HOMOCISTEÍNA. 01 Español - Ref.: 130. Ref.:130. Instrucciones de Uso
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- Juan Parra Marín
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1 HOMOCISTEÍNA Instrucciones de Uso Ref.:130 Finalidad. Sistema para determinación cuantitativa de homocisteína (Hcy) en muestras de suero y plasma por reacción enzimática, en modo cinético. [Solamente para uso diagnóstico in vitro.] Principio. La homocisteína oxidada presente en el plasma es reducida por la tris (2- carboxietil)fosfina (TCEP) resultando homocisteína libre, que reacciona con el co-sustrato, S-adenosil-metionina (SAM) catalisada por la homocisteína-metil-transferasa formando metionina y S-adenosilhomocisteína (SAH). La SAH es hidrolisada a adenosina y homocisteína por la SAH-hidrolasa. La homocisteína formada es la misma proveniente de la muestra, permitiéndola realizar nuevamente la reacción catalisada por la homocisteína-metil-transferasa. De esta forma, la reacción cíclica permite la amplificación de la respuesta del sistema. La adenosina formada por la hidrólisis de la SAH sufre acción de la adenosina deaminasa (ADA) y es inmediatamente transformada en inosina y amonia, siendo de pronto consumida por la glutamato desidrogenasa (GLDH), en presencia de 2-oxiglutarato. La oxidación de NADH a NAD y consecuente reducción de la densidad óptica en 340 nm es proporcional a la concentración de Hcy presente en la muestra. Características del sistema. El reactivo Homocisteína - Labtest fue desarrrollado utilizando metodología enzimática cíclica, que promueve amplificación de la respuesta del sistema, lo que resulta en un aumento de la sensibilidad del ensayo. Los componentes de la reacción se encuentran distribuidos en 2 reactivos, listos para uso. El reactivo posee gran especificidad analítica y es de sencilla aplicación en analizadores automáticos, capaces de medir absorbancias a 340 nm. Metodología. Enzimática cíclica. Reactivos 1. -Reactivo 1 - Almacenar entre 2-8 ºC. Listo para uso. Contiene tampón triscina 25 mm, ph 9,2; S-adenosil-metionina 0,1M; NADH 0,2 mm; tris (2- carboxietil)fosfina (TCEP) 0,5 mm; 2-oxiglutarato 5,0 mm y azida sódica 0,1% Reactivo 2 - Listo para uso. Almacenar entre 2-8 ºC. Contiene tampón triscina 50 mm, ph 7,4; 1-3 glutamato desidrogenasa 5,0 KU/L; SAH-hidrolasa 3,0 KU/L, adenosina deaminasa 5,0 KU/L; Hcy-metil-transferasa 5,0 KU/L y azida sódica 0,1%. Hcy-oxidada Agente reductor TCEP Hcy Los reactivos no abiertos, almacenados en las condiciones indicadas, son estables hasta la fecha de caducidad impresa en el rótulo. Después de abiertos, los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en el rótulo, únicamente si almacenados bien cerrados en temperatura entre 2-8 ºC y no sometidos a contaminaciones de naturaleza química o microbiana. Hcy + SAM Hcy-metil-transferasa SAH + metionina Los reactivos deben estar límpidos. Caso el reactivo presentar turbamiento o absorbancia inicial menor que 0,5 en 340 nm (trayecto óptico de 0,6 cm) se debe desecharlo. SAH-hidrolasa Precauciones y cuidados especiales Se sugiere insertar, en el protocolo de los instrumentos automáticos, un lavado adicional de las sondas de reactivos tras la realización de este ensayo, con la finalidad de reducir la contaminación de otros reactivos debido al arrastre. adenosina ADA Inosina + NH + 2-oxiglutarato 3 GLDH glutamato La existencia de burbujas en los reactivos y/o en las muestras (calibradores, controles y muestras de pacientes) durante la ejecución del ensayo es causa común de errores en las aplicaciones en sistemas automáticos. NADH NAD Los cuidados habituales de seguridad deben ser aplicados en la manipulación de los reactivos, los que no deben ser pipeteados con la boca. Se debe tener cuidado para evitar la ingestión y en caso de contacto con los ojos, lavar inmediatamente con gran cantidad de agua y buscar auxilio médico. 01 Español - Ref.: 130
