DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-Toxocara canis EN PACIENTES CON PATOLOGÍA HEPÁTICA

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1 UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA DE TECNOLOGÍA MÉDICA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-Toxocara canis EN PACIENTES CON PATOLOGÍA HEPÁTICA MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE LICENCIADO EN TECNOLOGÍA MÉDICA ALUMNO: KARINA MORALES SILVA PROFESOR GUÍA: TM. SYLVIA VIDAL FLORES TALCA-CHILE 2005

2 INDICE 1 Resumen 3 2 Introducción 4 3 Objetivos Objetivos generales Objetivos específicos 6 4 Agente etiológico Toxocara canis Larva de Toxocara canis Huevo de Toxocara canis Ciclo biológico de Toxocara canis Transmisión de Toxocara canis en perros y humanos Toxocariasis en perros Contagio oral Infección intrauterina prenatal Infección lactogénica Infección por otros hospederos Toxocariasis en humanos Epidemiología Cuadro clínico Sindrome de Larva Migrante Visceral (LMV) Sindrome de Larva Migrante Ocular (LMO) Toxocariasis Encubierta (TE) Diagnóstico Tratamiento Profilaxis 29 5 Hígado Fisiología 32 1

3 5.2 Histología Principales patologías hepáticas Toxocariasis en el hígado 36 6 Materiales y Métodos Serología Principio del método Reactivos suministrados Materiales de laboratorio Técnica para determinación de anticuerpos anti-toxocara canis 39 7 Resultados 40 8 Discusión 45 9 Conclusiones Bibliografía 49 2

4 1 RESUMEN La toxocariasis es una parasitosis que se adquiere por la ingestión de huevos de Toxocara canis principalmente, luego hay una migración larval hacia los órganos. Esta parasitosis se manifiesta clínicamente de dos formas principalmente: toxocariasis visceral y ocular, ambas con diferentes grados de complicación. El diagnóstico de toxocariasis resulta muy dificultoso, en el hombre las larvas no completan su evolución, lo cual hace imposible el diagnóstico directo. El único método posible entonces es el diagnóstico indirecto mediante la detección de anticuerpos específicos anti-toxocara canis por técnica de ELISA, método con alta especificidad. El propósito de este estudio es determinar la presencia de anticuerpos anti-toxocara canis en pacientes con patología hepática del Hospital Regional de Talca, estas muestras provienen de zonas rurales y urbanas. Este estudio tiene como objetivos detectar anticuerpos anti-toxocara canis de tipo Ig G en el suero de pacientes con patología hepática, y a demás, calcular la prevalencia de anticuerpos anti-toxocara canis en este tipo de pacientes. También estudiar la frecuencia de anticuerpos anti-toxocara canis en pacientes con patología hepática en muestras positivas y tratar de concientizar a la población sobre la importancia de esta parasitosis. El daño en los tejidos se produce por el paso de la larva, la eosinofilia constituye un signo característico de parasitosis, los cuales se acumulan alrededor de la larva y van a provocar el daño en el hígado. El hígado es un órgano vital, que cumple funciones importantes en el organismo, por lo tanto, un daño a este nivel alterará la función normal con variadas consecuencias para el paciente, por ello es de vital importancia prevenir y detectar a tiempo esta parasitosis. 3

5 2 INTRODUCCIÓN Los humanos están en constante peligro de adquirir enfermedades parasitarias a través de los alimentos, vegetales y ambiente contaminado con heces, principal vía de contagio de parásitos. Las malas condiciones de higiene ambiental y personal favorecen la transmisión de parásitos generando un problema de Salud Pública. La contaminación de los suelos por fecas de perros está poco controlada, ya que no hay en la población hábitos culturales y conciencia de lo que significa una contaminación por parásitos. Los perros eliminan las heces en parques, plazas y lugares públicos muy concurridos por la población, esto conlleva un gran riesgo, estudios han demostrado que la mayoría de los perros han presentado en alguna etapa de su vida una parasitosis, principalmente toxocariasis. La toxocariasis es una de las más importantes zoonosis parasitarias de transmisión indirecta, por medio del suelo o vegetales contaminados con heces, son parásitos cuyo huésped habitual es el perro, pero en algún momento de su ciclo evolutivo, llegan al suelo (geoparásitos) y de allí contagian al hombre. El principal modo de infección de Toxocara canis es a través de la ingesta de huevos infectantes que contienen el estado larval II, a partir del medio ambiente contaminado, por geofagia, por medio de manos sucias o del consumo de vegetales y frutas crudas mal lavadas. Este parásito se encuentra principalmente en áreas de clima templado y tropical. Esta parasitosis se manifiesta clínicamente de dos formas principalmente: toxocariasis visceral y ocular, ambas con diferentes grados de complicación. En la toxocariasis visceral el primer órgano por donde pasa la larva es el hígado, órgano fundamental en el funcionamiento del organismo, que cumple variadas e importantes funciones, las cuales en cierta forma se van a ver alteradas por el paso de la larva. Esta parasitosis se puede 4

6 confundir muy fácilmente con otras patologías, incluso pasar inadvertida, porque su sintomatología es muy inespecífica. La toxocariasis es una parasitosis cuyo diagnóstico resulta muy dificultoso, ya que el Toxocara canis no se puede detectar directamente en humanos, porque en el hombre las larvas no completan su evolución (no ponen huevos), lo cual hace imposible el diagnóstico directo. El único método posible entonces es el diagnóstico indirecto mediante la detección de anticuerpos específicos anti-toxocara canis en sangre principalmente. La técnica serológica utilizada actualmente es un ensayo inmunoenzimático (ELISA) que utiliza como antígeno los productos de excreción secreción de larvas en fase II, es una técnica muy útil y confiable. Esta técnica de ELISA ha sido muy estudiada y estandarizada, se ha demostrado que es de alta sensibilidad y especificidad. En este estudio se analizó 56 muestras de suero de pacientes con patología hepática con el propósito de detectar anticuerpos anti-toxocara canis de tipo Ig G. Las muestras fueron recolectadas en el Hospital Regional de Talca, las cuales pertenecían a pacientes que se atienden en dicho recinto, ya sea de Talca o sus alrededores. 5

