Memorias del XIV Congreso de Bioenergética y Biomembranas. Sociedad Mexicana de Bioquímica A.C. 13 al 18 noviembre 2005; Oaxaca, Oaxaca.

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1 Memorias del XIV Congreso de Bioenergética y Biomembranas. Sociedad Mexicana de Bioquímica A.C. 13 al 18 noviembre 2005; Oaxaca, Oaxaca. PAPEL DE LA CREATINA CINASA MITOCONDRIAL EN LA FORMACION DE LOS SITIOS DE CONTACTO Y SU RELEVANCIA EN LA REGULACION DE LA HOMEOSTASIS ENERGETICA CARDIACA Karla Carvajal, María de la Luz Hernández Esquivel. Departamento de Bioquímica, Instituto Nacional de Cardiología Ignacio Chávez. México D.F karla_ca@yahoo.com INTRODUCCION La creatina cinasa (CK) cataliza la transferencia reversible del grupo N-fosforil de la fosfocreatina (PCr) hacia el ADP para regenerar ATP y creatina. Esta enzima tiene un papel clave en la homeostasis energética de células con requerimientos energéticos elevados y fluctuantes como el músculo esquelético y el cardiaco, las neuronas, los fotorreceptores, los espermatozoides y los electrocitos. Las isoenzimas citosólicas, las fracciones MM, MB y BB, generalmente se co-expresan de manera tejido específica al igual que la isoforma mitocondrial. Con el uso de fraccionamientos bioquímicos y técnicas de localización in situ, se ha podido demostrar que las diferentes isoenzimas, las cuales inicialmente se consideraban como estrictamente solubles, se encuentran en realidad compartamentalizadas y formando complejos funcionales con otras enzimas localizadas en los sitios de producción (glucólisis y mitocondria) y de utilización (ATPasas celulares como la ATPasa de miosina y la SERCA) de energía. De esta forma, esta organización subcelular de la CK forma un red de distribución de la energía altamente regulada, conocida como el circuito energético de la creatina cinasa (1). La creatina cinasa mitocondrial (mitck) se localiza en el espacio intermembranal a lo largo de la membrana interna y justo en los sitios de contacto, donde la membrana interna y la externa están en proximidad. MitCK puede directamente transfosforilar el ATP producido intramitocondrialmente hacia PCr, la cual es exportada subsecuentemente hacia el cytosol. El papel mas contundente de la mitck es su acoplamiento funcional con la fosforilación oxidativa (FOX), mediante el cual facilita el antiporte de ATP contra ADP a través de la membrana interna vía el translocador de adenín nucleótidos (ANT) lo cual le provee un acceso privilegiado del ATP generado por la FOX y a su vez el ANT directamente toma el ADP producido por la mitck físicamente asociada a esta proteína. Además de esto, también se ha demostrado una interacción física de mitck con la porina de la membrana externa mitocondrial (VDAC) (2). La resolución por rayos X de la estructura de mitck ha revelado una estructura cuboidal formada por un octámero, lo cual es consistente con la función canalizadora de energía de la enzima. Las caras superior e inferior del octámero son idénticas y contienen sitios con motivos que facilitan la unión a las membranas externa e interna mitocondriales. El cubo contiene un canal central de 26 Å que podría estar implicado en la transferencia de los metabolitos energéticos del circuito de la CK (3)