2 Los reactivos contienen azida sódica que es tóxica. Se debe tener cuidado para evitar la ingestión, y en caso de contacto con los ojos, lavar inmediatamente con gran cantidad de agua y buscar auxilio médico. La azida puede formar compuestos altamente explosivos con las cañerias de plomo y cobre. Por lo tanto, utilizar grandes volúmenes de agua para descartar reactivos y calibradores. Se sugiere no mezclar reactivos de lotes distintos. Material necesario y no provisto 1. Analizador capaz de medir con exactitud absorbancia a 340 nm. 2. Qualitrol Homocisteína - Labtest. Muestra Usar suero o plasma ( heparina y EDTA). Se debe centrifugar las muestras de sangre inmediatamente tras la recolección. Si no es posible, se debe mantener las muestras entre 2 y 4 ºC y centrifugarlas en un periodo máximo de 1 hora. Tras la separación del plasma, la homocisteína es estable por 4 semanas entre 0 y 8 ºC y hasta 3 meses a 20 ºC negativos, 1,5 almacenado en recipiente apropiado para congelamiento. Los pacientes que utilizan medicinas como: óxido nitroso, metotrexato, carbamazepina, anticonvulsivantes, triacetato de 6-azauridina y fenitoina pueden presentar niveles elevados de Hcy debido a la interferencia de estas medicinas en el metabolismo de este amino ácido. Se debe crear un Procedimiento Operacional Estándar (POE) para la recolección, preparación y almacenamiento de la muestra. Destacamos que los errores debidos a la muestra pueden ser mucho mayores que los errores ocurridos durante el procedimiento analítico. Como ningún ensayo conocido puede asegurar que las muestras de sangre no transmitan infecciones, todas ellas deben ser consideradas como potencialmente infectivas. Por lo tanto, al manipularlas se debe seguir las normas establecidas para bioseguridad. Sistema Automático Intervalo de calibraciones Cuando el control de calidad lo indique. Cuando se utilice un nuevo lote de reactivos. Cuando se utilicen nuevos frascos de reactivos de un mismo lote, en caso de que una nueva calibración haya sido realizada durante la utilización del frasco anterior. Parámetros para analizadores automáticos Parámetros Tipo de Reacción Dirección de la Reacción de Onda primario de Onda segundario Temperatura Calibración Modelo de la Calibración* Volumen de Muestra** Volumen de R1** Volumen de R2** Adición de R2 Lectura 1 (Absorbancia 1) Lectura 2 (Absorbancia 2) Aplicación Cinética Decrecente 340 nm 700 nm 37 ºC 6 puntos Punto 0: Blanco (Água desionizada/salina) Punto 1: Calibrador 1 Punto 2: Calibrador 2 Punto 3: Calibrador 3 Punto 4: Calibrador 4 Punto 5: Calibrador 5 No lineal 10 L 185 L 50 L 300 segundos tras la adición de R1 + muestra 150 segundos tras la adición de R2 300 segundos tras la adición de R2 Para descartar los reactivos y el material biológico, sugerimos aplicar las normas locales, estatales o federales de protección ambiental. Interferencias R1: 185 L Muestra: 10 L R2: 50 L Concentraciones de bilirrubina conjugada hasta 40 mg/dl, bilirrubina no conjugada hasta 40 mg/dl, ácido ascórbico hasta 10 mm, hemoglobina hasta 500 mg/dl, triglicéridos hasta 1000 mg/dl y cistationina hasta 100 M no producen interferencias significativas. 37 ºC nm 5 7,5 A1 10 min A2 Calibración. La concentración del analito en el material Calibrador Homocisteína es trazable al Material de referencia NIST - SRM 1955 ( National Institute of Standards and Technology - Homocysteine Standard Reference Material). Se debe homogenizar los calibradores por inversión, antes del uso. * La definición de modelo de calibración debe ser adecuada a cada modelo de equipo. En caso de duda, contacte el Servicio de Atención al Cliente Labtest. ***Los volúmenes de muestra y reactivos pueden ser cambiados proporcionalmente sin perjuicio para el desempeño de la prueba. En caso de reducción de los volúmenes es fundamental que se observe el volumen mínimo necesario para la medición fotométrica. 02 Español - Ref.: 130
