Códigos de barras de ADN Tras las huellas de las especies

Transcripción

1 Códigos de barras de ADN Tras las huellas de las especies Mailyn A. González Compartimos el planeta Tierra con millones de especies de las cuales conocemos tan solo un porcentaje de los estimados existentes (v. figura 1). Ecosistemas emblemáticos como los bosques húmedos tropicales y los arrecifes de coral ilustran la coexistencia de centenares de especies en una pequeña superficie y el reto científico y técnico que constituye la caracterización de esta riqueza biológica (v. figura 2). El desconocimiento de parte de la biodiversidad que nos rodea va acompañado por la desaparición de especies como consecuencia directa e indirecta de las actividades humanas. En el 2010 se celebró el Año Internacional de la Biodiversidad, un evento que sirvió ante todo como un llamado de alerta para recordar que el impacto antrópico sobre todos los niveles de la biodiversidad es muy alto, los efectos de este sobre el bienestar humano, nefastos, y nuestra ignorancia frente a lo que nos rodea, aguda. Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd.: Nature Figura 1. Diversidad conocida y estimada en algunos grupos de animales. Las cifras arriba de cada grupo de organismos representa el número de especies conocidas mientras que las cifras de abajo corresponden al grupo estimado de especies. Fuente: Blaxter (2003), Molecular Systematics, counting angels with DNA, en Nature, 421: Universidad de los Andes, Facultad de Ciencias 51

2 Figura 2. El Bosque húmedo tropical y los arrecifes de coral son ecosistemas emblemáticos por su alta diversidad biológica. La riqueza biológica de estos sistemas representa desafíos técnicos y científicos para su identificación. Néstor Ardila Néstor Ardila Dentro de las prioridades del Convenio de Biodiversidad Biológica (CBD), del cual Colombia es signataria, tenemos el compromiso de acelerar el inventario de la biodiversidad y comprender mejor su funcionamiento con el fin de proponer planes de manejo acertados para su conservación. Sin embargo, teniendo en cuenta la inmensa diversidad que nos rodea, se ha hecho necesario replantear la aproximación metodológica que tenemos para acelerar la identificación de las especies y su descubrimiento. En general, la identificación de las especies se realiza a partir de atributos morfológicos diagnósticos como coloración, forma y tamaño, y en muchos casos esta identificación requiere la presencia de caracteres sexuales como flores y frutos en las plantas. A pesar de que la información morfológica es indiscutiblemente útil, tiene la desventaja de no poder ser utilizada en casos donde diferentes especies presentan una morfología similar, esto puede ocurrir en especies que se separaron recientemente y para las cuales no se han detectado aún diferencias morfológicas evidentes (v. figura 3). Asimismo, la identificación a partir de atributos morfológicos no permite encontrar la identidad de una especie en situaciones donde solo una parte de los atributos morfológicos está presente, como cuando se trabaja con estados de vida juveniles (ausencia de órganos reproductivos desarrollados) o a partir de fragmentos de tejido (como muestras de sangre, pieles, plumas, semillas, etc. [v. figura 4]). En estos casos la información genética codificada en el ADN puede servir de herramienta para la identificación. En efecto, cada organismo es único, si tomamos el conjunto de la información contenida en el ADN bajo la combinación de las bases nucleotídicas (A,C,T,G). Basados en la idea según la cual todas las especies de un grupo de organismos comparten una misma región genética, y que esta región presenta variaciones entre las especies, surge la iniciativa de los códigos de barra de ADN (CB-ADN), que propone el uso de una o varias regiones estándar del genoma como herramienta de identificación. Las regiones del genoma propuestas como CB-ADN corresponden a secuencias cortas, fáciles de obtener bajo protocolos estándar en el laboratorio y que presentan suficientes diferencias entre las especies. Esta iniciativa surge en el 2003, como una propuesta de Paul Hebert y colaboradores en la universidad de Guelph, Ontario, Canadá [1, 2]. Desde ese entonces un gran número de publicaciones ha demostrado la eficiencia de los CB-ADN en el estudio e inventario de la biodiversidad así como sus limitaciones. 52 Hipótesis, Apuntes científicos uniandinos, núm. 12, febrero del 2012