7 3 OBJETIVOS 3.1 Objetivos Generales: Detectar anticuerpos anti-toxocara canis en el suero de pacientes con patología hepática del Hospital Regional de Talca, utilizando una técnica de ELISA con un antígeno excretor-secretor para detectar anticuerpos de tipo Ig G. Calcular la prevalencia de anticuerpos anti-toxocara canis en pacientes con patología hepática del Hospital regional de Talca. 3.2 Objetivos Específicos: Estudiar la frecuencia de anticuerpos anti-toxocara canis en pacientes con patología hepática en muestras positivas. Concientizar a la población de la importancia que tiene mantener una buena higiene ambiental y personal para evitar esta parasitosis, llevando a cabo medidas profilácticas. 6

8 4 AGENTE ETIOLÓGICO. La toxocariosis es la más importante zoonosis parasitaria de transmisión indirecta, a través del suelo o vegetales contaminados (Flores A, 1992). En los humanos la toxocariasis es causada por la ingestión de huevos embrionados de parásitos del género Toxocara: Toxocara canis (principalmente) propio de los perros y probablemente también por huevos de Toxocara cati, que es el áscaris que parasita a los gatos. Son nemátodes que tienen una boca provista de tres labios bien desarrollados (fig. 5). Los machos carecen de bolsa copulatriz y de aletas caudales (Canese, A; et al. 2003). 4.1 Toxocara canis. Taxonomia. Phylum Clase Orden Género Especie : Nemátoda : Rhabditae : Ascaridida : Toxocara : canis Toxocara canis en su estado adulto se encuentra en el intestino delgado de los perros. La hembra mide alrededor de 10 cm. de longitud, los machos son de menor tamaño miden unos 6 cm. aproximadamente, dentro de sus características están que presentan tres labios desarrollados (fig. 4), también presentan dos aletas cervicales más largas que anchas en el extremo anterior (Triviño, X; et al. 1999; Toxocara canis Homepage, 2004). 7

9 Figura 4: Toxocara canis adulto al microscopio electrónico LARVA DE Toxocara canis. Toxocara canis es un nemátode, cuya denominación proviene del griego toxon que significa flecha y de askaris o gusano, es decir gusano con forma de flecha. Fue descrito por Werner en Estos parásitos miden entre 5 y 18 cm. de largo. Es un gusano cilíndrico y presenta en su extremo anterior dos prolongaciones parecidas a unas aletas y con una cabeza en forma de flecha (fig. 1). Habitan en el intestino delgado de los perros. 8

10 Figura 1: Larva de Toxocara canis HUEVOS DE Toxocara canis. Los huevos de Toxocara canis miden aproximadamente entre 75 a 90 µm. de forma casi esférica y de color pardo. Presentan una cápsula gruesa y rugosa, con muchos poros, que dan el aspecto de escamas, y con una parte germinal central que ocupa casi la totalidad del huevo. Su contenido es marrón oscuro, no segmentado (Ver figura 2 y 3). Los huevos, en gran número, se eliminan por las heces de los perros y al ser ingeridos, por niños principalmente, serán el origen de la infección de los humanos. Figura 2: Huevo de Toxocara canis (Camacho, A. 2003) Figura 3: Huevo larvado de Toxocara canis. 9

11 4.2 CICLO BIOLÓGICO DE Toxocara canis. Las hembras de Toxocara canis ponen huevos que son eliminados con las heces. Estos huevos en ambiente externo maduran, transformándose en larvas infectantes. Si estas larvas son ingeridas por el perro, se liberan de la envoltura y pasan del intestino, al hígado, pulmón, tráquea, esófago, estómago y, por último, al intestino, donde, a través de algunas transformaciones, se llega a la formación de gusanos adultos, sexualmente maduros. Esto ocurre principalmente en perros muy jóvenes. La migración somática está determinada por la ubicación de larvas latentes de toxocara en diversos órganos del perro como músculos, hígado, riñón, cerebro. Esto ocurre con mayor frecuencia en los perros adultos. Esto es muy importante para explicar cómo en las perras la localización larval somática está en condiciones de infectar al feto en el útero. Por estímulos hormonales hay un traspaso de larvas de la perra al feto. Después del nacimiento del cachorro, la larva que se había localizado en el hígado durante la vida fetal evoluciona, pasando al pulmón, tráquea, estómago, para después dar origen al gusano adulto en el intestino del cachorro. Una tercera posibilidad de contagio está determinada por la ingestión, por parte del cachorro, de larvas con la leche. Esto porque la perra puede infectarse por vía oral durante la gestación o en la fase del parto. La ingestión de huevos embrionados puede afectar no sólo al perro y otros cánidos, sino también a los huéspedes no habituales, como ratones, conejos, pollos, cerdos, ovejas, 10

12 cabras, vacas y el hombre. Los propios animales (incluido el hombre) pueden ingerir carnes o vísceras de huéspedes no habituales, conteniendo larvas dormidas. En el caso del hombre los más propensos son los niños de 2 a 5 años que ingieren tierra de areneros que comparten con los perros, donde pueden ingerir huevos larvados, también cuando son lamidos por perros infectados o tocar a un perro cerca del ano donde puede haber huevos, de todas maneras el huevo de áscaris necesita un tiempo de maduración en el suelo. Las larvas liberadas de los huevos embrionados, realizan una migración entero-hepatopulmonar somática, con la distribución en diversos órganos (hígado, pulmones, musculatura, riñones) llamadas larva migrante visceral y cuando afecta al ojo larva migrante ocular (Fernández, E; Santillan, G. 2000). En la figura 5 se ilustra gráficamente el ciclo de vida de Toxocara canis. 11

13 Figura 5: Ciclo biológico de Toxocara canis. 4.3 TRANSMISIÓN DE Toxocara canis EN PERROS Y HUMANOS. Existen variadas vías de transmisión de esta parasitosis en los perros, es por ello que su ciclo de vida es complejo e inusual. Existe una vía de transmisión directa y otra via indirecta, en los humanos sólo se conoce la transmisión por vía directa. Perros: Ingestión de huevo embrionado, ingesta de roedores, cucarachas o lombrices. Vía transplacentaria o a través de la via lactogénica. La ingestión del huevo embrionado produce la parasitosis. Los perros defecan en el suelo y depositan junto con las materias fecales los huevos del agente. Luego los huevos embrionan, posteriormente este huevo embrionado será ingerido por un humano. En el hombre: Ingestión de huevo embrionado desde el suelo (transmisión directa del huevo larvado). Se ha realizado estudios donde se deduce que los cachorros de perros menores de 6 meses son los más afectados, constituyendo de ese modo el contacto de mayor riesgo. La asociación del hombre con el perro ha generado una fuerte contaminación con huevos de este nematodo en parques, campos de juego, jardines y casas. Toxocara canis desarrolla su estado adulto en el intestino delgado del perro, donde cada hembra produce huevos por día que son eliminados al medio ambiente y se vuelven infectantes en 2 a 5 semanas. 12

