2. Reactivo Almacenar a 2-8ºC. 3. Estándar mg/dl - Almacenar a 2-30ºC.
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- Sandra Moreno Romero
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1 GLUCOSA HK Liquiform Instrucciones de Uso Ref.:137 Finalidad. Sistema enzimático para la determinación de la glucosa por fotometría ultravioleta de punto final, en muestras de sangre, orina, líquido cefalorraquídeo y líquidos ascítico, pleural y sinovial. Uso profesional. [Solo para uso diagnóstico in vitro.] Principio. La adenosina trifosfato promueve la fosforilación de la glucosa en una reacción catalizada por la hexoquinasa (HK), de acuerdo con la siguiente reacción: Glucosa + ATP HK Glucosa-6-fosfato + ADP La glucosa-6-fosfato producida en la reacción anterior se oxida a 6-fosfogluconato en presencia de la nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), en reacción catalizada específicamente por la glucosa -6-fosfato deshidrogenasa (G-6-PDH). Ocurre la producción de un mol de NADH para cada mol de glucosa-6-fosfato que se oxida. La absorbancia resultante, medida en 340 nm, es directamente proporcional a la concentración de la glucosa en la muestra. La utilización de metodología birreactiva reduce significativamente las interferencias presentes en la muestra, dando mayor exactitud a los resultados. La metodología monoreactiva se pude aplicar con un Reactivo de Trabajo estable durante 60 días en condiciones de refrigeración, para que se obtenga un rendimiento adecuado incluso en las situaciones de bajas demandas en la prueba. El sistema permite aún preparar el volumen de Reactivo de Trabajo necesario para realizar un ensayo a fin de determinar la concentración glucosa. El sistema es fácilmente aplicable a los analizadores automáticos y semiautomáticos capaces de medir con exactitud la absorbancia en 340 nm. Metodología. Bondar y Mead modificado. Reactivos 1. Reactivo Almacenar a 2-8ºC. Contiene tampón ph 7,8; ATP 1,0 mmol/l; NAD 1,0 mmol/l; cloruro de magnesio 10 mmol/l y azida sódica 7,7 mmol/l. Glucosa-6-fosfato + NAD G-6-PDH 6-Fosfogluconato + NADH 2. Reactivo Almacenar a 2-8ºC. Hexoquinasa 1000 U/L; G-6-PDH 6000 U/L y azida sódica 15 mmol/l. Características del sistema. La hexoquinasa es una enzima que cataliza la transferencia del fosfato ATP no solo a la glucosa, sino también a la D-fructosa, D-manosa, D-glucosamina, 2 desoxi-d-glucosa. Como la G-6-PDH tiene una alta especificidad para la glucosa-6-fosfato, otras hexosas o esteres de pentosa que son fosforilados no participan de la reacción. Por lo tanto, el ensayo es extremadamente específico para la glucosa. La especificidad de la reacción, proporcionada por G-6-PDH, permite la determinación de la glucosa urinaria con un alto grado de exactitud, lo que no se logra cuando se emplean sistemas utilizando otras enzimas como reactivos. Los datos de repetibilidad y de la reproducibilidad demuestran de modo inequívoco que el sistema Glucosa HK Liquiform posee una robustez extremadamente deseable y valiosa para un sistema analítico. Las sustancias utilizadas en la reacción se encuentran repartidas de forma adecuada en dos reactivos, para otorgar mayor estabilidad en la forma líquida original y mantenimiento de las condiciones óptimas de la reacción en el que permite el uso directo de los reactivos en sistemas automáticos. 3. Estándar mg/dl - Almacenar a 2-30ºC. Después del manejo almacenar bien sellado para evitar la evaporación. El estabilizador del padrón puede precipitar en bajas temperaturas, lo que no interfiere en su rendimiento. Los reactivos no abiertos, cuando se almacenan en las condiciones especificadas, son estables hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta. Durante la manipulación de los reactivos están sujetos a contaminaciones de naturaleza química y microbiana que pueden causar reducción de la estabilidad. Trazabilidad del sistema. La calibración del sistema es trazable al Standard Reference Material 917 de National Institute of Standards and Technology. Precauciones y cuidados especiales Los cuidados habituales de seguridad deben aplicarse en el manejo de los reactivos. Los reactivos de Glucosa HK Liquiform contienen azida sódica, que es tóxica. Se debe tener cuidado para evitar la ingestión y, en caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente y acúdase a un médico. 01 Español - Ref.: 137