3 Figura 3. Especímenes del complejo de especies Automeris zugana presente en Guanacaste, Costa Rica. El uso de la secuencia COX1 como código de barras de ADN confirmó la presencia de especies crípticas en este grupo de organismos (arriba); imagen modificada de Janzen et ál Para que el CB-ADN funcione, es necesario disponer de un catálogo o librería molecular que reúne la(s) secuencia(s) de CB-ADN para cada especie. Esta librería molecular debe ser construida a partir de especímenes bien identificados y que abarquen el área de repartición geográfica de la especie [3]. Una vez se tiene la librería molecular de referencia, se puede buscar en ella una correspondencia con la especie a partir de cualquier fragmento de tejido desconocido (v. figura 5). En animales se utiliza como principal CB-ADN una porción del gen mitocondrial COX1; en plantas varias secuencias del cloroplasto y el núcleo son utilizadas [4, 5 6, 7]; mientras que en hongos no se ha llegado aún a un consenso en cuanto a la región CB-ADN más apropiada. Progresos y limitaciones del código de barras de ADN El desarrollo de códigos de barras de ADN creó grandes expectativas al proponer facilitar el levantamiento de inventarios de biodiversidad, el descubrimiento de especies crípticas y particularmente su aplicación en estudios ecológicos para los cuales la identificación de material biológico a partir de fragmentos o estados de vida juveniles es un impedimento mayor. Algunas de estas expectativas se han cumplido a pesar de que en el camino se ha reconocido la limitación de este método en ciertos grupos de organismos. A continuación algunos ejemplos. Figura 4. La identificación de especies a partir de fragmentos de tejidos como en el caso de hierbas medicinales o productos manufacturados puede resultar imposible. Asimismo la falta de caracteres morfológicos diagnósticos en los estados de vida juveniles dificulta la tarea de identificación biológica. Universidad de los Andes, Facultad de Ciencias 53

4 I. Espécimen de referencia II. Extracción y amplificación del código de barras de adn III. Secuenciación Buscar correspondencia siguiendo los pasos II y III Fragmentos que requieren identificación IV. Base de datos de referencia Figura 5. Proceso de identificación mediante el uso de código de barras de ADN. Es necesario generar una base de datos de referencia a partir de especímenes bien identificados y para el cual se tomarán datos de ubicación geográfica y notas de colecta. A partir de estos especímenes se realiza en laboratorio la extracción, amplificación y secuenciación del código de barras ADN. Una vez la base de referencia existe, es posible buscar en ella una correspondencia a partir de cualquier muestra de tejido. Uno de los proyectos más emblemáticos en los que se ha utilizado el CB-ADN es en el inventario de la biodiversidad de lepidópteros en la reserva forestal de Guanacaste, Costa Rica. En este lugar se viene realizando el estudio taxonómico y ecológico de estos organismos desde 1978 y a partir del 2003 se ha secuenciado de manera sistemática COX1, lo cual ha permitido al ensamblar la información molecular, taxonómica y ecológica el descubrimiento de un centenar de potenciales nuevas especies. Hasta el momento, la secuencia COX1 ha permitido identificar con éxito el 99% de las especies de lepidópteros estudiadas en esta zona. La adición de COX1 en este inventario ha permitido igualmente mejorar la correspondencia entre sexos, de formas juveniles y adultas [8]. De igual forma, COX1 ha sido aplicado en el levantamiento de inventario de las hormigas en Madagascar, que representa uno de los puntos con mayor biodiversidad del planeta y donde este grupo de organismos cuenta con no menos de 1000 especies de las cuales el 96% son endémicas y el 75% están aún por describir. Con una perspectiva más ecológica, el CB-ADN de plantas aplicado a las heces fecales de animales como el oso marrón del Himalaya (Ursus arctos) y la marmota dorada (Marmota caudata), presentes en Pakistan, permitió describir el régimen alimenticio de estos organismos [9]. Asimismo, un estudio de CB-ADN a partir del contenido estomacal de escarabajos del grupo Chrysomelinae en Australia, exploró la relación de especificidad alimenticia de estos insectos con sus huéspedes vegetales [10]. Un gran número de estudios ha implementado el CB-ADN en aves, lo cual ha resultado en la compilación de miles de secuencias de estos organismos alrededor del mundo. La disponibilidad de estas secuencias permitió a Kerr y colaboradores [5] realizar un estudio comparativo de la diversidad genética entre las aves de Norteamérica y Argentina, con el fin de estudiar los mecanismos evolutivos subyacentes a la diversidad regional del Neotrópico. El CB-ADN puede ser exitosamente utilizado como herramienta de control en el comercio de especies y manejo de plagas. Por ejemplo, Eaton y colaboradores [11] mostraron que COX1 permitía identificar 23 especies de reptiles y mamíferos que son comercializados de manera ilegal en Suramérica y África. El punto más interesante de este estudio es que la identificación de las especies se hizo a partir de bienes manufacturados como bolsos, correas y pieles, muestras que no hubiesen podido ser asignados a la especie con certeza a partir de atributos morfológicos. Siguiendo el mismo procedimiento, Baker y colaboradores [12] demostraron que la carne vendida como Sashimi en un 54 Hipótesis, Apuntes científicos uniandinos, núm. 12, febrero del 2012