3 Intervalo operativo. El intervalo operativo de medición es de 3 a 50 mol/l. Muestras con valores superiores a 50 mol/l deben ser diluidas con solución de NaCl 150 mmol/l (0,85% p/v), realizar nueva medición y multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución. Estudios de comparación de métodos. El método propuesto fue comparado con método semejante, habiéndose obtenido los siguientes resultados: e interno de calidad. El laboratorio debe mantener un programa de control interno de calidad que defina claramente los reglamentos aplicables, objetivos, procedimientos, criterios para especificaciones de calidad y límites de tolerancia, acciones correctivas y registro de las actividades. Se debe utilizar materiales de control para monitorear la imprecisión de la medición y las desviaciones de la calibración. Se recomienda utilizar los productos de la línea Qualitrol Homocisteína - Labtest para control interno de calidad en ensayos de química clínica. Número de muestras Intervalo de concentración ( mol/l) Ecuación de regresión Coeficiente de correlación Método Comparativo 40 Método Labtest 3,0-48,9 4,2-46,7 Método Labtest = 0,9429x Comparativo + 1,0513 0,9932 1,2 Intervalo de referencia. Los siguientes valores deben ser usados únicamente como orientativos. Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio intervalo de referencia en la población atendida. Valores para suero y plasma Paciente con suplementación de folato Edad Valores de referencia ( mol/l) <15 años < años <12 >65 años <16 Paciente sin suplementación de folato Edad Valores de referencia ( mol/l) <15 años < años <15 >65 años <20 Características de desempeño 3 Estudios de recuperación. En una muestra con concentración de homocisteína igual a 10,0 mol/l se añadió diferentes cantidades del analito, obteniéndose los siguientes resultados: Concentración ( mol/l) Inicial Añadida Esperada Encontrada 10,0 10,0 5,0 30,0 15,0 40,0 15,1 40,9 Recuperación (%) 100,4 102,2 El error sistemático proporcional estimado en los niveles de 12 mol/l y 29,5 mol/l son 0,16 mol/l y 0,38 mol/l, respectivamente. Utilizando la ecuación de regresión, el error sistemático (bias) fue igual a 3,1% y 2,1% en las concentraciones de 12 mol/l y 29 mol/l, respectivamente. Estos errores cumplen con la especificación deseable basada en los componentes de la VB para error sistemático analítico que es 10,3%. Estudios de precisión. Los estudios de precisión fueron realizados utilizando muestras con concentraciones iguales a 12 y 27 mol/l. Repetitividad - Imprecisión intra-ensayo Muestra 1 Muestra 2 N Media DE CV (%) ,24 1, ,66 2,4 Reproducibilidad - Imprecisión total Muestra 1 Muestra 2 N Media DE CV (%) ,57 4, ,72 5,6 El error total (error aleatorio + error sistemático) estimado en los niveles iguales a 12 mol/l y 29 mol/l es igual a 11,1% y 6,3%, respectivamente. Los valores encontrados cumplen con la especificación 3 deseable basada en los componentes de la VB que es 17,7 %. Sensibilidad metodológica. Límite de detección: 1,74 mol/l. El límite de detección corresponde al menor valor de homocisteína que presentó un coeficiente de variación de 20% de entre sus repeticiones. Efectos de la dilución de la matriz. Una muestra de concentración igual a 50 µmol/l fue utilizada para evaluar la respuesta del sistema en la dilución de la matriz con solución de cloruro de sodio 0,85%. Utilizando factores de dilución entre 2 y 5 se encontró un promedio de recuperación igual a 103,0 %. El error sistemático medio (3,0 %) cumple con la especificación mínima basada en los componentes de la VB para Error Sistemático Total que es 10,3%. 03 Español - Ref.: 130
4 Significado clínico. La homocisteína (Hcy) es un aminoácido que contiene un grupo sulfidrila (tiol) producida por la desmetilación intracelular de metionina. Homocisteína total (thcy) es la suma de todas las fracciones Hcy (incluyendo formas oxidadas, conjugadas con proteínas y libres). Los altos niveles de thcy ha demostrado ser importante para evaluar el riesgo de enfermedad cardiovascular, cerebrovascular y enfermedad vascular periférica, así como la trombosis arterial y venosa. Los altos niveles de thcy se ha asociado a cuatro factores principales que incluyen: a) errores congénitos de metabolismo involucrando con enzimas relacionadas a la homocisteína como, cistationina beta-sintasa (CBS), metionina sintasa (MS), la metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR); b) la deficiencia nutricional de vitaminas del grupo B como la B6, B12 y ácido fólico; c) Insuficiencia renal, promoviendo la disminución del clearance de aminoácido d) cambios en el metabolismo causados por la terapia con medicamentos como el óxido nitroso, el metotrexato, fenitoína y que pueden interferir con el metabolismo de la homocisteína. Los altos niveles de thcy también se ha relacionado con la enfermedad de Alzheimer y la osteoporosis. Observaciones 1. La limpieza y el secado adecuados del material utilizado son factores fundamentales para la estabilidad de los reactivos y obtención de resultados correctos. 