2 La azida puede formar compuestos altamente explosivos con tuberías de plomo y cobre. Por lo tanto, utilice grandes volúmenes de agua para desechar el reactivo. No utilice el Reactivo de Trabajo cuando su absorbancia medida a 340 nm frente el agua es superior a 0,350. Materiales necesarios y no fornecidos 1. Baño maría mantenido a una temperatura constante de (37º C). 2. Fotómetro capaz de medir, con precisión, la absorbancia a 340 nm. 3. Pipetas para medir muestras y reactivos. 4. Cronómetro. Influencias preanalíticas. En las 24 horas que siguen a la ingestión de alcohol, sobreviene una reducción significativa de la glucemia. Las reducciones asimismo pueden ser significativas en los individuos sometidos a un ayuno prologando o en obesos tratados con dietas con bajo valor calórico. Pacientes diabéticos en uso continuado de clorpropamida (Diabinese) pueden desarrollar hipoglucemias importantes que son muy difíciles de solucionar. Muestra Utilice plasma, suero u orina tomando las siguientes precauciones. La muestra de sangre debe obtenerse después de un ayuno de por lo menos 8 horas o de acuerdo con la recomendación médica. Realizar la recogida de sangre en el que se utiliza un anticoagulante que contenga un inhibidor de la glucólisis. El uso do anticoagulante Glistab (Labtest Ref. 29) permite la extracción de apenas una muestra para las dosificaciones de creatinina, glucosa y urea. Las muestras de sangre que no contienen antiglicolítico deben centrifugarse inmediatamente tras la extracción y el plasma o suero separados de las células o coágulo. En las muestras de sangre tratadas con antiglicolítico, la concentración de glucosa se mantiene estable hasta 8 horas. En el plasma, suero y otros líquidos separados de las células, la glucosa se mantiene estable durante 6 3 días entre 2-8ºC, si no hay contaminación microbiana. La presencia de ácido ascórbico en la muestra no interfiere en los resultados, lo que ocurre en los sistemas que usan la metodología Trinder. En otros líquidos biológicos (líquido cefalorraquídeo y líquidos ascítico, pleural y sinovial), añadir anticoagulante que contenga antiglicolítico en la misma proporción usada para la muestra de sangre y centrifugar antes de la dosificación. Las muestras de orina deben almacenarse entre 2-8ºC para evitar interferencias por contaminación microbiana. Puesto que ninguna prueba conocida puede asegurar que las muestras de material biológico humano no transmiten infecciones, todas ellas deben considerarse como potencialmente infecciosas. Por lo tanto, al manejarlas, se deben cumplir las normas establecidas para la bioseguridad. Para desechar los reactivos y el material biológico sugerimos aplicar las normas locales, estaduales o federales de protección ambiental. Interferencias Para la metodología birreactiva, valores de bilirrubina hasta 20 mg/dl, hemoglobina hasta 200 mg/dl y triglicéridos hasta 1000 mg/dl no producen interferencias significativas. Para la metodología monorreactiva, valores de bilirrubina hasta 10 mg/dl, hemoglobina hasta 50 mg/dl y triglicéridos hasta 350 mg/dl no producen interferencias significativas. Valores de bilirrubina hasta 20 mg/dl, hemoglobina hasta 200 mg/dl y triglicéridos hasta 1000 mg/dl producen interferencias que pueden minimizarse mediante el uso del blanco de la muestra. Para evaluar la concentración aproximada de la hemoglobina en una muestra hemolizada, se puede proceder de la siguiente forma: Disolver 0,05 ml de la muestra en 2,0 ml de NaCl 150 mmol/l (0,85%) y medir la absorbancia en 405 o 415 nm con el ajuste del cero con agua desionizada o destilada. Hemoglobina (mg/dl) Absorbancia x Hemoglobina (mg/dl) Absorbancia415 x 467 Blanco de la muestra: este procedimiento se aplica cuando hay acción de interferentes. Mezclar 1,0 ml de NaCl 150 mmol/l (0,85%) con 0,01 ml de la muestra. Medir la absorbancia a 340 nm, y ajusta el cero con agua desionizada o destilada. Disminuir la absorbancia así obtenida de la absorbancia de la prueba y calcular la concentración. Preparo del reactivo de trabajo. El conjunto de un envase