14 Los huevos necesitan condiciones típicas adecuadas para la formación del embrión o de la larva: temperatura adecuada, suficiente humedad, suelos arenosos y sombreados. Estos huevos luego de ser embrionados son muy resistentes, esto les permite permanecer viables en el suelo durantes mucho tiempo (meses o años). La mayoría de los perros han sido parasitados por Toxocara canis, pero no todos han presentado manifestaciones clínicas, por lo tanto la parasitosis ha pasado inadvertida. Esta enfermedad es muy frecuente en niños menores de 5 años porque ellos juegan con los perros y en el suelo; un factor predisponente para que se de en niños es la pobre higiene ambiental y personal. Los animales no siempre son desparasitados, hay poca higiene en el ambiente al no limpiar las fecas del perro, a demás los niños no tienen la costumbre de lavarse las manos antes de comer o después de haber jugado con tierra contaminada TOXOCARIASIS EN PERROS. El ciclo evolutivo de Toxocara canis está bien descrito por Buenaventura (1973) y bien resumido por Prats (1991) Contagio oral Los vermes adultos, ubicados en el intestino delgado del hospedador definitivo, ponen huevos fecundados que son eliminados al medio ambiente junto con las heces. En pocos días los huevos embrionan a larva I y mudan a larva en fase II el cual es el estado infectante para el humano, dependiendo de las condiciones ambientales, tales como temperatura entre 25º a 35º y humedad. Estos huevos luego de ser embrionados son muy 13

15 resistentes, esto les permite permanecer viables en el suelo durantes mucho tiempo, incluso meses o años. La estructura de la cáscara del huevo con varias capas, la externa albuminosa, otras tres quitinosas, otra fibrilar e internamente la capa lipoidea, condiciona una fuerte resistencia frente a las agresiones del medio externo, en cualquier fase del desarrollo. Resisten perfectamente el frío y en condiciones óptimas de humedad y temperatura pueden conservar su vitalidad durante meses. La luz solar intensa, la desecación y las temperaturas superiores destruyen los huevos en pocos minutos. Los huevos al ser ingeridos, conteniendo larvas en fase II, por un posible hospedador, se disuelve la cubierta por acción de las enzimas digestivas, quedando libres las larvas en fase II en el intestino, a continuación ocurre una migración hemopulmonar de las larvas atravesando la mucosa intestinal, pasando por hígado y pulmón, desde donde son expectoradas y deglutidas de nuevo hasta el intestino delgado de los perros donde maduran a gusanos adultos que luego de 28 días comienzan a poner huevos los cuales son eliminados por las heces, esto es característico de Toxocara canis en perros jóvenes. En los perros adultos, las larvas tipo II de Toxocara canis migran hacia diversos tejidos somáticos (músculos esqueléticos, hígado, riñón), donde quedan encapsuladas y latentes, formando granulomas ascaridiales. La progresión de las larvas por vía hemopulmonar hacia el intestino para transformarse en vermes adultos, es rara en perros de mayor edad, sólo ocurre en perros jóvenes. La infección oral puede hacerse de forma directa por ingestión de huevos embrionados (consumo de heces, tierra, objetos al lamer); o bien indirecta, con la intervención de un hospedador intermediario, que actúan únicamente de vectores, como ratón, cucaracha, lombrices de tierra o caracoles. 14

16 Infección intrauterina prenatal Las larvas en estado II encapsuladas, latentes en los tejidos corporales de la perra adulta, después de los 40 días de gestación, abandonan su quiescencia, migrando hacia el útero, atravesando la placenta e invaden los tejidos fetales, favorecido por las hormonas. Las larvas pasan a los perros que se encuentran en el útero de la perra y al momento del nacimiento, en los cachorros se encuentran ya larvas III de Toxocara canis en sus pulmones, existiendo al 9º día postnacimiento vermes adultos inmaduros en el intestino y huevos en las heces a los 23 días Infección lactogénica La transmisión de larvas por leche materna es otra vía de contagio, donde los cachorros se pueden contagiar hasta la quinta semana de lactancia, por ello es muy común que los cachorros se infecten muy pequeños. A demás algunas larvas llegan al intestino de la madre, maduran a vermes adultos y comienzan a poner huevos a las dos semanas postparto Infección por hospederos. Cuando un vector consume los huevos maduros del suelo, las larvas permanecen en un estado de latencia en los órganos del vector por unas cuantas semanas. Cuando el perro consume el vector en el periodo anteriormente señalado, las larvas pasan al intestino del perro o a los tejidos de este, generándose otra vía de contagio para el perro (Flores, A. 1992). 15

17 4.3.2 TOXOCARIASIS EN HUMANOS. Los humanos sólo tienen una vía de contagio y es consumiendo huevos maduros de Toxocara canis, estos huevos liberan larvas que se van luego por la circulación a los diferentes órganos, principalmente el hígado. Estas no llegan al intestino del humano, por lo tanto no desarrollan su estado adulto y no se eliminan huevos por las heces, por lo tanto no se puede detectar en las heces de los humanos en un parasicológico seriado de deposiciones. La toxocariasis humana afecta principalmente a los niños. Los niños con antecedentes de pica o geofagia son el grupo de mayor riesgo, aunque también se ha diagnosticado en adultos. La toxocariasis es causada por la migración de larvas de Toxocara canis a los órganos internos y ojos; por ello la toxocariasis humana se conoce con el nombre de síndrome de larva migrante visceral (LMV). Los niños se infectan por la ingestión accidental de huevos de dichos nematodos al masticar tierra contaminada, comer vegetales contaminados, llevarse a la boca objetos contaminados, jugar o acariciar perros con toxocariasis. Los lugares más contaminados por estos huevos suelen ser jardines, parques públicos, lugares de juego, veredas de grandes ciudades y cualquier tipo de suelo muy frecuentado por perros o personas. 16

