación ATP III - Adultos 2 Colesterol Total (mg/dl) < Colesterol LDL (mg/dl) < A1 (600 nm) Umbral elevado Óptimo Umbral óptimo Umbral elevado Muy elevado A2 (600 nm) Colesterol LDL (mg/dl) - Edad: 2 a 19 años < Colesterol HDL (mg/dl) - Edad: <10 años 40 Características de desempeño Estudios de comparación de métodos. La exactitud del método fue verificada por comparación con el método semejante disponible en el mercado, habiéndose obtenido los siguientes resultados: Número de muestras Media (mg/dl) Ecuación de regresión Coeficiente de correlación Utilizando la ecuación de regresión, el error sistemático (bias) estimado es igual a - 3,72% para el nivel de 55 mg/dl y - 0,41% para el nivel de 90 mg/dl. Estudios de precisión. Los estudios de precisión fueron realizados utilizándose tres muestras nativas. 4 Método Comparativo Limítrofe Colesterol HDL (mg/dl) - Edad: 10 a 19 años 35 HDL LD ,74 72,62 HDL LD = 1,048* (Método comparativo) - 4,69 mg/dl 0,987 Repetitividad - Imprecisión intra-ensayo Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 N Media (mg/dl) DE CV (%) 80 29,0 0,3 1, ,0 0,41 0, ,6 0,84 0,9 03 Español - Ref.: 128
4 Reproducibilidad - Imprecisión total Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 La imprecisión encontrada cumple con la especificación del NCEP-EUA que es 4,0%. El error total ( error aleatorio + error sistemático) estimado es igual a 8,01% para el nivel de 55 mg/dl y 4,03% para el nivel de 90 mg/dl. Los resultados indican que el método cumple con la especificación del NCEP-EUA para error total ( 12,0%). Sensibilidad metodológica. N Media (mg/dl) Una muestra que no contiene colesterol HDL fue utilizada para calcular el límite de detección del ensayo, habiéndose encontrado un valor igual a 1,06 mg/dl, equivalente a un promedio de 12 pruebas más tres desviaciones estándar. Efectos de la dilución de la matriz. DE CV (%) 80 29,0 0,65 2, ,0 1,36 2, ,6 2,02 2,2 Una muestra de concentración igual a 184,8 mg/dl fue utilizada para evaluar la respuesta del sistema en las diluciones de la matriz con NaCl 150 mmol/l (0,85%). Utilizando factores de dilución de 2 y 4 se encontró un promedio de recuperación igual a 102,08 %, que corresponde a un error sistemático promedio igual a 2,08%. Significancia clínica. Existen fuertes evidencias de que el colesterol es un factor de riesgo directo para la Dolencia Coronaria Isquémica (DCI). Estudios retrospectivos y prospectivos demuestran claramente una interrelación curvilineal entre los niveles del colesterol sérico, más específicamente el colesterol LDL, y la prevalencia de DCI. En 1977 se demostró que el colesterol HDL tiene un efecto protector contra la prevalencia de la DCI. Los estudios de Framinghan muestran de modo inequívoco que los niveles del colesterol HDL son inversamente proporcionales a la prevalencia de la DCI. Esta relación inversa es claramente percibida en la tabla de valores deseables o recomendados. Las concentraciones del colesterol en las fracciones LDL y VLDL y en la fracción HDL dependen de metabolismos distintos y no se debe intentar buscar una correlación entre sus valores de concentración. Cuando la columna desionizadora está con su capacidad saturada ocurre liberación de varios iones, silicatos y sustancias con gran capacidad de oxidación y reducción que deterioran los reactivos en pocos días o incluso en horas, modificando los resultados de forma imprevisible. Por ello es fundamental establecer un programa de control de calidad del agua. Referencias 1. Bachorik PS, Ross JW. Clin Chem 1995;41: Executive Summary of the Third report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III). JAMA 2001;285: Leite PF, Martinez TLR, Halpern A, Cendoroglo MS, Novazzi JP, Fonseca FAH, Dias JCA. Riesgo cardiovascular: factores metabólicos y nutricionales: diagnóstico y tratamiento. São Paulo: Loyola, p Labtest: Datos de Archivo. Presentación Producto HDL LD Referencia 128-1/80 *El número de pruebas en aplicaciones automáticas depende de los parámetros de programación de cada equipo. Informaciones al consumidor [Términos y Condiciones de Garantia] Contenido 1 1 X 60 ml 2 1 X 20 ml 1 X 1,0 ml Labtest Diagnóstica garantiza el desempeño de este producto dentro de las especificaciones hasta la fecha de caducidad indicada en los rótulos, siempre que los cuidados de utilización y almacenamiento indicados en los rótulos y en estas instrucciones sean seguidos correctamente. CAL Observaciones 1. La limpieza y el secado adecuados del material utilizado son factores fundamentales para la estabilidad de los reactivos y obtención de resultados correctos. 2. El laboratorio clínico tiene por objetivo proveer resultados exactos y precisos. La utilización de agua de calidad inadecuada es una causa potencial de errores analíticos. El agua utilizada en el laboratorio debe tener la calidad adecuada para cada aplicación. Así, para preparar reactivos, utilizar en mediciones y para el uso en el enjuague final de la vidriería, el agua debe tener resistividad 1 megaohm.cm o conductividad 1 microsiemens/cm y concentración de silicatos <0,1 mg/l. Labtest Diagnóstica S.A. CNPJ: / Av. Paulo Ferreira da Costa, Vista Alegre - CEP Lagoa Santa. Minas Gerais Brasil - Servicio de Apoyo al Consumidor Revisión: Marzo, 2013 Ref.: sac@labtest.com.br Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reproducción bajo previa autorización 04 Español - Ref.: 128
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