de Reactivo 1 y un envase de Reactivo 2 permite preparar el Reactivo de Trabajo. Transferir el contenido de un envase de Reactivo 2 para un envase de Reactivo 1 y homogeneizar por inversión. Apuntar la fecha de caducidad. Estable 60 días entre 2-8º C si no hay contaminación química o bacteriana. Identificar el envase del Reactivo de Trabajo, para evitar confusión con otros envases del Reactivo 1. Para conservar su rendimiento, se debe mantener el reactivo fuera de la heladera solo durante el tiempo necesario, a fin de obtener el volumen a ser utilizado. Evitar la exposición a la luz solar directa. Opcionalmente, se puede preparar menor volumen del Reactivo de Trabajo con la utilización de la proporción 4 volúmenes del Reactivo 1 y 1(un) volumen del Reactivo 2. Ej.: para preparar 1 ml del Reactivo de Trabajo mezclar 0,8 ml del R1 con 0,2 ml del R2. Procedimiento Tome 3 tubos de ensayo y proceda de la siguiente manera: Muestra Estándar Reactivo de tabajo Blanco 1,0 ml Prueba 0,01 ml 1,0 ml Estándar 0,01 ml 1,0 ml 02 Español - Ref.: 137
3 Mezclar e incubar en baño maría a 37ºC durante 5 minutos. El nivel de agua en el baño debe ser superior al nivel de los reactivos en los tubos de ensayo. Determinar las absorbancias de la prueba y estándar a 340 nm, y ajustar el cero con el blanco. La absorbancia es estable durante 60 minutos. El procedimiento sugerido para la medición es adecuados para fotómetros cuyo volumen mínimo de solución para lectura es igual o menor que 1,0 ml. Se debe efectuar una verificación sobre la necesidad de ajuste del volumen para el fotómetro utilizado. Los volúmenes de las muestras y reactivos pueden modificarse proporcionalmente sin afectar el rendimiento de la prueba y el procedimiento de cálculos se mantienen inalterado. En el caso de reducción de los volúmenes, es fundamental que se observe el volumen mínimo requerido para la lectura fotométrica. Volúmenes de muestra menores que 0,01 ml son críticos en aplicaciones manuales y se deben usar con precaución, ya que aumentan la inexactitud de la medición. Cálculos. Véase linealidad. Absorbancia de la Prueba Glucosa (mg/dl) = x 100 Absorbancia del Estándar Ejemplo A Prueba = 0,322 A Estándar = 0,357 0,322 Glucosa (mg/dl) = x 100 = 90 0,357 El resultado también puede obtenerse con la utilización el factor de calibración. Factor de calibración = 100 Absorbancia del Estándar Glucosa (mg/dl) = Absorbancia de la Prueba x Factor Ejemplo 100 Factor = = 2 0,357 Glucosa (mg/dl) = 0,322 x 2 = 90 Orina (mg/24 horas) = mg/dl x volumen (en ml) 100 Calibración. El estándar trazable al Standard Reference Material (SRM) 917 en el National Institute of Standards and Technology (NIST). Sistemas automáticos Blanco de reactivo: agua o solución de cloruro de sodio 150 mmol/l (0,85%); Estándares: usar calibradores de proteínas La concentración de Glucosa en el Calibra H es trazable al SRM 917 del NIST. Linealidad La reacción es lineal hasta 700 mg/dl. Para valores mayores, disolver la muestra con NaCl 150 mmol/l (0,85%), realizar nueva determinación y multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución. Le sugerimos la verificación de la linealidad metodológica y fotométrica, como mínimo semestralmente, utilizando muestras con valores hasta 700 mg/dl. Control interno de calidad. El laboratorio debe mantener un programa de control interno de la calidad que defina claramente los reglamentos aplicables, objetivos, procedimientos y criterios para los pliegos de la calidad y límites de tolerancia, acciones correctivas y registro de las actividades. Materiales de control deben utilizarse para evaluar la inexactitud y desviaciones de la calibración. Se propone que los pliegos para el coeficiente de variación y el error total se basen en los 8.9 componentes de la variación biológica. (VB). Se sugiere la utilización de los productos de la línea Qualitrol H- Labtest para el control interno de la calidad en ensayos de química clínica. Intervalo de referencia. Los intervalos se deben usar apenas como guía. Se recomienda que cada laboratorio establezca, en la población atendida, sus propios intervalos de referencia. Plasma (ayuno de 8 horas) 11 Edad Precoce 0 a 1 dia > 1 dia Niños e Adultos Los criterios