2 La interacción física y el acoplamiento funcional entre la mitck, VDAC y ANT sugiere fuertemente un papel de mitck en la regulación de la formación del poro de la transición mitocondrial o mega canal que precede el daño celular en distintas situaciones patológicas, tales como la reperfusión postisquémica y los procesos apoptóticos. La mitck forma estos complejos solo en su forma octámetica, y se ha demostrado en vesículas reconstituidas que la disociación del octámero reduce la resistencia a la apertura del poro dependiente de mitck (4). De esta forma, se propone que los octámeros de mitck podrían directamente afectar la transición de la permeabilidad mediada por ANT y de esta forma, la presencia de mitck como una unidad transportadora de energía que se encuentra entre VDAC y ANT, y que además actúa como interconector entre las membranas interna y externa mitocondriales podría no solamente ser importante para la conversión de fosfatos de alta energía, sino que además puede actuar como un componente regualtorio en la protección de la transición de la permeabilidad. Dependiendo el estado energético celular y la concentración de Ca 2+, la mitck octámerica pude prevenir la formación del poro de la transición, un evento precedente a la ejecución de la apoptosis (5) en células con alta demanda energética, protegiéndolas o retardando así la muerte celular. Por otro lado, la dimerización del octámero de mitck puede también interferir en el cambio conformacional de ANT en su estado pro-apertura del poro, lo cual eventualmente puede llevar hacia apoptosis. OBJETIVOS Este trabajo tiene por objetivo esclarecer el papel de mitck en la formación de los sitios de contacto y su relevancia en la regulación de la economía energética del corazón, de igual manera destacaremos cómo disturbios en el acoplamiento funcional de la mitck con los componentes de los sitios de contacto, contribuye al déficit energético cardiaco presente en diferentes patologías y alteraciones de la función cardiaca. DISEÑO EXPERIMENTAL Como modelos de alteración en la función cardiaca utilizaremos tres condiciones diferentes: 1. Corazón de ratas hipertrigliceridémicas, en las cuales hemos demostrado que se presenta una alteración importante en la producción y transferencia de energía a nivel de la CK (6). 2. Corazones reperfundidos. Durante la reperfusión postisquémica se producen daños a la mitocondria que afectan severamente la homeostasis energética, incluyendo un daño oxidativo en los componentes del circuito energético de la CK. Utilizaremos el modelo de corazón aislado de rata en el cual se inducirá isquemia global y reperfusión isotérmica (7). 3. Corazones prefundidos con doxorubicina. El fármaco antineoplásico doxorubicina produce un severo daño cardiaco principalmente por el estrés oxidativo que afecta de manera importante la producción de energía en este órgano (8). MATERIAL Y METODOS Inducción de hipertrigliceridemia Se utilizaron ratas macho de la cepa Wistar de 250 g de peso a las que se les dio sacarosa al 30 % en el agua de bebida durante 15 semanas, recibiendo alimentación sólida ad libitum.

3 Los animales así tratados son referidos como ratas hipertrigliceridémicas (HTG). Ratas de igual sexo y edad con alimentación estándar fueron utilizadas como controles. Isquemia y reperfusión en corazón aislado. Los corazones de ratas Wistar machos de un peso de g fueron montados en un sistema de corazón aislado de acuerdo a la técnica de Langendorff, la isquemia se produjo por la interrupción de la perfusión durante 30 minutos, seguida de un periodo de reperfusión por restablecimiento del flujo durante 30 minutos más. Tratamiento con doxorubicina. Corazones de ratas Wistar machos de un peso de g fueron montados en un sistema de órgano aislado y fueron perfundidos durante 60 minutos con medio de perfusión adicionado con 20µM de doxorubicina (DOXO). Preparación de mitocondrias y estudios de oxímetria. Se aislaron mitocondrias de los corazones obtenidos bajo las distintas condiciones mediante centrifugaciones differenciales ( 9). Se midió el consumo de oxígeno por polarografía utilizando un electrodo tipo Clark. RESULTADOS. En un primer intento por demostrar el acoplamiento funcional de la mitck con la FOX, determinamos la KmADP en mitocondrias de corazones controles y HTG. En la Fig 1 se muestra el cambio de afinidad de la FOX por ADP cuando la mitck está presente, sin embargo, en mitocondrias de corazones HTG esta diferencia no se observa, sugieriendo un desacoplamiento de la mitck y FOX. Con el fin de demostrar la importancia de la mitck en la regulación de la FOX, determinamos el coeficiente de control que ésta enzima ejerce sobre el flujo de esta vía midiendo el consumo de oxigeno en estado 3 en mitocondrias aisladas de corazón variando la concentración de creatina. De acuerdo a la teoría moderna del control metabólico (10), con estos datos obtuvimos el coeficiente de respuesta a creatina de la FOX y calculando el coeficiente de elasticidad de la CK para creatina, el cual resultó de 0.5 pudimos determinar el coeficiente de control de la mitck sobre el flujo de la FOX C FOX CK. En mitocondrias de corazones controles encontramos un C FOX CK.de 0.23 mientras que en corazones de ratas HTG este valor se incrementó a 0.55 lo cual concuerda con una disminución de la enzima mitocondrial y/o de su acoplamiento a la FOX. Determinamos también la sensibilidad a la apertura del poro de la transición de la permeabilidad mitocondrial (PTM) inducida por calcio en mitocondrias de corazones sometidos a las diferentes condiciones estudiadas. Cuando se induce la apertura del poro en presencia de creatina, se produce una resistencia a la apertura del poro sin embargo, en mitocondrias de corazones HTG, reperfundidos o tratados con DOXO la protección ejercida por la activación de la mitck se pierde, indicando que la pérdida del acoplamiento de la mitck en los sitios de contacto confiere mayor susceptibilidad al daño por calcio. Resultados similares fueron encontrados en experimentos de hinchamiento mitocondrial inducido por calcio.

