ENTRADA DEL VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA EN LA CÉLULA DIANA Y CARACTERÍSTICAS FISICO-QUÍMICAS DE LA MEMBRANA CELULAR

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1 ENTRADA DEL VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA EN LA CÉLULA DIANA Y CARACTERÍSTICAS FISICO-QUÍMICAS DE LA MEMBRANA CELULAR Investigador principal: Dr. Josep Cladera Cerdà Centro: Facultat de Medicina. Universitat Autònoma de Barcelona Duración: 3 años MEMORIA FINAL 1. Resumen La entrada del virus de inmunodeficiencia humana en la célula huésped conlleva, a partir del reconocimiento del receptor CD4 de la membrana celular por parte de la proteína gp120 de la membrana vírica, una serie de cambios conformacionales que finalizan con la interacción de la proteína gp41, asociada de forma no covalente con la gp120, con la membrana celular. Esta interacción tiene lugar a través del extremo aminoterminal de la proteína gp41, una parte de la secuencia conocido como péptido de fusión. El cambio conformacional de la gp41 y la interacción del péptido de fusión con la membrana celular son acontecimientos desencadenantes de los procesos de aproximación y fusión de las membranas vírica y celular, 1

2 que constituyen el mecanismo de entrada del VIH en la célula huésped. El conocimiento de los aspectos moleculares de la interacción del péptido de fusión con la membrana celular resulta, por tanto, esencial a la hora de describir cómo el virus entra en la célula y para el diseño de estrategias destinadas a evitar dicha entrada. El proyecto de investigación estaba orientado a la caracterización molecular de la interacción péptido de fusión-membrana biológica, atendiendo en especial a la importancia de las características físico-químicas de las membranas, entre las cuales destacan la presencia de un importante potencial electrostático en la interfaz lípido-agua, el potencial dipolar de membrana, y la presencia de polímeros cargados negativamente (proteoglicanos) en la superficie de la membrana. El proyecto se planteó a partir de la utilización de secuencias peptídicas sintéticas representativas del péptido de fusión y de membranas modelo (liposomas), así como de técnicas biofísicas altamente complementarias: el marcado fluorescente de membranas con sensores de los potenciales de superficie y del potencial dipolar para seguir la unión del péptido a la bicapa; la realización de experimentos de transferencia de energía por resonancia (FRET) para el seguimiento del proceso de fusión de membranas; y el empleo de la espectroscopia de infrarrojo con transformada de Fourier (FTIR) para el seguimiento de los cambios conformacionales del péptido y el estado de hidratación de la superficie de la bicapa lipídica. Las técnicas aplicadas debían facilitar la obtención de datos cinéticos que permitiesen una descripción de la dinámica de los procesos de unión del péptido a las membranas, de cambio conformacional y de fusión. 2. Resultados Interacción de los péptidos de fusión de la proteína gp41 del VIH con membranas: un estudio resuelto en el tiempo de la unión del 2

3 péptido a las membranas, el proceso de fusión y los cambios conformacionales (Biochemistry 2005, 44, ). La interacción del péptido de fusión de la proteína gp41 del VIH con la membrana de la célula diana desencadena el proceso de fusión de membranas que permite la entrada del virus en la célula. Muchos estudios sobre la interacción de péptidos de fusión con membranas biológicas existentes en la bibliografía se han realizado empleando péptidos sintéticos y membranas biológicas. Debido a la variedad de sistemas experimentales y secuencias, existía a la hora de abordar los estudios proyectados una cierta controversia en cuanto al tipo de estructura que adoptaría el péptido en el momento de desencadenar el proceso de fusión: hélice _ o estructura _. Con el fin de contribuir a solucionar la controversia, realizamos una serie de experimentos sobre la interacción de las secuencias peptídicas más representativas con membranas modelo bajo unas mismas condiciones experimentales. Las cinéticas del proceso de unión de los péptidos a las membranas se han comparado con las cinéticas del proceso de fusión y con las cinéticas de los cambios conformacionales detectados a lo largo de la interacción de los péptidos con las membranas. Los resultados muestran que los péptidos de fusión, los cuales adoptan una estructura monomérica y no ordenada en DMSO, el medio donde se preparan las suspensiones del péptido, forman al entrar en contacto con el medio acuoso de una suspensión de membranas, unos agregados que contienen una mezcla de estructuras helicoidales y estructuras _. Las membranas modelo, tras unirse el péptido, facilitan la formación de más estructura _ de agregación. La formación de estas estructuras _ precede al inicio del proceso de fusión de membranas. Los resultados obtenidos han permitido llegar a la siguiente formulación del esquema cinético de los procesos: 3