de diagnóstico de prediabetes y diabetes se pueden obtener en: American Diabetes Association. Diabetes Care 2012;(suppl): 1 S64-S71. Líquido Cefalorraquídeo: 2/3 de la glucemia cuando la medición es realizada en muestras recogidas al mismo tiempo. En individuos sanos, la pequeña cantidad de líquido presente en las cavidades articular, pleural y peritoneal se origina del ultrafiltrado del plasma. Por lo tanto, puede considerarse que, prácticamente, la glucosa allí presente está en la misma concentración del plasma. Orina. inferior a 20 mg/dl o hasta 250 mg/24 horas. mg/dl 20 a a a a 99 Conversión. Unidades Convencionales (mg/dl) x 0,0556 = Unidades SI (mmol/l). Calibraciones manuales Obtener el factor de calibración al usar un nuevo lote de reactivos, o cuando indica el control interno de la calidad. 03 Español - Ref.: 137
4 Características del rendimiento 12 Exactitud. En dos muestras con concentraciones de glucosa iguales a 51 y 103 mg/dl se añadieron cantidades distintas del analito, así se obtiene en el método de punto final recuperaciones entre el 98 y el 99%. El error sistemático proporcional medio obtenido en un valor de 120 mg/dl es igual a 1,8 mg/dl o al 1,5%. Especi ficidad. El método propuesto se ha comparado con un método similar en el que muestra los siguientes resultados. Número de muestra Intervalo de concentraciones (mg/dl) Ecuación da regresión Coeficiente de correlación Con la utilización de la ecuación de la regresión, el error sistemático total (constante y proporcional) averiguado en los niveles de decisión de 45,120 y 1 mg/dl fueron iguales a 0,66; 0,40 y 0,19 mg/dl o 1,47; 0,33 y 0,11%, respectivamente. El error sistemático total obtenido es inferior que el error sistemático total de la especificación deseable basada en los componentes de la Variación Biológica que es 2,2%. Puesto que las muestras se han seleccionadas aleatoriamente en pacientes de ambulatorio y pacientes hospitalizados, se puede inferir que el método tiene una especificidad metodológica adecuada. Estudios de precisión. Los estudios de precisión se han realizados con la utilización de muestras con concentraciones medias iguales a 46, 123 y 184 mg/dl. Repetitividad - imprecisión intra-ensayo Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 N N Método Comparativo 40 Media Reproducibilidad - imprecisión total Media DE 0,46 1,01 1,45 DE 1,04 1,47 2,46 Método Labtest Método Labtest (mg/dl) = 0,9965 x contrastivo + 0,8167 0,999 CV (%) 1,00 0,83 0,79 CV (%) 1,85 1,19 1,34 El error total (error aleatorio + error sistemático) estimado en concentraciones iguales a 45, 120 y 1 mg/dl son iguales al 4,53%, 2,30% y al 2,32%, respectivamente. Los resultados señalan que el método cumple con la especificación deseable para el error total ( 6,9%) basada en los componentes deseables de la Variación Biológica. Sensibilidad metodológica. Se ha utilizado una muestra de proteína que no contenía glucosa para calcular el límite de detección del ensayo, en la cual se ha encontrado un valor igual a 0,62 mg/dl, que equivale al promedio de concentraciones obtenidas más dos desviaciones estándar. Con la utilización de la absorbancia del estándar como parámetro, el límite de detección fotométrica es 0,28 mg/dl, que corresponde a una absorbancia igual a 0,001. Efectos de la dilución de la matriz. Dos muestras con valores iguales a 821 y 834 mg/dl se han utilizados para evaluar la respuesta del sistema en las diluciones de la matriz con NaCl 150 mmol/l (0,85%). Con la utilización de los factores de dilución que variaron de 2 a 8, se ha encontrado una recuperación media de 100,1%. El error total obtenido es inferior al error sistemático total de la especificación deseable, basada en los componentes de la Variación Biológica que es 6,9%. Significado clinico. Valores elevados de glucosa se dan en varios tipos de diabetes primarias, en los estados de intolerancia a la glucosa y en las diabetes secundarias en varias dolencias (hipertiroidismo, hiperpituitarismo, hiperadrenocorticismo, etc). Valores disminuidos se dan en las hipoglucemias que se pueden deber a varias causas. Cuando la ocurrencia de hipoglucemia está relacionada a la alimentación, se pueden definir dos tipos de hipoglucemias: la del ayuno y la posprandial. Las causas más comunes de hipoglucemia del ayuno son: hiperinsulinismo endógeno (insulinoma y sulfonilurea), hiperinsulinismo exógeno (factício), tumores extrapancreáticos, síndrome auto inmune (formación espontánea de anticuerpos para receptores de la insulina), insuficiencia suprarenal y o hipofisiaria, dolencia hepática grave y alcoholismo. La hipoglucemia pospranadial, dependiendo de la historia clínica y de la respuesta al test oral de tolerancia a la glucosa, se clasifica en alimentaria, hipoglucemia del diabético tipo II y del paciente con intolerancia a la glucosa, hipoglucemia funcional o reactiva. Para una revisión de los criterios diagnósticos y clasificación de la diabetes mellitus, consultar American Diabetes Association. Diabetes Care 2012;(suppl): 1 S64-S71 ou: (acesso em 16/04/2012). La reducción de la concentración de glucosa en los líquidos corporales se encuentra relacionada usualmente a los procesos inflamatorios o infecciosos. La determinación de la concentración de glucosa en el LCR es uno de los parámetros que permite diferenciar entre meningitis bacteriana y virósica, teniendo, sin embargo, sensibilidad inferior a la evaluación celular en el mismo material. Observaciones 1. La limpieza y secado adecuadas del material utilizado son factores fundamentales para la estabilidad de los reactivos y obtención de resultados correctos. 04 Español - Ref.: 137
5 2. El laboratorio clínico tiene como objetivo fornecer resultados exactos y precisos. La utilización de agua de calidad inadecuada es una causa potencial de errores analíticos. El agua desionizada o destilada utilizada en el laboratorio debe tener la calidad adecuada para cada aplicación. Así, para preparar reactivos y usar en las mediciones y para su uso en enjuague final de la vidrería, el agua debe tener resistividad 1 megaohm.cm o conductividad 1 microsiemens/cm y concentración de silicatos <0,1 mg/l. Cuando la columna desionizadora está con su capacidad saturada, se produce agua con liberación de varios iones, silicatos y sustancias con gran poder de oxidación o reducción que deterioran los reactivos en pocos días o incluso horas, alterando los resultados de modo imprevisible. Por lo cual es fundamental establecer un programa de control de la calidad del agua. Referencias 1. Bergmeyer HU. Methods of Enzimatic Analisys, 3ed, vol 6, Deerfield Beach: Verlag Chemie,1984; Bjorkem I, Blomstrand R, Falk O, Ohman G. Clin Chim Acta 1976;72: Presentación Producto Glucosa HK Liquiform Glucosa HK Liquiform Labmax 560/400 Referencia 137-2/ /82 El número de tests en aplicaciones automáticas depende de los parámetros de programación. Informaciones al consumidor [Términos y Condiciones de Garantía] Labtest garantiza la correcta performance del equipo hasta su fecha de vencimento se ha sido conservado de acuerdo a las instrucciones que figuram en el rótulo Contenido 2 X ml 2 X 20 ml 1 X 5 ml 10 X 65 ml 10 X 17 ml 1 X 5 ml 3. Bondar RJL, Mead D. Clin Chem 1974;20: Inmetro - Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark eds, Rio de Janeiro, Kaplan LA, Pesce AJ. Methods in Clinical Chemistry, St. Louis: The C.V. Mosby Co., 1987; BURTIS CA, Ashwood ER, Bruns DE. Tietz, Textbook of Clinical Chemistry and molecular diagnostics, 4th edition St Luis, Missouri: Elsevier Saunders Labtest Diagnóstica S.A. CNPJ: / Av. Paulo Ferreira da Costa, Vista Alegre - CEP Lagoa Santa. Minas Gerais Brasil - Customer Service customerservice@labtest.com.br Revición: Noviembre, 2011 Ref.: Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reproducción bajo previa autorización 7. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem 1981;27: Biological Variation Database specifications - Westgard QC. Disponível em: < (acesso em 28/10/2011). 9. Basques JC. Especificações de Qualidade Analítica. Labtest Diagnóstica Burtis CA,Ashwood ER. Textbook of Clinical Chemistry, 2ª. Edição, Philadelphia:W.B. Saunders, 1986: American Diabetes Association: Point: Impaired Fasting Glucose: The Case for the New American Diabetes Association Criterion. Diabetes Care May 2006 vol. 29 no Labtest: Datos de Archivo. 05 Español - Ref.: 137
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