4 Se determinó de igual forma la asociación física y funcional de la mitck y el ANT midiendo directamente el efecto de la presencia de la mitck sobre la velocidad de translocación del ANT. En mitocondrias control la Km ADP del translocador disminuye en un 50 % cuando el ensayo se realiza en presencia de 25 mm de creatina, lo cual permite el intercambio directo de ADP entre la mitck y el ANT, sin embargo, en mitocondrias de corazones reperfundidos, HTG o tratados con DOXO, este efecto se pierde. Para determinar si la pérdida de la asociación entre la mitck y los componentes de los sitios de contacto se debe a una disociación de la forma octamérica de la enzima, determinamos en geles nativos azules la proporción de octámeros y dímeros en mitocondrias de corazones en las diferentes condiciones estudiadas. La proporción del octámero disminuyó significativamente en las mitocondrias HTG, reperfundidas y tratadas con DOXO. A B % OF MAXIMAL 0 2 UPTAKE RATE ADPµM ADPµM Respiratory rate natoms O 2 /min/ mg C m= 1.7± D m= 3.4± Creatine mm Creatine mm Fig. 1. Afinidad aparente de la FOX por ADP y creatina en mitocondrias de corazón. Se determinó la velocidad de consumo de oxígeno en mitocondrias control (A) y HTG (B) a las concentraciones de ADP indicadas en presencia ( símbolos abiertos) o en ausencia (símbolos cerrados) de 25mM de creatina. C y D representan la velocidad de oxígeno determinada en presencia de las concentraciones crecientes de creatina 2mM de ATP y 2mM de Mg2+. Las líneas sólidas representan el ajuste a la ecuación de Michaelis-menten. Los datos representan la media ±DE de 5 diferentes preparaciones. El coeficiente de respuesta se calculó mediante la pendiente en la concentración fisiológica de 10 mm de creatina de acuerdo a la relación siguiente R FOX mitck= m Cr o /J o., donde el punto x o, refiere a la concentración de creatina fisiológica considerada como 10 mm.

5 CONCLUSIONES Los resultados presentados apoyan la hipótesis de que la mitck juega un papel importante en la formación de los sitios de contacto mitocondriales en corazón, y que la formación de tales complejos está implicada en la homeostasis energética cardiaca. De igual forma, la perturbación en la asociación funcional de los diferentes componentes de los sitios de contactos contribuye al déficit energético presente en corazones afectados por estrés oxidativo y pudiera estar involucrado en otros padecimientos cardiacos en los que la homeostasis energética se encuentra alterada, tal como la falla cardiaca, la hipertrofia ventricular y la cardiopatía diabética. REFERENCIAS (1)Wallimann, T., Wyss, M., Brdiczka, D., Nicolay, K., and H. M. Eppenberger (1992). Intracellular compartmentation, structure and function of creatine kinase isoenzymes in tissues with high and fluctuating energy demands: the "PCrcircuit" for cellular energy homeostasis. Biochem. J. 281, (2)Brdiczka, D., Kaldis, P., and T. Wallimann (1994). In vitro complex formation between the octamer of mitochondrial creatine kinase and porin. J.Biol. Chem. 269, (3)Schlattner, U., Forstner, M., Eder, M., Stachowiak, O., Fritz-Wolf, K., and T. Wallimann (1998). Functional aspects of the X-ray structure of mitochondrial creatine kinase: a molecular physiology approach. Mol. Cell Biochem. 184, (4)0 Gorman, E., Beutner, G., Dolder, M., Koretsky, A.P., Brdiczka, D., and T. Wallimann (1997). The role of creatine kinase in inhibition of mitochondrial permeability transition. FEBS Letters 414, (5)Leist, M. and P. Nicotera (1998). Apoptosis, excitotoxicity and neuropathology. Exp. Cell Res. 239,

6 (6)Carvajal K,Baños G, Moreno Sánchez R, (2003) Impairment of glucose metabolism and energy transfer in the hypertriglyceridemic rat heart, Mol. Cell. Biochem (7)Carvajal K, El Hafidi M,Baños G, (1999) Myocardial damage due to ischemia and reperfusion in hypertriglyceridemic and hypertensive rats: participation of free radicals and calcium overload, J. Hypertens. 17, (8)Tokanska-Schlanttner M, Wallimann T, Schlattner U, (2002) Multiple interference of anthracyclines with mitchondrial creatine kinases: preferential damage of the cardiac isoenzyme and its implications for drug cardiotoxicity. Mol. Pharmacol. 61, (9)Moreno-Sánchez R, Hansford R (1988). Relation between cytosolic free calcium and respiratory rates in cardiac myocytes, Biochem. J. 256, (10)Fell D. Understanding the control of metabolism. Portland Press, London. (1997), 300 p.