2. El laboratorio clínico tiene por objetivo proveer resultados exactos y precisos. La utilización de agua de calidad inadecuada es una causa potencial de errores analíticos. El agua utilizada en el laboratorio debe tener la calidad adecuada para cada aplicación. Así, para preparar reactivos, utilizar en mediciones y para el uso en el enjuague final de la vidriería, el agua debe tener resistividad 1 megaohm.cm o conductividad 1 microsiemens/cm y concentración de silicatos <0,1 mg/l. Cuando la columna desionizadora está con su capacidad saturada ocurre liberación de varios iones, silicatos y sustancias con gran capacidad de oxidación y reducción que deterioran los reactivos en pocos días o incluso en horas, modificando los resultados de forma imprevisible. Por ello es fundamental establecer un programa de control de calidad del agua. Referencias 1. Refsum H. Clinical Laboratory News, maio 2002, p Nygard O, N Engl J Med. 337(4):230-6(1997). 4. Ricos C, Desirable Specifications for Total Error, Imprecision, and Bias, derived from intra- and inter-individual biologic variation. Disponible desde: (accedido en 21/07/2011). 5. Guttormsen AB et al. J Nutr. 124(10): (1994). 6. Labtest: Datos de Archivo. Presentación Producto Homocisteina El número de pruebas en aplicaciones automáticas depende de los parámetros de programación de cada equipo. Informaciones al consumidor [Términos y Condiciones de Garantía] Labtest Diagnóstica garantiza el desempeño de este producto dentro de las especificaciones hasta la fecha de caducidad indicada en los rótulos, siempre que los cuidados de utilización y almacenamiento indicados en los rótulos y en estas instrucciones sean seguidos correctamente. Labtest Diagnóstica S.A. CNPJ: / Av. Paulo Ferreira da Costa, Vista Alegre - CEP Lagoa Santa. Minas Gerais Brasil - Servicio de Apoyo al Consumidor Revisión: Julio, 2012 Ref.: Referencia 130-1/24 sac@labtest.com.br 1 2 Contenido 1 X 19 ml 1 X 5 ml Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reproducción bajo previa autorización 2. C.A. Burtis, E.R. Ashwood, D. E. Bruns - Tietz Text book of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics, 4 ed. 04 Español - Ref.: 130
5 05 Español - Ref.: 130
6 Símbolos utilizados com produtos diagnósticos in vitro Símbolos usados con productos diagnósticos in vitro Symbols used with ivd devices Conteúdo suficiente para < n > testes Contenido suficiente para < n > tests Contains sufficient for < n > tests Risco biológico Riesgo biológico Biological risk Data limite de utilização (aaaa-mm-dd ou mm/aaaa) Estable hasta (aaaa-mm-dd o mm/aaaa) Use by (yyyy-mm-dd or mm/yyyy) Marca CE Marcado CE CE Mark Calibrator Material Tóxico Tóxico Poison Calibrator Material Reagente Reactivo Reagent Limite de temperatura (conservar a) Temperatura limite (conservar a) Temperature limitation (store at) Fabricado por Elaborado por Manufactured by Representante Autorizado na Comunidade Europeia Representante autorizado en la Comunidad Europea Authorized Representative in the European Community Número do lote Denominación de lote Batch code Consultar instruções de uso Consultar instrucciones de uso Consult instructions for use e Número do catálogo Número de catálogo Catalog Number e negativo negativo Negative control Adições ou alterações significativas Cambios o suplementos significativos Significant additions or changes e positivo positivo Positive control Produto diagnóstico in vitro Dispositivo de diagnóstico in vitro In vitro diagnostic device e Liofilizado Liofilizado Lyophilized Corrosivo Corrosivo Corrosive Período após abertura Período post-abertura Period after-opening Uso veterinário Uso veterinario Veterinary use Instalar até Instalar hasta Install before Ref.: Español - Ref.: 130
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