5 restaurante de Los Ángeles, Estados Unidos, y en un restaurante en Seúl, Corea del Sur, correspondían a tres especies de ballena. La identificación de las especies de ballenas que se encuentran en la lista CITES (Convención sobre el comercio internacional de especies amenazadas de fauna y flora silvestre) que prohíbe el tráfico de especies amenazadas, puso a la luz un comercio ilegal proveniente de Japón y que condujo al cierre del restaurante en Estados Unidos [12]. En el mismo estudio, muestras que eran vendidas como carne de caballo, resultaron ser carne de res según los resultados del CB-ADN. La utilización de CB-ADN ha permitido igualmente, la detección temprana de especies no nativas con tendencia invasora, como es el caso de la detección del alga Gracilaria vermiculophylla en aguas canadienses durante un inventario molecular de macroalgas. Una de las mayores limitantes del CB-ADN es que se basa principalmente en el uso de secuencias heredadas de manera uniparental, lo cual proporciona tan solo una parte de la historia evolutiva de un organismo. Asimismo existen numerosos estudios que demuestran la incapacidad de las secuencias CB-ADN para diferenciar entre especies cercanas en su historia evolutiva como ciertos grupos de mariposas y plantas [13, 6]. Por último, se ha reportado que en ciertos grupos, como los artrópodos, la diversidad genética descrita por los CB-ADN puede estar sesgada por la acción de simbiontes como el microorganismo Wolbachia [14]. No obstante, a pesar de estas limitaciones inherentes a la biología de los organismos y a la aproximación metodológica del CB-ADN, esta herramienta es indiscutiblemente útil y exitosa en el estudio e inventario de la biodiversidad en general. Iniciativa de CB-ADN en Colombia y el mundo La iniciativa de los códigos de barras se ha desarrollado principalmente como un movimiento de colaboración internacional que hace pública la información generada y que viene siendo publicada principalmente en la base de datos BOLD (barcoding of life datasystems) [15]. Esta base de datos proporciona imágenes del espécimen, información referente a su área de distribución y la(s) secuencia(s) respectiva(s) de CB-ADN (v. figura 5). Con el fin de incrementar el número de especies referenciadas en esta librería molecular, se dio inicio en el 2010 al proyecto internacional ibol (International Barcode of Life), que espera producir en un período de cinco años, cinco millones de secuencias, correspondientes a especies de eucariotas ( El desarrollo de esta iniciativa fortalecerá el uso de CB-ADN como herramienta de identificación de especies. En América Latina, se destaca la participación de México, Argentina, Perú y Brasil en esta iniciativa internacional. Colombia, como país megadiverso puede verse altamente beneficiado por la aplicación de los códigos de barras de ADN como herramienta de identificación de su biodiversidad. No solo poseemos una impactante biodiversidad de la cual una parte está aún por descubrir, sino que además, debemos enfrentar problemáticas de gestión como el comercio ilegal de especies. El desarrollo de los códigos de barras requiere adelantar y homogeneizar procesos que lleven a la colecta y estudio taxonómico de especímenes, al mejoramiento de las colecciones biológicas, su conservación, al desarrollo de protocolos moleculares y al desarrollo tecnológico asociado a la obtención de secuencias así como al desarrollo de herramientas bioinformáticas para su análisis. En todas estas etapas el país podría verse beneficiado si une esfuerzos entre entidades académicas, administrativas, públicas y privadas, y propone una plataforma nacional para acelerar, coordinar e integrar la información generada a partir del proyecto CB-ADN sobre la biodiversidad nacional. Esta iniciativa interinstitucional está en marcha y espera consolidarse en el corriente de este año Universidad de los Andes, Facultad de Ciencias 55