18 Los niños que presentan mayor riesgo son los que tienen entre un año y medio y cinco años, precisamente por la costumbre de llevarse todo a la boca y por desconocimiento del peligro. La reacción inmunológica de defensa da lugar a la formación de granulomas eosinófilos del tipo Loeffer, con marcada patogenia relacionada con los fenómenos de hipersensibilidad, lo que supone que la sintomatología es mucho más significativa en las reinfecciones, con significativa característica alérgica, en ocasiones de pronóstico grave. A pesar que la mayoría de las veces la enfermedad evoluciona hacia la curación, ya que las larvas se encapsulan y mueren en el plazo de semanas o meses, en ocasiones el síndrome de LMV es de pronóstico grave y puede terminar con la muerte de ciertos pacientes. Histológicamente el granuloma típico por Toxocara canis se describe como un núcleo constituido por la larva, que está rodeada de eosinófilos en desintegración y tejido conjuntivo con alteración fibrinoide intensa, con un halo periférico de células epiteliales y macrófagos (Nolasco, F. 1997; Sapunar, J. et al. 1999). 17

19 4.4 EPIDEMIOLOGIA. La exposición humana a la toxocariasis se debe a la elevada prevalencia de esta parasitosis en perros, a demás del gran número de perros que comparten el ambiente con los seres humanos. Los huevos de Toxocara canis eliminados por el perro (cada hembra elimina huevos diarios) no son infectantes inmediatamente, requieren de un período de incubación en el medio ambiente bajo determinadas condiciones para llegar a serlo. Overgaauw demostró que los huevos eliminados por las heces requieren al menos dos semanas de maduración bajo una temperatura entre 15 a 35º C y una cierta humedad (85%) para llegar a la fase larval II. Estos huevos son resistentes por su estructura, cáscara gruesa e impermeable, por lo que pueden perdurar viables por períodos prolongados (meses o años). Los huevos soportan temperaturas entre -10 a 45º C, la luz y la humedad, por ello sobreviven meses o años. La toxocariasis canina es cosmopolita, prevalece en regiones templadas y tropicales del mundo. No se conoce la real incidencia de toxocariasis humana ya que esta enfermedad no se notifica en el ámbito epidemiológico por su difícil diagnóstico. Esta parasitosis es más común en los lugares donde hay una mayor cantidad de perros, específicamente en lugares rurales donde los perros permanecen casi todo del tiempo cerca de las personas, los perros defecan en cualquier parte y como hay malas condiciones de 18

20 higiene y buenas condiciones ambientales que permiten que el huevo sobreviva, los niños juegan con tierra e ingieren el huevo larvado adquiriendo la infección. Existen numerosos estudios sobre la prevalencia de portación de Toxocara canis en perros, muestras de suelos o en humanos, principalmente niños que son los más expuestos a esta parasitosis, se han obtenido variados porcentajes de prevalencia de anticuerpos anti- Toxocara canis a nivel mundial los cuales fluctúan entre 3.5 y 86%, estos se resumen en la tabla 1. Tabla 1: Prevalencia de anticuerpos anti-toxocara canis a nivel mundial (Castillo, Y, et al. 2001; Garcia, M. et al. 2004; Navarrete, N, et al. 1998). País Porc entaje (%) Chile 75 U.S.S.R 17.8 Japón 3.6 Polonia 3.5 Gran Bretaña 14.3 España 8 Irán 25.6 Estados Unidos 4 a 33 México 7.5 Islas de Santa Lucia 86 Trinidad 27.2 Cuba 5.2 Argentina 37.9 a 63 Brasil 3.46 a 38.8 Los porcentajes que se detallan en la tabla 1 dependen de las condiciones climáticas, socioeconómicas y culturales de cada zona lo que permite un mayor o menor desarrollo del huevo a estadio larval II, estado infectante para los humanos. 19

21 La prevalencia de toxocariasis en humanos depende del lugar o región geográfica y el tipo de población, ya sea rural o urbana, edad, condiciones sanitarias y de higiene (Castillo, Y, et al. 2001; Garcia, M, et al. 2004; Navarrete, N, et al. 1998). 4.5 CUADRO CLÍNICO Cuando el hombre ingiere los huevos de Toxocara canis, las larvas que se liberan en el intestino delgado atraviesan la pared intestinal, por vía linfática y luego por vía venosa llegando a la circulación general, dando origen a dos síndromes: larva migrante visceral (LMV) y larva migrante ocular (LMO). Glikman en el año 1987 describió una forma clínica indiferenciada que observó en algunas personas adultas en Francia a la que llamo Toxocariasis encubierta. El cuadro clínico depende del número de huevos larvados que ingiera la persona y la cantidad de larvas en estado II que se liberen por vía linfática a la circulación general. El parásito luego que ingresa a la circulación se caracteriza por migrar a todos los sitios anatómicos, de los cuales los órganos más afectados son: hígado, pulmón, cerebro, ojos, corazón y músculo esquelético. Las larvas que invaden el órgano posteriormente forman granulomas de cuerpo extraño con infiltración de eosinófilos, linfocitos, células cebadas y células epiteliales de gran tamaño, lo cual recibe el nombre de reacción granulomatosa. En estos granulomas eosinofílicos las larvas pueden sobrevivir bastante tiempo hasta que se calcifican, formando una lesión. El organismo como un mecanismo de defensa forma una pared fibrosa alrededor para detener este proceso hasta que se calcifican estas granulaciones (Ghiani, H. 2001) Síndrome de Larva Migrante Visceral (LMV). 20

22 En 1952 Beaver y cols. fueron los primeros en identificar las larvas de Toxocara canis en una biopsia de hígado, de un niño de 2 años y medio. El daño en los tejidos se produce por el paso del agente (mecánico) y por la respuesta inmune que genera, una de las cuales es el aumento de eosinófilos en sangre. De este modo la eosinofilia constituye un signo que caracteriza la enfermedad. La gravedad del cuadro clínico depende del número de larvas que invadan los tejidos, del tejido invadido, de la duración de la infección y otros factores relacionados con el paciente y su estado inmune. Las infecciones pasajeras acostumbran ser asintomáticas. El síndrome de larva migrante visceral afecta prioritariamente a niños menores de 6 años con hábitos de geofagia, de sectores rurales y contacto con perros, estos suelen presentar pérdida de peso, astenia, anorexia, tos, fiebre, sibilancias y otros síntomas generales. Los signos clínicos dependen del lugar donde se ubique la larva de Toxocara canis, los cuales se pueden confundir con otras patologías porque no son específicos de esta parasitosis. El hígado es el órgano más afectado por las larvas de Toxocara canis (Ver figura 6 y 7), es por acá por donde comienza su recorrido la larva. El hígado es un órgano vital y cumple variadas e importantes funciones, por lo tanto, un daño a este nivel podría ser muy grave e incluso provocar la muerte. Las principales manifestaciones clínicas incluyen: fiebre, leucocitosis, eosinofilia, hipergamaglobulinemia y hepatomegalia. Otras manifestaciones incluyen malestar general, tos y en casos muy aislados neumonía, miocarditis y encefalitis. 21