4 FP DMSO FP agw (k app 10-2 s -1 ) FP agw + M FP β M (k app 10-3 s -1 ) 2 FP β M FP β M F (k app 10-4 s -1 ) donde FP DMSO es el péptido de fusión disuelto en DMSO (estructura secundaria no ordenada), FP agw es el péptido de fusión formando agregados (mezcla de estructura helicoidal, _ y no ordenada) en agua, M es la membrana, FP β M es el complejo formado cuando los agregados formados en agua interaccionan con las membranas, y FP β M F es el complejo péptido membrana tras producirse el proceso de fusión. El esquema cinético anterior está esquematizado en la figura 1 y en la animación que se presentan a continuación. [figura1] Figura 1. Secuencia de acontecimientos moleculares en la interacción del péptido de fusión del VIH con membranas biológicas modelo. [animación] Pinche con doble clic en el icono. Una vez abierto el archivo, con un solo clic la animación se pondrá en marcha. 4

5 Secuencia de eventos: unión de los agregados peptídicos (formados en medio acuoso) en la membrana, cambio estructural (formación de más estructura _), deshidratación de la interfaz agua-lípido, contacto entre membranas, fusión de membranas, micrografía electrónica donde se observan las membranas modelo fusionándose. (Duración 14 segundos.) Efecto del colesterol en la interacción del péptido de fusión de la proteína gp41 del VIH con membranas modelo. Importancia del potencial dipolar de membrana (Biochemistry 2006, 45, ) La fusión entre las membranas virales y celular es un acontecimiento clave en el proceso por el que el VIH entra en la célula diana. La fusión de membranas se ve facilitada por la interacción de la proteína viral gp41 con la membrana celular. Empleando péptidos sintéticos y membranas modelo, hemos determinado en el trabajo arriba mencionado que la secuencia de acontecimientos moleculares conlleva la unión del péptido a la membrana, seguida de un cambio conformacional (transformación de estructuras desordenadas y helicoidales en estructuras _ agregadas que precede a la mezcla de lípidos [fusión de membranas]). En el presente trabajo se abordó de forma sistemática la determinación de la influencia del colesterol (abundante en la membrana viral) en la secuencia de acontecimientos que llevan a la fusión de membranas. Además del conocido efecto sobre la fluidez de la membrana, el colesterol puede afectar un parámetro físico menos conocido: el potencial dipolar de membrana. Este potencial electrostático se genera en la interfaz agualípido por los dipolos eléctricos presentes en las moléculas de lípidos. Empleando el sensor fluorescente del potencial dipolar de membrana, di- 8-ANEPPS, junto con otras técnicas biofísicas (espectroscopia de infrarrojo, marcado fluorescente de membranas modelo con FPE y transferencia de energía por resonancia) hemos demostrado que el colesterol incrementa la afinidad de los péptidos de fusión por las 5

6 membranas modelo y aunque disminuye la extensión del proceso de fusión, aumenta su velocidad. La influencia del colesterol en la afinidad del péptido y en la velocidad del proceso de fusión es debida a su efecto en la magnitud del potencial dipolar de la membrana, mientras que la extensión del proceso de fusión y los efectos en los cambios conformacionales que experimenta el péptido al interaccionar con las membranas, parecen depender de otros parámetros físico-químicos asociados a la membrana, como la fluidez y el grado de hidratación. POTENCIAL DIPOLAR (? D ) Unió del FP a Membranes Velocitat Barreja de Lípids Extensió Barreja de Lípids Canvi Conformacional del FP Aspectos de la interacción del péptido de fusión del VIH dependientes de la influencia del colesterol en el potencial dipolar (izquierda) 3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos Los resultados obtenidos son, a un nivel fundamental, una contribución a la caracterización de los mecanismos moleculares que emplea el VIH para entrar en la célula huésped. El conocimiento de estos mecanismos es importante a la hora de abordar el diseño de fármacos destinados a bloquear la entrada del virus en la célula. Aunque los estudios se han llevado a cabo mediante sistemas modelo (péptidos sintéticos y 6

7 membranas modelo) y que ello supone que la extrapolación de los resultados al sistema-célula virus sea muy difícil, los conocimientos adquiridos son una información a tener en cuenta en el momento de considerar cómo interacciona el virus con la membrana celular. 4. Publicaciones Buzón, V., Padrós, E., Cladera, J. (2005) Interaction of Fusion Peptides from HIV Gp41 with membranes: A Time- Resolved, Membrane-Binding, Lipid Mixing and Structural Study. Biochemistry 44(40): Buzón, V and Cladera, J. (2006) Effect of cholesterol on the interaction of the HIV Gp41 fusion peptide with model membranes. Importance of the membrane dipole potential. Biochemistry 45,