6 Referencias [1] Hebert, P. D. N. et ál. (2003), Biological identifications through DNA barcodes, en Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 270 (1512): [2] Hebert, P. D. N.; Ratnasingham, S. & De Waard, J. R. (2003) Barcoding animal life: cytochrome C oxidase subunit 1 divergences among closely related species, en Proc. R. Soc. Lon. Ser. B. Biol. Sci, 270 (Suppl 1): S96-S99. [3] Moritz, C. & Cicero, C. (2004), DNA Barcoding. Promise and Pitfalls, en PLoS Biol., 2(10): e354. [4] Taberlet, P. et ál. (2007), Power and limitations of the chloroplast trnl (UAA) intron for plant DNA barcoding, en Nucl. Acids. Res. 35(3): e14-e14. [5] Kerr, K. C. R. et ál. (2009), Probing evolutionary patterns in Neotropical birds through DNA barcodes, en PloS One, 4(2): e4379. [6] González M. A. et ál. (2009), Identification of Amazonian Trees with DNA Barcodes, en PloS One, 4(10): e7483. [7] Yao, H. et ál. (2010) Use of ITS2 Region as the Universal DNA Barcode for Plants and Animals en PloS One, 5(10): e [8] Janzen, D. H. et ál. (2005), Wedding biodiversity inventory of a large and complex Lepidoptera fauna with DNA barcoding, en Phil. Trans. R. Soc. B., 360: [9] Valentini, A.; Pompanon, F. & Taberlet, P. (2008), DNA barcoding for ecologists, en Trends Ecol. Evol., 24(2): [10] Jurado-Rivera, J. A. et ál. (2009), DNA barcoding insect-host plant associations, en Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 276 (1657): [11] Eaton, M. et ál. (2010), Barcoding bushmeat. Molecular identification of Central African and South American harvested vertebrates, en Conserv. Genet., 11(4): [12] Baker, C. S. et ál. (2010), Genetic evidence of illegal trade in protected whales links Japan with the US and South Korea, en Biology Letters, doi: /rsbl [13] Elias, M. et ál. (2007), Limited performance of DNA barcoding in a diverse community of tropical butterflies, en Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 274(1627): [14] Hurst, G. D. D. & Jiggins, F. M. (2005), Problems with mitochondrial DNA as a marker in population, phylogeographic and phylogenetic studies. The efects of inherited symbionts, en Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 272: [15] Ratnasingham, S. & Hebert, P. B. (2007), The barcode of life datasystem, en Molecular Ecology Notes ( 7: Reseña de la autora Mailyn A. González Profesora visitante, posdoctorado, Laboratorio de Botánica & Sistématica, Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de los Andes. Pregrado en Biología: Universidad de Lausanne, Suiza. Maestría en Biología de Poblaciones: Universidad de Lausanne, Suiza. Doctorado en Ecología, Evolución y Biodiversidad: Universidad Paul Sabatier, Toulouse, Francia. 56 Hipótesis, Apuntes científicos uniandinos, núm. 12, febrero del 2012