23 Síntomas de LMV según órgano afectado. Hígado: Hepatomegalia, síndrome febril prolongado, dolor en el hipocondrio derecho. Pulmón: Síndrome respiratorio con bronco espasmo y neumonitis, crisis de asma, tos, obstrucción bronquial, desgarros, síndrome de Löefler. Cerebro: Alteraciones de conciencia, convulsiones, hemiplegia, encefalitis. Corazón: Miocarditis, insuficiencia cardiaca. Figura 6: Hígado con larvas de Toxocara canis. Figura 7: Granuloma hepático por Toxocara canis Síndrome de Larva Migrante Ocular (LMO). 22

24 La larva migrante ocular fue identificada en 1950 por Helenor C. Wilde, al estudiar ojos enucleados con el presunto diagnóstico de retinoblastoma donde encontró que algunos pacientes tenían en sus ojos granulomas con eosinófilos y larvas de nemátodes. La toxocariasis ocular puede confundirse clínicamente con el retinoblastoma. La lesión es unilateral, las larvas se ubican en el cuerpo vítreo o superficie interna de retina y puede llevar a la ceguera. La clínica de la toxocariasis ocular se encuentra asociada a la formación de un granuloma en el polo posterior por lo que, en ocasiones, ha mimetizado un estado temprano de retinoblastoma induciendo a la pérdida total o parcial de la visión en 1 o en los 2 ojos, lo que ha motivado, en algunos casos, la enucleación innecesaria del ojo afectado. También se ha asociado a otras alteraciones como granuloma en la retina periférica, endoftalmitis y uveítis. Otras menos comunes incluyen absceso vítreo, neuritis óptica, queratitis o estrabismo secundario. La patología de la toxocariasis ocular está asociada a lesiones hemorrágicas en las que se observan áreas de necrosis. Las larvas no migran continuamente y durante los períodos de movimiento reducido son el foco de una respuesta de tipo inflamatoria que favorece la formación de un granuloma eosinofílico alrededor de la misma que queda inmovilizada, siendo destruida. Los síntomas y signos de la toxocariasis ocular son: Disminución de la agudeza visual, dolor ocular, estrabismo, leucocoria (pupila blanca), conjuntivitis, enrojecimiento del ojo, desprendimiento de retina, ceguera y se observan valores normales de eosinófilos (Fenoy, S. et al. 2002). 23

25 Figura 8: Granuloma en la retina por Toxocara canis. Figura 9: Tejido de retina con larvas de Toxocara canis Toxocariasis Encubierta o Asintomática (TE). En el año 1987 Glikman describió una forma clínica indiferenciada que observó en algunas personas adultas en Francia a la que llamo Toxocariasis encubierta. Este tipo de toxocariasis es mal diagnosticada porque ocurre en modalidades subclínicas, apenas identificable por pruebas serológicas, con sintomatología inespecífica. Se presenta con un predominio de fiebre, agitación, trastornos del sueño, con síntomas asociados a LMV pero más atenuada. Debido a la inespecificidad de los síntomas se confunde fácilmente con estados febriles asociados a infecciones bacterianas o virales, comunes en niños. La presencia de eosinofilia, hepatomegalia y múltiples adenopatías se deben considerar para detectar toxocariasis en el diagnóstico diferencial, considerando a demás el contacto con perros o la presencia en lugares contaminados con heces de perros con toxocariasis. Puede cursar con 24

26 valores normales de eosinófilos o leve eosinofília (Del Valle, G. 2002; Espinoza, Y. 2003; Logar, J. 2004; Sapunar, J. 1999). 4.6 DIAGNÓSTICO. La toxocariasis es una parasitosis que en humanos es de muy difícil diagnóstico, ya que el estadio larval de Toxocara canis no puede ser detectado directamente, salvo por estudios histológicos que se realizan post mortem, el hallazgo de las larvas en tejidos mediante biopsias de los granulomas es un hecho excepcional. Por otro lado, como en el ser humano las larvas no completan su evolución, no hay eliminación de huevos por las heces, lo cual hace imposible el diagnóstico directo. El único método útil y sensible es el diagnóstico indirecto mediante la detección de anticuerpos específicos en suero. El diagnóstico presenta una serie de dificultades entre las que se encuentran la falta de formas de diseminación parasitaria que permitan el diagnóstico morfológico, la inespecificidad de la sintomatología clínica y el número de reacciones cruzadas entre Toxocara canis y otros nemátodos (como por ejemplo Ascaris lumbricoides). Se puede realizar un diagnóstico presuntivo de síndrome de larva migrante visceral por este parásito, a través de signos clínicos, resultados de laboratorio, hábitos de geofagia y exposición del paciente a perros pequeños. Existe un diagnóstico clínico donde se observa malestar general y hepatomegalia cuando es el hígado el órgano afectado. A demás existen síntomas y signos inespecíficos, tales 25

27 como leucocitosis, eosinofília persistente y elevada, hipergamaglobulinemia (Ig G, Ig M, Ig E), aumento de título de isohematoaglutininas anti-a y anti-b. La confirmación del diagnóstico deberá realizarse con la búsqueda de anticuerpos específicos (de tipo Ig G) en el suero del paciente a través de pruebas serológicas. Las pruebas que utilizan antígenos larvales o sus productos metabólicos han resultado ser más sensibles y dichos antígenos han sido adaptados a las pruebas de ELISA. La especificidad de la técnica de ELISA se ha mejorado con la absorción de anticuerpos susceptibles de causar reacciones cruzadas con antígenos de nemátodes que tiene antígenos en común con Toxocara canis (Bojanich, M; et al. 2000). La presencia de las larvas en el organismo del huésped constituye un estímulo antigénico que desencadena una respuesta inmune por parte del individuo afectado. Esta respuesta es humoral, con aumento de inmunoglobulinas específicas e inespecíficas que incluye Ig G, Ig M e Ig E, y celular con formación de granulomas en torno a las larvas. Debido a esta respuesta inmune es posible detectar los anticuerpos en el suero del paciente, lo cual nos va a servir para detectar la parasitosis por el test de ELISA. La sensibilidad de la técnica de ELISA, que se utiliza actualmente, varia entre un 78 y 90.3% y tiene una especificidad entre un 76.9 y 100%. Esta es una técnica de fase sólida que utiliza antígeno excretor/secretor, obtenido de larvas de Toxocara canis en fase larval II cultivadas in vitro. La ecotomografía abdominal puede detectar nódulos en el hígado. La técnica que confirma el diagnóstico luego de realizar la técnica de ELISA es el Western blot, esta es una técnica de difícil acceso y de alto costo, por ello no tan utilizada (Yamasaki, H. et al. 2000). 26

28 4.7 TRATAMIENTO. El tratamiento de la toxocariasis se basa en fármacos antiparasitarios y antiinflamatorios. El fármaco preferentemente utilizado es Tiabendazol que se administra en una dosis de 25 a 50 mg/kg de peso/día, dos veces al día, por un periodo de 10 a 15 días, a demás se asocia con corticoesteroides para reducir la inflamación, con lo cual se ha obtenido muy buenos resultados. Se obtiene una respuesta terapéutica en 3 a 7 días después de aplicado el antiparasitario. Otro antiparasitario utilizado satisfactoriamente es Albendazol, este se administra en dosis de 400 mg/día durante 7 a 10 días. El uso de Ivermectina 200 mg/kg/día durante tres días ha sido contradictorio (Sapunar J. et al,. 1999). Tiabendazol. Es un derivado del benzimidazol con intensa actividad sobre diversos nemátodes que parasitan el tracto gastrointestinal. También tienen acción sobre huevos y larvas. 27

29 Su mecanismo de acción consiste en la inhibición de la enzima fumarato-reductasa, que es específica de las mitocondrias de algunos nemátodes. Se absorbe muy bien y con rapidez en el tracto digestivo logrando buenas concentraciones plasmáticas. Se distribuye ampliamente y casi toda la droga se elimina por la orina en 24 horas como 5-hidroxitiabendazol. Este fármaco provoca reacciones adversas como: anorexia, nausea, vómitos, fiebre, diarrea, malestar epigástrico, mareos, cefalea y reacciones de hipersensibilidad. Albendazol. Es un derivado benzimidazólico con potente efecto antihelmintico. Actua bloqueando la captación de glucosa por los parásitos intestinales y sus larvas, provocando una disminución de la energía y la mue rte del parásito. Se absorve parcialmente a nivel entérico, distribuyendose por todo el organismo. Se metaboliza en el hígado transformandose en sulfoxido de albendazol, excretandose en esa forma por la orina. El resto de la droga es eliminado por las heces. Es en general bien tolerado. Los efectos adversos más frecuentes son: náuseas, vómitos, dolor abdominal, vértigo, dolor de cabeza y alteraciones hepáticas. Ivermectina. Es un derivado de avermectina 1 obtenida de la fermentación del caldo de cultivo de un hongo llamado Streptomyces avermitilis. 28

30 Es efectiva en dosis oral única y alcanza concentraciones séricas a las 4 o 5 horas de ser administrada. Se une a las proteínas plasmáticas y se concentra en el hígado y el tejido adiposo. Un pequeño porcentaje se excreta por la orina y el resto por las heces. La tolerancia suele ser buena. La ivermectina está contraindicada en todos los casos en que esté alterada la barrera hematoencefálica, como en la meningitis, por los efectos que tiene la droga sobre los receptores GABA del SNC, también en los enfermos que están siendo tratados con sustancias depresoras del SNC. No se recomienda su uso en menores de 5 años y en las embarazadas (Palmieri O. Terapéutica antiparasitaria. Tercera edición ). 4.8 PROFILAXIS. Frente a la toxocariasis que es una parasitosis de difícil diagnóstico en humanos, es fundamental llevar a cabo medidas profilácticas para prevenir la contaminación de los suelos y así evitar el paso de la larva al humano, principalmente a los niños que son los más expuestos a Toxocara canis. La profilaxis se basa en dos etapas fundamentales para prevenir la infección por Toxocara canis, las cuales se detallan a continuación: Desparasitación periódica de los perros. Desparasitar los cachorros entre los 7 y 14 días después del nacimiento, repitiendo mensualmente la desparasitación hasta los 3 meses de vida y cada 2 a 3 meses hasta cumplir el año. 29

31 Los perros adultos se desparasitan 2 a 4 veces al año dependiendo del nivel de riesgo, de acuerdo al lugar donde se desarrolla el perro. Las hembras en gestación se desparasitarán 10 a 15 días antes de la posible fecha de nacimiento del cachorro e inmediatamente después del parto, para prevenir la infección intrauterina o lactogénica. Esta desparacitación debe ser controlada y guiada por un veterinario, el cual va ha indicar la dosis a administrar. Medidas de higiene en la población. Evitar o prohibir que los perros defequen en lugares públicos, de lo contrario retirar las heces inmediatamente y eliminarlas en forma adecuada. Crear conciencia cívica y de educación ciudadana, sobre un buen lavado de manos, evitar que los niños jueguen con tierra, lavar prolijamente frutas y verduras que se consuman crudas. Habilitar lugares estratégicos para cubrir las necesidades biológicas de los perros. Educar a la población sobre esta parasitosis, la cual puede llegar a ser muy grave dependiendo del órgano afectado (Flores, A. 1992). 30

32 5 HÍGADO. El hígado es el órgano interno más grande del cuerpo pesa en un adulto alrededor de un kilo y medio. El hígado está localizado en la región del hipocondrio derecho del abdomen, llenando el espacio de la cúpula diafragmática, en donde puede alcanzar hasta la quinta costilla. Normalmente es blando y depresible, recubierto por una cápsula fibrosa, sobre esta cápsula se ubica el peritoneo en la mayor parte de la superficie del hígado. El hígado está dividido en cuatro lóbulos: lóbulo derecho (más voluminoso), lóbulo izquierdo (extendido sobre el estómago), lóbulo cuadrado (de menor tamaño que los anteriores) entre la fosa de la vesícula biliar y el ligamento redondo y lóbulo caudado, situado en la parte posterior de la base del hígado, entre el surco de la vena cava inferior y la fisura del ligamento venoso (Ver figura 7) (Highleyman. L. et al; 2003; MCG Health System, 2005). 31

33 Figura 10: Esquema de la cara superior del hígado. 5.1 Fisiología del Hígado. El hígado desempeña múltiples funciones en el organismo tales como: - Producción de bilis. - Metabolismo de los carbohidratos: Gluconeogénesis, Glucogenólisis, Glucogenogénesis. - Eliminación de insulina y de otras hormonas. - Metabolismo de los lípidos. - Síntesis de proteínas. - Síntesis de factores de coagulación como fibrinógeno, factores III, V, VII, IX y XI. - Neutralización de toxinas, la mayoría de los fármacos y de la hemoglobina. - Transformación de amonio en urea. - Depósito de múltiples sustancias como glucosa en forma de glucógeno, vitamina B12, hierro, cobre, etc. - En el primer trimestre del embarazo, el hígado es el principal órgano de producción de glóbulos rojos (Zúñiga, S. 2004). 32

34 5.2 Histología del Hígado. El tejido hepático presenta una gran capacidad de regeneración en respuesta a estímulos externos, como lesiones o procesos tumorales. Sin embargo las lesiones crónicas como el alcoholismo e infecciones hepáticas implican una pérdida constante y prolongada del parénquima sin existir proliferación compensatoria. Como resultado el parénquima hepático es reemplazado por tejido fibroso, acúmulos de grasa y cirrosis. El parénquima hepático está formado por: lobulillos hepáticos, sinusoides hepáticos, espacio de Disse, células de Küffer (su función es fagocitar eritrocitos envejecidos y otros antígenos). Los hepatocitos constituyen alrededor del 80% de la población celular del tejido hepático. Son células poliédricas con 1 ó 2 núcleos esféricos poliploides y nucléolo prominente. Presentan un citoplasma acidófilo con cuerpos basófilos y ricos en organelos. Además en su citoplasma contienen inclusiones de glucógeno y grasa. La membrana plasmática de dos hepatocitos contiguos delimita un canalículo donde será secretada la bilis. La presencia de múltiples organelos en el hepatocito se relaciona con sus múltiples funciones, como son la síntesis de proteínas, el metabolismo de hidratos de carbono, la formación de bilis, el catabolismo de fármacos, tóxicos y el metabolismo de lípidos, purinas y gluconeogénesis (Zúñiga, S. 2004). 5.3 Principales Patologías Hepáticas. 33

35 Las principales patologías que afectan el hígado son: hepatitis, cirrosis hepática, hepatocarcinoma, hipertensión portal, etc. Hepatitis. La hepatitis es una enfermedad inflamatoria que afecta al hígado. Su causa puede ser infecciosa (viral, bacteriana, etc.), inmunológica (por auto-anticuerpos) o tóxica (por alcohol, venenos o fármacos). La hepatitis se puede resolver rápidamente (hepatitis aguda) o puede causar una enfermedad a largo plazo (hepatitis crónica) y, en algunos casos, se puede presentar un daño hepático progresivo o insuficiencia hepática. La severidad de la hepatitis varía dependiendo de muchos factores, incluyendo la causa del daño hepático y cualquier enfermedad subyacente en el paciente. La causa más común de hepatitis son los virus, principalmente virus A, B, C, D y G. Tanto la hepatitis A como la E son enfermedades agudas. Se diseminan a través del contacto con materia fecal, ya sea directo o través de alimentos que fueron tocados por alguien con manos contaminadas. La hepatitis B puede ser transmitida entre miembros de una familia, o a través del contacto sexual y de sangre infectada. Aproximadamente el 7% de las personas infectadas con VIH que adquieren hepatitis B desarrollan enfermedad crónica La hepatitis C generalmente se disemina por contacto con sangre o agujas contaminadas, puede ser muy leve o no mostrar síntomas, pero puede causar daño hepático severo 10 años después de la infección inicial. Casi todos los que adquieren hepatitis C se convierten en portadores. 34

36 La hepatitis D solo se manifiesta en personas que adquieren hepatitis B, el virus de la hepatitis D es incompleto y requiere del virus de la hepatitis B para poder producir la patología (Quiñones, A ). Cirrosis hepática. La cirrosis hepática es la consecuencia final de muchas enfermedades hepáticas crónicas que lleva a la pérdida de la arquitectura normal del hígado y una disminución progresiva de sus funciones. Cualquier enfermedad que produzca una inflamación crónica del hígado puede llegar a producir cirrosis. La cirrosis se define por las alteraciones estructurales que aparecen en el hígado. Las fundamentales son tres: necrosis hepatocelular, fibrosis y nódulos de regeneración. Las principales causas de cirrosis son dos: consumo excesivo de alcohol y hepatitis crónica por virus C. Además, se puede producir cirrosis por hepatitis crónica por virus B, por infección crónica mixta por virus B y D, por enfermedades colestásicas crónicas y por enfermedades metabólicas congénitas del hígado que se manifiestan en la vida adulta, como la hemocromatosis primaria. El principio de la cirrosis es por lo general silencioso siendo muy pocos los síntomas específicos. A medida que se acumula el daño en el hígado, pueden aparecer los siguientes síntomas: ictericia, pérdida de apetito, malestar general, náusea, vómitos, pérdida de peso, hepatomegalia (Soza, A. 2000; Duarte, I ) Hepatocarcinoma. 35

37 El hígado es uno de los órganos en el que más frecuentemente aparecen tumores malignos. La mayoría de ellos constan de células de tumores que, habiéndose originado en otro órgano, han alcanzado el hígado a través de la sangre: son los tumores secundarios o metastásicos. Cuando las células nacen del propio hígado se habla de tumores primarios del hígado que son dos: hepatocarcinoma y colangiocarcinoma. El hepatocarcinoma es la consecuencia de una enfermedad hepática de larga evolución, que en la mayoría de los casos es una hepatitis crónica. Los virus de la hepatitis B y C producen a veces cirrosis y algunos de los pacientes con cirrosis desarrollan tumores en el hígado. Las cirrosis de otro origen, como el alcohol o trastornos metabólicos, también predisponen a la aparición de hepatocarcinoma. Los tumores pequeños pueden presentar síntomas porque obstruyen la vía biliar y aparece ictericia. Cuando los tumores van creciendo sin dar problemas, los síntomas comienzan en forma de cansancio intenso, falta de apetito, pérdida de peso sin explicación, dolor bajo las costillas derechas (Bienestar y medicina para todos, Duarte, I. 2001). 5.4 Toxocariasis en el hígado. La toxocariasis es una parasitosis que afecta principalmente al hígado y es muy común en personas que viven en lugares rurales. El huevo del parásito luego de ser ingerido por el humano libera la larva, la cual va a llegar al hígado y va a provocar el daño en este órgano. Cuando hay localización hepática de Toxocara canis se encuentra hepatomegalia con pruebas hepáticas normales o levemente alteradas, en la ecotomografía y TAC se pueden evidenciar pequeños nódulos pudiendo la biopsia poner en evidencia la etiología de los focos granulomatosos. 36

38 El hígado es un órgano vital lleva a cabo vitales e importantes funciones, el paso de la larva va a provocar un daño a este nivel que podría ser muy grave e incluso provocar la muerte (Nolasco, F. 1997; Triviño, X. 1999) 6 MATERIALES Y MÉTODOS. Se llevó a cabo un estudio para detectar anticuerpos específicos anti-toxocara canis en el suero de pacientes con patología hepática, mediante una técnica de ELISA. El estudio se hizo con 56 muestras de suero obtenidas de pacientes con patología hepática del Hospital Regional de Talca, estas muestras fueron elegidas al azar. 6.1 Serología En este estudio se utilizó un test de ELISA para detectar anticuerpos anti-toxocara canis, el test de ELISA para Toxocara canis utilizado es un test rápido que detecta anticuerpos de tipo Ig G, Kit Toxocara Microwell Serum ELISA, de Diagnostic Automation, Inc. 6.2 Principio del Método. 37

39 Cada pocillo de la microplaca de ELISA contiene antígeno excretor/secretor de la larva de Toxocara canis. Durante la primera incubación el suero diluido del paciente (1/64) que contiene el anticuerpo (cuando es reactivo) reacciona con el antígeno presente en el pocillo. El exceso de anticuerpo que no se unió es eliminado posteriormente con los lavados, después se adiciona el conjugado enzimático. Después de una serie de lavados, se adiciona el cromógeno TMB (tetrametilbenzidina), si el conjugado enzimático está presente, la peroxidasa puede catalizar una reacción que consume el peróxido y el cromógeno se torna de color azul cuando el suero presenta anticuerpos anti-toxocara canis de tipo Ig G. La adición de la solución stop detiene la reacción y cambia de azul a amarillo por un cambio de ph. La cantidad de anticuerpo es proporcional al color que presente la reacción del pocillo. 6.3 Reactivos suministrados. - Microplaca con antigeno excretor/secretor de Toxocara canis para 96 determinaciones. - Conjugado enzimático (6ml de proteína A conjugada con peroxidasa) - Control positivo (1 ml de suero de conejo positivo diluido) - Control negativo (1 ml de suero humano negativo diluido) - Cromógeno (11 ml de tetrametilbenzidina) - Solución de lavado (25 ml de buffer concentrado y surfactante) - Buffer diluyente de muestra (30 ml de buffer) - Solución stop (11 ml de ácido fosfórico 1 M) 38

40 6.4 Materiales de laboratorio. - Pipetas de precisión de 5 a 10, 100 a 1000 µl y puntas desechables. - Tubos ependorf - Agua destilada - Matraz de 1 litro. - Gradillas. - Guantes. 6.5 Técnica para determinación de anticuerpos anti-toxocara canis. 1.- En primer lugar las muestras y reactivos se llevaron a temperatura ambiente 30 minutos antes de ser utilizados. 2.- La solución de lavado se diluyó 1 en 20 con agua destilada y las muestras 1:64 con diluente de muestra. 3.- Adición de 100 µl de control negativo al pocillo 1 y 2, 100 µl de control positivo al pocillo 3 y 100 µl de muestra diluida 1/64 a los pocillos restantes. 4.- Incubación a temperatura ambiente por 10 minutos de la placa, en esta etapa los anticuerpos presentes en la muestra se van a unir al antígeno pegado a la placa. 5.- Se elimina el contenido de los pocillos y se lavan las celdas 3 veces con solución de lavado diluida, para eliminar los anticuerpos que no se unieron. 6.- Se agregan 2 gotas de conjugado enzimático a cada pocillo y se incuba por 5 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. 39

41 7.- Se elimina el contenido de los pocillos y se lavan las celdas 3 veces con solución de lavado. La placa se seca invirtiéndola sobre papel absorbente para eliminar el exceso de muestra. 8.- Adición de 2 gotas de cromógeno (TMB) a cada pocillo y se incuba a temperatura ambiente y en la oscuridad por 5 minutos. 9.- Finalizada la incubación se agregan 2 gotas de solución stop para detener la reacción. 7 RESULTADOS. En la tabla 2 se observan los resultados obtenidos de las 56 muestras analizadas por test de ELISA con antígeno excretor/secretor para detección de anticuerpos anti-toxocara canis de tipo Ig G. Se informa las reacciones p ositivas o negativas de cada muestra analizada, de acuerdo a intensidad obtenida con cruces, comparadas con los contro les positivos y negativos. No se realizó lectura por lector de ELISA. Tabla 2: Resultados serología de Toxocara canis. Numero de muestra Reacción positiva o negativa Intensidad de reacción. Control Negativo Negativo - Control Positivo Positivo Dudoso + 2 Negativo - 3 Negativo - 4 Dudoso + 5 Positivo ++ 6 Positivo ++ 7 Negativo - 8 Negativo - 40

42 9 Negativo - 10 Negativo - 11 Negativo - 12 Dudoso + 13 Positivo Positivo Negativo - 16 Negativo - 17 Negativo - 18 Negativo - 19 Dudoso + 20 Dudoso + 21 Negativo - 22 Positivo Positivo Negativo - 25 Negativo - 26 Negativo - 27 Negativo - 28 Negativo - 29 Negativo - 30 Negativo - 31 Negativo - 32 Negativo - 33 Negativo - 34 Negativo - 35 Negativo - 36 Negativo - 37 Negativo - 38 Negativo - 39 Positivo Negativo - 41 Negativo - 42 Negativo - 43 Positivo Negativo - 45 Negativo - 46 Dudoso + 47 Negativo - 48 Positivo ++ 41